Abstract
As proteínas da exibição família IQGAP complicado e atividades, muitas vezes contraditórias em tumorigênese. IQGAP1 foi bem documentada potencial oncogénico e IQGAP2 tem a função de tumor-supressor putativo. IQGAP3 é a mais recente adição a esta família e seu papel no desenvolvimento do câncer continua por definir. Aqui demonstramos expressão IQGAP3 está significativamente aumentada em tecidos de câncer de pulmão em ambos os níveis de proteína mRNA e. Superexpressão de IQGAP3 promoveu o crescimento de células tumorais, e migração e invasão, enquanto knockdown de IQGAP3 exibiu efeitos opostos. Além disso, a supressão de IQGAP3 numa linha celular de cancro do pulmão causou uma redução na tumorigenicidade destas células no tecido de pulmão após injecção intravenosa. Além disso, mostrámos que IQGAP3 é capaz de interagir com a ERK1 e melhorar a sua fosforilação após o tratamento com o EGF. Estes dados sugerem que IQGAP3 pode contribuir para a patogênese do câncer de pulmão através da modulação de sinalização EGFR-ERK
Citation:. Yang Y, Zhao W, Xu QW, Wang XS, Zhang Y, Zhang J (2014) IQGAP3 Promove EGFR-ERK sinalização e de Crescimento e metástase de células do cancro do pulmão. PLoS ONE 9 (5): e97578. doi: 10.1371 /journal.pone.0097578
editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 20 de fevereiro de 2014; Aceito: 21 de abril de 2014; Publicado em: 21 de maio de 2014
Direitos de autor: © 2014 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho recebeu o apoio do Programa Nacional de Pesquisa básica da China (2011CB946103), Nacional de Ciências naturais da Fundação da China (31.330.025 e 30.830.091), Pequim Municipal Natural Science Foundation (7.122.104) e a 111 Projeto de China (B07001). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O cancro do pulmão ocupa o primeiro lugar na mortalidade por câncer relacionado tanto na China e em todo o mundo [1], [2]. Na China, há cerca de 300.000 novos casos de câncer de pulmão e mais de 250.000 mortes por esta doença a cada ano [3]. Histologicamente, tantos como 85% dos cancros do pulmão são o cancro do pulmão de células tipo não-pequenas (NSCLC), e a maioria deles são ou adenocarcinoma ou carcinoma de células escamosas [4] – [7]. Como o câncer de pulmão pode ser oculto, a maioria dos pacientes são inoperáveis e têm metástases para linfonodos regionais ou para locais distantes no momento do diagnóstico. Os pacientes com NSCLC com metástases distantes sobreviver por um curto período de tempo (de 9 a 12 meses) [5], [8]. Há, portanto, uma necessidade urgente para desvendar os mecanismos moleculares que levam à invasão e metástase no câncer de pulmão [9], [10]. Essa informação vai facilitar o desenvolvimento de novas terapias que permitam a melhoria dos resultados em pacientes com câncer de pulmão [11], [12].
As abordagens terapêuticas contra EGF ou EGFR representam uma direção promissora para o tratamento do cancro do pulmão [13], [14]. O EGFR é expressa em células normais de epidérmicas, mesenquimais e origem neurogénica, e a sua activação é rigorosamente controlada em tecidos normais [15], [16]. No entanto, a ligação de EGFR pelos seus resultados de ligandos em homo ou heterodimerização do receptor e activação da sua actividade de tirosina-quinase intrínseca [17]. A cascata de sinalização a jusante é assim iniciado, levando a mudanças em tais comportamentos celulares como a proliferação, migração e diferenciação [15], [16]. Importante, a activação constitutiva do EGFR ou de sinalização de EGF reforçada é frequentemente encontrada em diferentes tipos de cancros, especialmente do cancro do pulmão, onde está associada com a iniciação do cancro, crescimento do tumor /progressão, metástase e prognóstico pobre [17] – [20].
