Abstract

Fundo

O ativador do plasminogênio uroquinase (uPA) e seu receptor (uPAR /CD87) são os principais reguladores da degradação da matriz extracelular e estão envolvidos na migração celular e invasão em condições fisiológicas e patológicas. O sistema de uPA /uPAR tem sido de grande interesse na investigação sobre o cancro porque está envolvido no desenvolvimento da maioria dos fenótipos cancerosas invasivas e é um forte preditor de sobrevida pobre paciente. No entanto, pouco se sabe sobre o papel do uPA /uPAR no cancro do pulmão de pequenas células (CPPC), o tipo mais agressivo de câncer de pulmão. Nós, portanto, determinar se uPA e uPAR estão envolvidos na geração de fenótipo de células SCLC resistente a medicamentos.

métodos e resultados

Nós selecionados seis linhas de células SCLC humanos para marcadores de superfície de células estaminais e câncer putativos. Utilizou-se a classificação de células activadas por fluorescência (FACS), microscopia de fluorescência e ensaios clonogénicos para demonstrar a expressão de uPAR numa subpopulação de células derivadas a partir de linhas de células de SCLC primário e metastático. ensaios citotóxicos foram utilizadas para determinar a sensibilidade de células de uPAR-positivos e negativos para uPAR-agentes quimioterapêuticos. As células uPAR-positivos em todas as linhas SCLC demonstrado resistência a múltiplas drogas, atividade alta clonogênica e co-expressão de CD44 e MDR1, marcadores de células-tronco do câncer putativos.

Conclusões

Estes dados sugerem que células uPAR-positivos podem definir uma população funcionalmente importante de células cancerosas em SCLC, que são resistentes às quimioterapias tradicionais, e poderia servir como alvos críticos para intervenções terapêuticas mais eficazes em SCLC

Citation:. Gutova M, Najbauer J , Gevorgyan A, Metz MZ, Weng Y, Shih CC, et al. (2007) identificação de células resistente à quimioterapia uPAR-positivos em Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 2 (2): E243. doi: 10.1371 /journal.pone.0000243

Editor do Academic: Christopher Arendt, Sanofi-Aventis, Estados Unidos da América

Recebido: 15 Janeiro, 2007; Aceito: 31 de janeiro de 2007; Publicação: 28 de fevereiro de 2007

Direitos de autor: © 2007 Gutova et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados.

Introdução

cancro do pulmão de pequenas células (CPPC) é o tipo mais agressivo de câncer de pulmão e tem um uniforme mau prognóstico. Metástases desenvolver rapidamente, principalmente a medula óssea e cérebro, e estão normalmente presentes no momento do diagnóstico. Nos doentes não tratados, a sobrevivência média é de dois meses a partir do início dos sintomas [1].

em vários tipos de tumores níveis elevados de activador do plasminogénio uroquinase (uPA) e o seu receptor uPAR (CD87) se correlacionam fortemente com prognóstico pobre e o resultado clínico desfavorável [2], [3], [4], [5], [6]. uPA e uPAR é instrumental no controlo da proteólise extracelular e transmembranar de sinalização associado à membrana, afectando, assim, a migração celular e invasão em condições fisiológicas e patológicas [2], [7], [8], [9], [10]. uPAR sobre-expressão em células malignas resultados da activação de diversas vias, incluindo oncogénicos MAPK, RTK, ERK2 e FAK [2], [7], [9]. Várias mutações oncogénicas, incluindo p53 em células cancerosas levar à expressão descontrolada de uPA /uPAR [11]. Inibição de uPAR num modelo de ratinho de cancro do pulmão de células não pequenas e outros tumores inibiu o crescimento tumoral, invasão, angiogénese e metástase [12], [13], [14]. Aumento dos níveis de uPAR são correlacionados com maior mortalidade em pacientes com células escamosas e carcinoma de pulmão de células não pequenas [15], [16], porém pouco se sabe sobre o papel da expressão de uPA /uPAR em SCLC.

Um estudo recente da Alfano

et al

sublinha a importância de uPAR sinalização na prevenção da apoptose por resistência das células cancerosas para anoikis (apoptose induzida por perda de ancoragem). expressão de uPAR promove a sobrevivência de células por factor de activação anti-apoptose Bcl-xL de transcrição através da MEK /ERK- e PI3K /Akt-dependente [17]. Por conseguinte, os autores sugerem que a expressão de uPAR podem estar envolvidos no desenvolvimento do fenótipo de cancro resistente a fármacos em CPPC.