a família IQGAP de proteínas é bem conservada em organismos de levedura a mamíferos [21]. É composto por três membros, IQGAP1, IQGAP2 e IQGAP3 [22] – [24]. Entre estes, IQGAP1 é a melhor estudada [25]. O IQGAP nome é derivado a partir dos vários domínios funcionais destas moléculas abrigam tais como quatro motivos de QI e um domínio relacionado com o RasGAP (DRG) [26], [27]. IQGAP1 também contém domínios homodimerização de bobina da bobina putativos, um motivo triptofano repetição (WW) de função desconhecida, um domínio calponina-homologia (CHD) que interage com a F-actina, e um RasGAP_C-terminal (RGCt) que interage com várias proteínas incluindo e-caderina e β-catenina [27]. IQGAP1 tem sido sugerido para funcionar na regulação do citoesqueleto e a migração de células [28] – [30]. Há também evidências que indicam IQGAP1 desempenha um papel na progressão do cancro [31], [32]. Em contraste, IQGAP2 parece actuar como um supressor de tumores [33]. IQGAP3 é a mais recente adição a esta família [24]. Dados actualmente disponíveis indicam que está envolvida na proliferação de células epiteliais [34], [35], no entanto o seu papel na tumorigénese permanece a ser determinada. No estudo atual, nós fornecemos a primeira evidência de que IQGAP3 promove o crescimento e metástase de câncer de pulmão, melhorando a sinalização ERK mediada por EGFR. IQGAP3 podem, portanto, desempenhar um papel semelhante ao de IQGAP1 na tumorigênese.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade de Pequim Ciências da Saúde center (Pequim, China) eo Hospital 306 do Exército de Libertação Popular da China (Pequim, China). Para estudos com animais, todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento e quando o sofrimento observado foi muito grande, foi utilizada a eutanásia humanitária. consentimento escrito foi obtido a partir de pacientes individuais para a utilização de amostras de tecido.
linhas celulares e espécimes de pacientes com
A549 e células HeLa foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino a 10% (Life Technologies , Carlsbad, CA, EUA). células HEK293T foram cultivadas em meio DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10%. As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO
2 atmosfera.
Para ensaios de sinalização celular, as células foram privadas de soro (0,5% de soro fetal de bovino) durante 16 h antes da estimulação com 100 ng /ml EGF (Peprotech, Rockville, NJ, EUA) para diferentes comprimentos de tempo, conforme indicado.
25 tecido do tumor de pulmão pareado e amostras de tecidos normais adjacentes foram obtidos do Hospital 306 do Exército de Libertação Popular da China.
Plasmids e transfecção
Myc-pCAGGS-IQGAP3 pCAGGS controlo e vetores foram gentilmente cedidas pelo Dr. Kozo Kaibuchi. Marcada com HA ERK1 ou vectores expressando ERK2 foram construídos por técnicas de biologia molecular padrão e verificada por sequenciação.
As células foram transfectadas com jetPRIME reagente de transfecção (Polyplus transfecção, Illkirch, França).
siARN e Transfecção Infecção Lentivirus
Pequenos oligonucleotídeos de RNA interferente (oligos) contra IQGAP3 ou controlar oligonucleotídeos siRNA foram obtidos a partir GenePharma Co., Ltd (Xangai, China). As sequências de direccionamento destes ARNic eram como se segue: Si IQGAP3-1:5′- GAGCCAACCAGGACACUAA-3 ‘; Si IQGAP3-2:5’- GGCAGAAACUAGAAGCAUA-3 ‘; controle de siRNA: 5’UUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ‘. oligos siRNA (50 nM) foram transfectados em células A549 com reagente de transfecção jetPRIME.
Como alternativa, a sequência alvo ARNsi foi clonado no vector lentiviral pLL3.7. Após verificação da sequência, o plasmídeo de empacotamento e vectores shRNA psPAX2 e PLP /VSVG foram transfectados para a linha celular de empacotamento HEK293T usando jetPRIME. O meio foi trocado a 8 h após a transfecção. 48 horas mais tarde, o sobrenadante virai foi colhido e incubado com a linha de células A549 na presença de 8 ug /ml de polibreno (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Para a selecção de linhas de células transfectadas de forma estável, a GFP de fluorescência foi usada como um marcador de triagem. As células com . Foram usados 75% de eficiência de infecção para análise posterior
Transcriptase Reversa-PCR e PCR em tempo real
TRIzol (Life Technologies) foi usado para isolar o ARN total e, em seguida, a transcrição reversa em cDNA por transcrição reversa do sistema (Promega, Madison, WI, EUA). em tempo real quantitativa de PCR foi realizada em um sistema Bio-Rad PCR em Tempo Real. As sequências dos iniciadores em tempo real para IQGAP3 foram como se segue: para a frente, 5′-GTTCATCCATAGAGCCTGCCA-3 ‘; reverso, 5’-GCGATGCTCTCACCAATAAGG-3 ‘. Os iniciadores em tempo real para GAPDH foram descritos antes [36]. A expressão de genes foi quantificada como o rendimento de IQGAP3 em relação à de GAPDH.
construções de HA-ERK2
Imunoprecipitação e Análise de Western Blot
Myc e HA-IQGAP3-ERK1 ou foram transfectados em células HEK293T. As células foram colhidas e lisadas em tampão de lise com um cocktail inibidor de proteinase (Roche, Basileia, Suíça) e fluoreto de fenilmetilsulfonilo. Em seguida, os lisados celulares foram incubados com murganho anti-HA mAb (Sigma-Aldrich), anti-myc mAb (Sigma-Aldrich) ou um anticorpo de controlo (mIgG) (Sigma-Aldrich) e de proteína A Sepharose (GE Healthcare, EUA) e resolvidas por SDS-PAGE. Para imunoprecipitação endógena, ligado de células foi preparado a partir de células A549 e imunoprecipitados com anticorpo de coelho anti-ERK1 mAb (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA).
Para a análise de Western Blot, quantidades iguais de proteína de cada amostra foi carregada e resolvida com SDS-PAGE e transferidos para blots. Após o bloqueio, as manchas foram sondadas com anticorpos indicados e avaliados com o Imaging System Odyssey (LICOR Bioscience, Lincoln, NE, EUA). Os anticorpos utilizados foram anti-GAPDH (Tecnologia Bioworld, Inc., St. Louis Park, MN, EUA), anti-IQGAP3 (Sigma-Aldrich), anti-ERK (Cell Signaling, Beverly, MA, EUA), anti-fosfo-Erk
Thr202 /Tyr204 (Cell Signaling), anti-fosfo-p38
Thr180 /Tyr182 (Cell Signaling), anti-fosfo-Akt
Ser473 (Cell Signaling), anti-Myc e anti-HA.
imunohistoquímica e
Um pulmão tissue microarray do cancro (TMA) foi comprado de Chaoying Biotecnologia Co. (Xi’an, China). As secções foram incubadas com anticorpo anti-IQGAP3 (diluição 1:50) durante a noite a 4 ° C. O anticorpo primário foi identificada usando um polímero de enzima peroxidase de rábano-rotulados conjugada com anticorpo de cabra anti-ratinho secundário (Promega). As secções coradas foram examinadas e avaliadas por um patologista. O controlo negativo foi tecido pulmonar humano normal.
Ensaio de Proliferação Celular
As células foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 3 x 10
3 células /poço. A proliferação celular foi avaliada a cada 24 h utilizando o Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Japão). Cada experiência foi realizada em triplicado.
A migração celular e invasão Ensaio
Os ensaios de migração foram efectuados num tamanho de 24 poços de quimiotaxia câmara (8-poro, Corning Life Sciences, Corning, NY, EUA) revestidas com 10 ug /ml de fibronectina (Sigma-Aldrich). As células (3~5 × 10
4 células /poço) em 200 ul de meio RPMI 1640 isento de soro foram semeadas para dentro da câmara superior. Em seguida, 600 ul de meio RPMI 1640 com 10% de soro fetal de bovino ou 100 ng de EGF humano /ml foram adicionadas para dentro da câmara inferior. As células na câmara superior foram removidas utilizando um cotonete após 20 h de incubação a 37 ° C e 5% de CO
2. As células presas na parte inferior das membranas foram fixadas com metanol e coradas por violeta cristal. O grau de migração foi expressa como o número médio de células em seis campos × 10.
ensaios de invasão celular foram realizadas essencialmente da mesma maneira que o ensaio de migração, excepto que a câmara superior foi coberta com 30 ul Matrigel (0,5 mg /ml; BD Biosciences). As experiências foram realizadas em triplicado.