Relatamos aqui a presença de uma população rara de células de uPAR-positivos em linhas de células SCLC humanas que demonstram droga significativa resistência aos agentes quimioterapêuticos tradicionais, tais como 5-fluorouracilo (5-FU), cisplatina e etoposido. As células uPAR-positivos expressa marcadores de células de haste e câncer, incluindo CD44 e MDR1. Identificação e segmentação de células uPAR-positivas em SCLC pode fornecer informações valiosas sobre a biologia do câncer de pulmão humano e pode estabelecer novos alvos críticos para terapias anticâncer mais eficazes.

Métodos

imunocoloração e Análise de Citometria de Fluxo

primária (pulmonar) de carcinoma do pulmão de células pequenas (SCLC) (linhas de células H1688, H1417, H69AR), medula óssea (BM) metastático CPPC (H211, H1882) e cérebro metastático CPPC (H250) linhas celulares foram obtidas a partir de pulmão humano primário e tecidos metastáticos (ATCC), cultivadas em meio RPMI 1640 modificado médio (ATCC, N: 30-2001) suplementado com 10% de soro Fetal bovino (FBS). A linha de células metastática BM (H1882) foi cultivado em meio completo HITES (D-MEM /F-12, N: 30-2006 suplementado com insulina 5 ug /ml, transferrina 10 mg /ml, selenito de sódio 30 nM, 10 nM de hidrocortisona , β-estradiol de 10 nM, L-glutamina 2 mM, HEPES 10 mM e 5% de FBS). As células foram crescidas durante duas semanas e foram analisadas por citometria de fluxo utilizando os seguintes anticorpos: CD59 (CBL467P), CD109 (CBL585P), CD62E (CBL180F) da Chemicon, CD87 (3936CJ) de American Diagnostica, CXCR4 (FAB170F) a partir de R D sistemas, CD24 (555427), CD90 (555596), CD38 (347680), CD44 (555478), CD45 (555482), CD13 (555,394), CD49b (555498), CD29 (555,443), CD3 (30104X) a partir de BD Pharmingen, ABCG2 /BCRP1 (10400) a partir Technologies Stem Cell, CD133 /2 (clone 293C3) e CD133 /1 (clone AC133) da Miltenyi Biotec, CD34 (347660) da Becton Dickinson, CD105 (326-050) a partir de Alexis, MNF116 (F0859 ), Cyt18 (F7212) a partir DACO, e CD166 (3 pés) de RDI. Para análise FACS de cada linha celular foi isolada por tripsinização e re-suspenso em tampão de coloração (SB) (HBSS, Irvine Scientific, 9228) suplementado com FBS a 2% e HEPES 10 mM a uma densidade de 5 x 10

6 células /ml. Cinquenta ul (2,5 × 10

4 células) foi adicionada a cada poço de uma placa de 96 poços em forma de v. Os anticorpos (ou FITC conjugado com PE) foram adicionados em concentrações recomendadas pelo fabricante (20 ul /10

6 células). Os anticorpos para CD133, CD34, CD44, CD87 e MDR1 foram tituladas individualmente. As placas de 96 poços foram colocadas em gelo e as células foram coradas com os anticorpos durante 30 min no escuro. Após a coloração, a 150 ul de tampão de lavagem (HBSS, suplementada com FBS a 15% e HEPES 10 mM) /foi adicionado e as placas foram centrifugadas a 500 ×

g

durante 5 min a 4 ° C. Os sedimentos de células foram re-suspensas em SB, suplementado com iodeto de propídio (PI) (1 ug /ml) para excluir as células não viáveis, seguido por análise de citometria de fluxo.

A coloração celular e triagem

linhas de células SCLC (H211, H69AR, H1417) foram cultivadas em meio RPMI 1640 e 4 × 10

6 células foram recolhidas e em seguida, re-suspenso em 800 mL de SB, seguido por coloração com uPAR (CD87) -FITC-conjugado anticorpo como descrito acima. células uPAR-positivos e negativos-uPAR foram classificadas por FACS, seguido pela cultura na “base” media metilcelulose (Stem Cell Technologies, 04100), durante 16 dias a 37 ° C, 5% de CO

2.

clonogénicas Ensaio de SCLC Linhas Celulares

RPMI 1640 completo foi adicionado ao meio Methocult H4100 (40 ml) para se conseguir um volume final de 100 ml. células uPAR-positiva e uPAR-negativas derivadas de linhas celulares CPCP (H211, H69AR, H1417) foram plaqueadas em meio Methocult em triplicado contendo 3 × 10

3, 1 x 10

3, ou 1 x 10

2 células /ml. As células foram cultivadas a 37 ° C, 5% de CO

2 numa incubadora humidificada, durante 16 dias. As colónias foram contadas utilizando um microscópio de campo claro invertido a 4 × ampliação.