Luciferase Reporter Assay
A actividade transcricional Elk-1 foram medidos com a luciferase dupla Reporter Assay System (Promega). IQGAP3 siRNA ou NC siARN foi co-transfectado em células A549 com os plasmídeos pFR-Luc (plasmídeo repórter), pFA2-Elk-1 (plasmídeo transactivador) ou pRL-TK. Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram privadas de soro-durante 16 h, em seguida estimuladas com ou sem EGF 100 ng /ml durante 6 h. As células foram colhidas e lisadas. Todos os ensaios de repórter foram repetidas pelo menos três vezes em triplicado. Luciferase do pirilampo e a luciferase de Renilla actividade foi medida com um luminómetro Centro LB960 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Alemanha). a actividade da luciferase de pirilampo foi calculada e normalizados com base na actividade da luciferase de Renilla. A actividade da luciferase em células transfectadas com siRNA controle sem estimulação EGF foi definido como 1.
Tumor Análise Metástase
in vivo
NOD /SCID foram adquiridos de Vital Rio de Animais de Laboratório Technology Co. Ltd (Pequim, China). Os ratos foram levantadas em uma instalação livre de patógenos na Peking University Health Center Science (Pequim, China).
As células A549 foram infectadas com shRNA controle ou shIQGAP3 lentivírus. As células (1,5 x 10
6) em 0,1 ml de PBS foram injectadas na veia da cauda de ratinhos NOD 6 semanas de idade /SCID. Seis semanas após a infecção, os ratinhos foram sacrificados por deslocamento cervical. Em seguida, os pulmões foram retirados, pesados, fotografada, e fixados em formalina a 4%. As secções de tecido foram também corados com hematoxilina-eosina (H E). para avaliação histológica
Análise Estatística
A análise estatística foi realizada usando SPSS, versão 13.0 (SPSS, Inc.). O teste t de Student foi utilizado para comparar a proliferação celular, migração e invasão entre dois grupos independentes. O teste do qui-quadrado foi realizado para determinar as diferenças de idade, sexo, estágio do tumor do paciente e histologia entre grupos com expressão IQGAP3 maior, igual ou menor no tumor contra tecidos não cancerosos adjacentes.
P
valores 0,05 foram considerados estatisticamente significativos
Resultados
IQGAP3 expressão é regulada positivamente em tecido de cancro do pulmão
A potencial papel na tumorigénese foi o primeiro. sugerido para IQGAP3 por análises de expressão de bioinformática IQGAP3 em tecido tumoral. ECgene (https://genome.ewha.ac.kr/ECgene/) apresentaram níveis elevados de IQGAP3 numa variedade de tecidos de tumor ou células de origem em ovário, pulmão, intestino grosso, estômago, medula óssea e da mama (Figura 1A ). RT-PCR foi subsequentemente realizada para verificar estes dados. Enquanto expressão IQGAP3 em tecidos normais foi restrita ao cólon, intestino delgado e testículo, foram observados níveis elevados de ARNm IQGAP3 num certo número de tumores, incluindo cancro do pulmão, carcinoma hepatocelular, cancro renal, cancro gástrico, cancro da bexiga, cancro do cólon e leucemia ( dados não mostrados). Além disso, vimos produção de auto-anticorpos contra IQGAP3 em uma fração significativa de pacientes com cancro do pulmão IQGAP3-positivos [37]. Isto levou-nos prosseguir o inquérito sobre a atividade desta molécula no desenvolvimento do câncer de pulmão. IQGAP3 foi regulada ao nível do mRNA em tecidos de cancro do pulmão de 20, em comparação com tecidos não-cancerosas adjacentes em 25 amostras emparelhadas por análise em tempo real de PCR (Figura 1B). A seguir, analisou a expressão da proteína IQGAP3 em uma matriz de tecido contendo 89 pares de tecidos de câncer de pulmão. Os níveis elevados de proteína IQGAP3 foram observados em 80 tecidos de cancro (Figura 1c e Tabela S1). De nota, a análise estatística mostrou que não houve correlação significativa entre upregulation proteína IQGAP3 e parâmetros como a idade, sexo ou grau histológico (Tabela S1).
análise de expressão (A) EST do gene IQGAP3 em normal e tecidos cancerosos com base no banco de dados ECgene. (B) Quantitative PCR em tempo real para a expressão IQGAP3 em 25 pares de cancro do pulmão contra tecidos não-cancerosas adjacentes. expressão IQGAP3 foi normalizado contra a GAPDH. Níveis relativos foram calculados para cada amostra, e um valor de 1 foi designado para o tecido não canceroso adjacente do paciente 13. As experiências foram repetidas em triplicado. Os dados de uma experiência representativa são apresentados como média ± DP. (C) A análise imunohistoquímica da expressão da proteína IQGAP3 no cancro do pulmão contra tecidos não cancerosos adjacentes. Imagens representativas são mostradas para um carcinoma de células escamosas e um adenocarcinoma. Ca, tecido de câncer; Adj, tecidos não cancerosos adjacentes. Ampliação, × 200.
Alteração de IQGAP3 Expressão Modula o Crescimento, migração e invasão das células tumorais
Para investigar a conseqüência funcional de expressão IQGAP3 regulada no cancro, nós monitoramos mudanças no comportamento celular após alteração do seu nível de expressão em linhas celulares de cancro. IQGAP3 foi sobre-expresso em células HeLa em primeiro lugar, que tiveram um nível relativamente baixo de expressão IQGAP3 endógena. A sobre-expressão de IQGAP3 promoveu a proliferação celular nestas células (Figura 2A). Além disso, aplicada expressão de IQGAP3 resultou na migração celular e invasão aumentada (Figura 2B, C).
vectores Myc-IQGAP3 ou de controlo foram transfectados em células HeLa e em seguida as células foram colhidas às 24 h após a transfecção para a migração e ensaio de invasão. As células para ensaio de proliferação foi colhida no ponto de tempo indicado. a expressão da proteína (A) IQGAP3 de transfectantes foi verificada por Western blotting. A proliferação celular foi ensaiada utilizando o kit de contagem de células-8. Os ensaios (B, C) migração e invasão celular foram realizadas utilizando câmaras de quimiotaxia com ou sem revestimento com Matrigel. Cada ensaio foi repetido, pelo menos, 3 vezes. Os dados de uma experiência representativa são apresentados como média ± DP. *,
P Art 0,05; ***,
P
. 0,001
Para melhor avaliar os efeitos da IQGAP3 sobre o crescimento de células de câncer e migração, expressão IQGAP3 foi derrubado na linha de células A549 câncer de pulmão , que tinha um nível relativamente elevado de expressão de IQGAP3 endógena. Duas construções de direccionamento shRNA foram usadas sequências IQGAP3 diferentes, ambas as quais conduziram a regulação negativa eficiente de IQGAP3 em comparação com os controlos não específicas (Figura 3A). Como antecipado, knockdown de IQGAP3 suprimiu a proliferação de células A549 (Figura 3B). Além disso, a expressão reduzida IQGAP3 também foi acompanhada pela diminuição da migração e invasão de células A549 (Figura 3C e D). É bem conhecido que a sinalização do EGFR é criticamente envolvido no desenvolvimento do cancro do pulmão. Por isso, ainda testado se a expressão IQGAP3 pode modular a sensibilidade das células à EGF estímulo. Como mostrado nas Figuras 3E e F, knockdown de IQGAP3 causou a inibição da migração celular e invasão semelhante à induzida por EGF. Tomados em conjunto, estes dados sugerem IQGAP3 tem potencial oncogénico.
As células A549 foram transfectadas com shRNA construções para knockdown expressão IQGAP3 endógeno. Os níveis de proteína (A) IQGAP3 após a infecção com o controle (NC) ou duas lentivírus shIQGAP3 diferentes (KD1 e KD2). (B) A proliferação foi analisada utilizando o Cell Counting Kit-8 por células A549 infectadas com lentivírus. (C, E) de migração de células A549 infectadas com lentivírus no ensaio de câmara de quimiotaxia na ausência (C) ou na presença (E) de EGF humano (100 ng /ml). (D, F) a invasão de células A549 infectadas com lentivírus através de Matrigel na ausência (D) ou na presença (F) de EGF humano. Cada ensaio foi repetido, pelo menos, 3 vezes. Os dados de uma experiência representativa são apresentados como média ± DP. *,
P Art 0,05; **,
P Art 0,01; ***,
P
. 0,001
Knockdown de IQGAP3 suprimida Lung Cancer Metástase
Tendo em conta o impacto potente de expressão IQGAP3 sobre a proliferação e migração de células cancerosas cultivadas
in vitro
, nós próxima procuraram determinar se ele também afetada tumorigênese
in vivo
utilizando um modelo estabelecido de câncer de pulmão metastático [38], [39]. As células A549 que abrigam um vector lentiviral expressando shRNA específica-IQGAP3 foram injectados na veia da cauda de ratinhos NOD /SCID. Os animais foram sacrificados no dia 42 e os pulmões foram removidos e avaliados. Em comparação com os controles simulados, as células knockdown IQGAP3 parecia ser menos tumorigénico
in vivo
, como sugerido pelo volume bastante reduzido e peso dos pulmões afetados (Figura 4A, B). coloração imuno-histoquímica revelou que a estrutura do pulmão relativamente normal foi mantida nos grupos knockdown IQGAP3, ao mesmo tempo que foi quase completamente destruído pelos múltiplos nódulos tumorais no controlo simulado (Figura 4C). Tomando os
in vitro
dados relacionados em consideração, o potencial tumorigénico reduzido de células knockdown IQGAP3
in vivo
pode resultar tanto colonização deficiente ou a proliferação ou ambos.