Ensaio de Citotoxicidade

células derivadas a partir de três linhas SCLC foram imunocoradas e classificados por análise de citometria de fluxo (tal como descrito acima). As linhas celulares (H211, H69AR, H1417) foram contadas e colocadas em placas de 96 poços (4 × 10

3 células /poço, em triplicado) com concentrações finais de drogas 0, 3, 10, 100, 200 ug /ml . Após incubação durante 72 h, tanto as células viáveis ​​e mortas foram contadas usando o ensaio de goiaba ViaCount, e apenas as células viáveis ​​foram incluídos na análise de dados. O ensaio de goiaba ViaCount distingue entre células viáveis ​​e não viáveis, com base na permeabilidade diferencial de corantes de ligação de ADN no reagente ViaCount, e, portanto, a fluorescência dos corantes permite a avaliação quantitativa de ambas as células viáveis ​​e não viáveis ​​em suspensão. Alternativamente, células não ordenadas foram aplicadas a placas de 48 poços (1 × 10

4 células /cavidade) e tratados com cisplatina, o etoposido e a sua combinação, em concentrações de 0, 3, 10, 100 ug /ml. As densidades de sementeira por unidade de área (mm

2) foram as mesmas para ambas as lâminas 48- e 96-poços (densidade = 125 células /mm

2). Após 72 horas de incubação, as células viáveis ​​foram coradas com anticorpos uPAR-FITC e avaliados por citometria de fluxo.

Double-rotulagem para citometria de fluxo

As linhas celulares foram coradas com CD44-PE e MDR1- PE, foram lavadas e depois coradas com uPAR-FITC (1 × 10

5 células /1 ug de anticorpo). Iso-corresponderam ao tipo PE- ou anticorpos conjugados com FITC foram utilizados como controlos. As células coradas foram analisadas por citometria de fluxo.

Resultados

citometria de fluxo de linhas de células SCLC Humano

Para identificar os fenótipos SCLC mais invasivos, nós analisamos seis linhas de células SCLC humanas (H1688, H1417, H69AR derivado do local do tumor primário no pulmão, H250 de metástases para o cérebro, e H211, H1882 de metástases da medula óssea) com um painel de anticorpos para determinantes da superfície de células tumorais, incluindo uPAR, CD13, CD29, CD44 , CXCR4, CD105, CD109, CD166 e para marcadores de células-tronco CD34, CD90, CD133, ABCG2 /BCRP1. linhas de células SCLC exibido fenótipos heterogêneos em relação aos determinantes da superfície do tumor. Todos os seis linhas de células SCLC foram positivas para CD29 (20-99%), CD44 (8-98%), CD105 (3-34%), CD166 (85-98%), e negativo para CD90, e CXCR4. uPAR (CD87) foi o único antigénio da superfície celular expressa em uma pequena sub-população de células (1-4%) em cada uma das seis linhas de células de SCLC, quando analisado por FACS utilizando anticorpo anti-uPAR-FITC (Figura 1,

painéis inferiores

).

citometria de fluxo e expressão uPAR em linhas de células SCLC derivados. (, B, C A) Lung-derivadas linhas SCLC celulares, (D, E) de medula óssea metastática e (F) linhas de células cerebrais metastáticos. Todas as células foram cultivadas em meio RPMI 1640, coradas com anticorpo de uPAR-FITC e analisadas por citometria de fluxo (

em painéis inferiores

). coloração de controlo foi realizada utilizando FITC-conjugado IgG de ratinho, de isotipo coincidente (

painéis superiores). Uma pequena população de células uPAR-positivas foi detectado em todas as linhas celulares examinadas, e é indicado como percentagem de células viáveis ​​R1-fechado. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes.

As amostras de controlo coradas com isotipo IgG-FITC foram negativos para a expressão de uPAR (Figura 1,

painéis superiores). A presença consistente de uma pequena subpopulação de uPAR-positiva de células em todos primária (pulmão, Figura 1,

painéis inferiores

A, B, C) e metastáticos (da medula óssea; Figura 1,

D, e, e cérebro; F) linhas de células de SCLC, em contraste com outros marcadores, que variou em abundância, sugere que as células uPAR-positivas pode compreender uma sub-população de células original funcionalmente