NOD /ratinhos SCID receberam uma injecção intravenosa de 1,5 × 10
6 células A549 transfectadas estavelmente com shIQGAP3 (IQGAP3-KD2) ou vectores de controlo (NC), e foram sacrificados no dia 42 após a inoculação do tumor (n = 7 para cada grupo). (A) a aparência bruta dos tecidos pulmonares. peso (B) pulmonar. As barras horizontais e de erro mostram o peso médio e o desvio padrão. (C) H E de coloração de tecidos pulmonares. Quatro campos representativos (2 para cada grupo) são mostrados. Ampliação, × 40. **,
P
. 0,01
Interage IQGAP3 com ERK1
Como previsto por Scansite (https://scansite.mit.edu/), IQGAP3 contém vários domínios ERK D, que são conhecidos para mediar a interacção com os membros da família ERK. Para explorar esta possibilidade, células HEK293T transfectadas com construções de HA-ERK2 Myc e HA-IQGAP3-ERK1 ou. O lisado celular foi preparado e imunoprecipitadas com anticorpos anti-myc anti-HA ou. O precipitado resultante foi reciprocamente detectado com anti-Myc ou anti-HA. Foi de particular interesse que a imunoprecipitação de IQGAP3 foi observada com ERK1, ERK2, mas não com (Figura 5A). Além disso, buscou-se determinar se uma interacção semelhante ocorre entre as proteínas expressas endogenamente. O lisado celular a partir de células A549 foi imunoprecipitada com coelho mAb anti-ERK1 e IQGAP3 foi de facto detectado no precipitado com anticorpo anti-IQGAP3 (Figura 5B). Estes resultados indicam que podem interagir com IQGAP3 ERK1, quer directa ou indirectamente através de um complexo maior.
(A) Myc e HA-IQGAP3-ERK1 ou construções de HA-ERK2 foram transfectados em células HEK293T. O lisado celular foi preparado e imunoprecipitadas com anti-HA de rato mAb, anti-Myc ou o mAb de controlo de anticorpos (mIgG). O precipitado resultante, em conjunto com o lisado não transformados (de entrada) foi resolvida em SDS-PAGE, transferidos para manchas e sondadas com anti-Myc e anti-HA. (B) Interacção de IQGAP3 com ERK1 também foi examinado em células A549 com as proteínas expressas endogenamente. O lisado celular foi preparado a partir de células A549 e imunoprecipitadas com ERK1 coelho anti-mAb. A presença de IQGAP3 no precipitado foi avaliada anticorpos anti-IQGAP3. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes e os resultados de uma experiência representativa são mostrados.
IQGAP3 Promove EGF Induced ERK fosforilação
A interação entre IQGAP3 e ERK1 solicitado uma investigação mais aprofundada sobre a influência de IQGAP3 sobre a activação de ERK e de sinalização. A sobre-expressão de IQGAP3 em células HeLa teve um efeito mínimo sobre a fosforilação de ERK, em contraste com o que foi relatado para IQGAP1 [40]. Quando estimulada com EGF, no entanto, os transfectantes IQGAP3 demonstraram fosforilação de ERK grandemente aumentada em comparação com o controlo simulado (Figura 6A). AKT e activação de p38 por outro lado não se alterou (dados não apresentados). Consistente com estes resultados, knockdown de expressão em células A549 IQGAP3 resultou na atenuação de fosforilação de ERK induzida por EGF, enquanto que a AKT e fosforilação de p38 não foi afectada (Figura 6B). Além disso, os ensaios de repórter de luciferase dupla mostrou que knockdown de IQGAP3 inibe a actividade de transcrição de Elk1 que é uma característica da activação de ERK em células A549 estimuladas EGF (Figura 6c). Para avaliar a correlação potencial entre a sinalização ERK melhorada e acelerada proliferação de células IQGAP3-transfectadas, U0126, que é um /inibidor de MEK1 2 foi adicionado à cultura. Como mostrado na Figura 6D, a inibição da activação de ERK aboliu o efeito de promoção da proliferação de IQGAP3. Estes resultados suportam o conceito de que a atividade oncogénica de IQGAP3 é provavelmente mediado pela sinalização ERK reforçada.
células (A) Hela transitoriamente transfectadas com vector de controlo Myc-IQGAP3 ou (simulada) foram privadas de soro (soro fetal bovino 0,5% ) durante 24 h antes de serem estimuladas com 100 ng /ml de EGF. As células foram colhidas em diferentes pontos de tempo e analisado para a fosforilação de ERK. (B) As células A549 foram infectadas com lentivírus shIQGAP3 (IQGAP3-KD1 ou KD2) ou vírus de controlo (NC) e (0,5% de soro bovino fetal) privadas de soro, antes da estimulação com 100 ng /ml de EGF. Os níveis de ERK fosforilada, ERK total, a p38 fosforilada e AKT fosforilado foram avaliadas com western blot em diferentes pontos de tempo após a estimulação EGF. (C) Ensaios repórter de luciferase foram realizadas para medir a actividade Elk1 jusante da cascata de sinalização de EGFR-ERK em células A549 transf ectadas com os oligos de ARNip. (D) A proliferação de células Hela abrigando vectores que expressam IQGAP3 ou de controlo foi ensaiada utilizando a contagem celular Kit-8 com a adição de 20 uM U0126 ou DMSO. Cada ensaio foi repetido, pelo menos, 3 vezes. Os dados de uma experiência representativa são apresentados como média ± DP. *,
P Art 0,05; **,
P Art 0,01
Discussão
Até o momento, três membros da família IQGAP foram descritos [22] – [24].. Há evidências de que IQGAP1 principalmente funciona como um oncogene [27]. IQGAP2 exibe actividade anti-tumor, apesar da sua semelhança estrutural com IQGAP1 [33]. Aqui demonstramos que IQGAP3 é altamente expresso numa grande parte das amostras de cancro do pulmão. Embora a expressão forçada de IQGAP3 provoca a proliferação e migração acelerada /invasão de células cancerosas, a supressão da sua expressão conduz a uma diminuição do potencial tumorigénico. Ao nível molecular, IQGAP3 interage com a ERK1 e promove a activação induzida por EGF de ERK, a qual por sua vez parece estar intimamente associada com a sua actividade de promoção do tumor.
IQGAP3 está localizado na 1q21.3, que é um hotspot para amplificação do gene no câncer [24]. A amplificação de ADN em 1q21.3 tem sido relatado, por exemplo, para ser ligada com carcinoma gastroesofágico e carcinoma ductal infiltrante da mama [41], [42]. Além disso, os ganhos em 1q21.3 tem uma correlação significativa com a redução do tempo de sobrevida global em leiomiossarcoma do útero [43]. A análise mostra que Bioinformatics IQGAP3 é regulada positivamente em vários tipos de cancros, incluindo os do ovário, pulmão, intestino grosso, estômago, medula óssea e malignidades da mama (Figura 1A). O presente estudo abordou especificamente o seu papel no câncer de pulmão. Entre 25 pares de cancro do pulmão e tecidos não-cancerosas adjacentes, 20 tecidos de cancro mostrou um aumento em ARNm IQGAP3. Upregulation de expressão IQGAP3 foi confirmada ao nível da proteína pela exibição de coloração imuno-histoquímica forte em câncer do que em tecidos não cancerosos em 80 de 89 amostras de câncer de pulmão. Especulamos que IQGAP3 pode representar um gene importante que está criticamente envolvida em doenças malignas caracterizadas por amplificação 1q21.3. Seria interessante determinar se a amplificação 1q21.3 contribui para a regulação positiva de IQGAP3 que é encontrado no cancro do pulmão, e se a amplificação 1q21.3 observada em carcinomas gastroesofágico ou cancro da mama está associada com a expressão aumentada IQGAP3. Embora em nosso estudo, demonstramos que upreguation de IQGAP3 é um evento comum no cancro do pulmão, devemos mencionar que existem algumas amostras de câncer de pulmão que mostram inalterada ou mesmo diminuição da expressão de IQGAP3. Isto não é surpreendente. Por exemplo, Her2, o oncogene representando no câncer de mama, só é regulada no cancro da mama cerca de 20% [44], [45]. Alguns genes, tais como p16, que podem ser regulados positivamente ou regulados negativamente em tumores e actuar tanto como um supressor de tumor ou um oncogene, dependendo do contexto do corpo [46]. Portanto, se o padrão de expressão diferente de IQGAP3 sugere uma regulação mais confundem e função do IQGAP3 no desenvolvimento do tumor necessita de mais estudos.
A desregulação da expressão de IQGAP3 no tecido de câncer sugere um papel potencial para esta molécula na tumorigênese. Consistente com este conceito, a superexpressão de IQGAP3 reforçada crescimento de células tumorais, migração e invasão, enquanto knockdown de expressão IQGAP3 exibido efeitos opostos. IQGAP3 é, por conseguinte, funcionalmente semelhante ao IQGAP1, que é conhecido por ter potencial oncogénico [31], [32]. Como outros membros da família IQGAP, IQGAP3 possui motivos estruturais que se pode ligar de ERK. Por coimmunoprecipitation recíproca, que confirmou a interação entre IQGAP3 e ERK1. A importância funcional desta interacção é suportada pela fosforilação aumentada de ERK e um aumento da actividade transcricional Elk1 por estimulação EGF em células IQGAP3-transfectadas. Mais importante, o efeito de promoção da proliferação foi quase completamente abolido pela U0126 inibidor de sinalização de ERK, indicando que IQGAP3 exerce a sua função principalmente pela regulação da sinalização de ERK. É interessante notar que, apesar de sua similaridade funcional, IQGAP3 e IQGAP1 exibir distintamente diferentes especificidades para os parceiros de ligação. Enquanto IQGAP1 liga-se principalmente para a ERK2, IQGAP3 interage exclusivamente com ERK1 [40]. O significado de tal selectividade permanece por determinar, no entanto, especula-se que IQGAP1 e IQGAP3 podem cooperar na regulação da sinalização ERK, exercendo assim um efeito sinergético na progressão do tumor.
inoculação intravenosa de ratos sem pêlo tem sido amplamente utilizada para avaliar o potencial metastático de células de câncer [38], [39]. Usando esse modelo, knockdown de IQGAP3 em células de câncer de pulmão foi encontrado para prejudicar consideravelmente a sua capacidade de gerar lesões metastáticas no pulmão. Este resultado é consistente com a nossa
in vitro
de dados que mostra a migração celular alterada e invasão após a manipulação de expressão IQGAP3. No entanto, os detalhes específicos destes mecanismos não são claras. A microscopia confocal revelou que IQGAP3 é enriquecido na vanguarda de células (Figura S1) a migração, sugerindo o seu possível envolvimento na formação de bordos de ataque. Além disso, a expressão do gene de perfis mostrou um aumento do nível de E-caderina nas células knockdown IQGAP3 (Figura S2). É bem reconhecido que a E-caderina é muito importante para a adesão celular. Regulação negativa de que, juntamente com seu complexo catenina associado é concomitante com reduzida adesão intercelular e aumento da capacidade invasiva [47], [48]. Como tal, IQGAP3 pode facilitar a migração e invasão celular em parte através da supressão da expressão da caderina-E.
Em resumo, os nossos estudos revelam pela primeira vez que o envolvimento de IQGAP3 no desenvolvimento do câncer de pulmão e os mecanismos moleculares subjacentes ao seu potencial actividade promotora de tumor. Estes achados expandir o nosso conhecimento do papel complicada da família IQGAP na tumorigénese. Além disso inquérito sobre o potencial dessas moléculas como alvos de invenção terapêutica é garantido.
Informações de Suporte
Figura S1.
IQGAP3 foi enriquecido na vanguarda de células que migram. As células A549 foram colocadas na tampa de vidro revestidas com 10 ug /ml de fibronectina (Sigma-Aldrich).