quimiorresistência de uPAR. células -positivas

Nossa hipótese é que a população de células uPAR-expressando podem ser resistentes a agentes quimioterapêuticos. Foram realizadas ensaios de citotoxicidade em três linhas celulares seleccionadas utilizando não classificadas (em massa), bem como as populações de células uPAR-positivos e negativos uPAR-ordenadas. O aumento das concentrações de 5-fluorouracilo (5-FU) (10, 100, 200 ug /ml) foram adicionados a estas culturas de células e incubou-se durante 72 horas, seguido por contagem de ambas as células viáveis ​​e mortas. Os dados foram normalizados para 100%, o que significa o número de células positivas e uPAR-uPAR-negativos sem fármaco adicionado. Um efeito de matar células foi detectada em todas as três linhas de células não ordenadas (H211, H69AR, H1417), em que 40-80% das células foram mortas por 5-FU (Figura 2A). Importante, uPAR-positivos a partir de células separadas estas três linhas celulares apresentou aumento de forma significativa a resistência ao 5-FU, com apenas 40-50% de células mortas sendo, no caso de H211 e H1417 (Figura 2B). Embora a linha de células H69AR também mostrou morte diferencial de células uPAR-positivos e uPAR-negativos (por exemplo, 10 ug /mL de 5-FU matou 30% das células uPAR-positve contra 85% de células uPAR-negativa), a uma concentração elevada de 5-FU (200 ug /ml), o efeito letal para ambas as populações (H69AR) foi o mesmo (-100%). A análise estatística (2-way ANOVA) de uPAR (+) e uPAR (-) conjuntos de dados revelaram diferenças significativas na sobrevivência de uPAR (+) e uPAR (-) células após o tratamento com 5-FU (

P

= 0,0002, 0,0027, 0,0008 por H211, H69AR, H1417 células, respectivamente) (Figura 2B).

efeito citotóxico de 5-FU sobre as populações não-ordenados e classificados (uPAR-positivos e negativos-uPAR) derivado a partir de linhas de células SCLC. (A) 1 × 10

4 células (H211, H69AR, H1417) foram colocadas em poços de uma placa de 48 poços em triplicado e incubadas durante 72 horas na presença de várias concentrações de 5-FU. (B) As linhas de células SCLC foram separadas por FACS após coloração com anticorpos anti-uPAR e foram plaqueadas à mesma densidade de sementeira (4 × 10

3 /poço de placa de 96 poços) e tratada com 5-FU a 0, 10 , 100, 200 ug /ml, durante 72 h. A sobrevivência das células foi avaliada após a adição do reagente Goiaba ViaCount e contagem de células viáveis ​​e mortas. Apenas as células viáveis ​​foram incluídos na análise de dados, e 100% de viabilidade foi definida como o número de células viáveis ​​cultivadas na ausência de 5-FU. A análise estatística (2-way ANOVA) de uPAR (+) e uPAR (-) conjuntos de dados revelaram diferenças significativas entre viabilidade de uPAR (+) e uPAR (-) células (

P

= 0,0002, 0,0027, 0,0008 para H211, H69AR, H1417 células, respectivamente). Os pontos de dados representam as médias ± DP de três experiências independentes.

semelhante investigado o efeito citotóxico de cisplatina e etoposido, as drogas actualmente utilizadas para o tratamento de pacientes com SCLC. As linhas de células SCLC não ordenadas (H211, H69AR, H1417) foram utilizados em ensaios de citotoxicidade com cisplatina e etoposido em

In vitro

estudos (3, 10, 100 ug /ml) (Figura 3A). 60-80% das células foram mortas por cisplatina e etoposido (utilizados isoladamente ou em combinação) em linhas não ordenadas (Figura 3A). Mais uma vez, as células uPAR-positivas escolhidas de estas três linhas celulares apresentou aumento significativo na resistência à cisplatina e etoposido, com apenas 30-50% de células mortas sendo, em comparação com 60-80% de morte das células separadas uPAR-negativas (dados não mostrando). Estes dados sugerem que a subpopulação de células uPAR-positivo em CPPC pode ser responsável por quimiorresistência de 5-FU e outros fármacos quimioterapêuticos tradicionais, tais como a cisplatina e etoposido.

efeito citotóxico da cisplatina e etoposido em células não classificados derivado a partir de linhas de células SCLC. (A), linhas de células SCLC (não classificados) tratados com cisplatina, etoposido em concentrações 0, 3, 10, 100 ug /ml ou suas combinações (cisplatina e etoposido em concentrações finais de 10 ug /ml, 100 ug /ml) durante 72 hr. A sobrevivência das células foi avaliada após adição do reagente Goiaba ViaCount e contagem de ambos os sobreviventes e mortos células usando software Goiaba ViaCount. Os dados foram normalizados como 100% de viabilidade de células cultivadas na ausência de drogas. As barras de erro indicam o desvio padrão de culturas em triplicado (resultados de três experiências independentes). (B) Depois de cisplatina e etoposido tratamento, as células aderentes viáveis ​​foram separadas por tratamento com tripsina e foram coradas com anticorpos anti-uPAR-FITC e percentagem de células uPAR-positivas foi determinada por análise FACS. Amostra com o anticorpo de controlo do isotipo IgG foi utilizado para definir o valor do portão FACS, que foi aplicada a todas as amostras coradas com uPAR-FITC.

A fim de confirmar que a expressão uPAR confere resistência tumor cisplatina e etoposido, foram realizados ensaios de citotoxicidade sobre as mesmas linhas de células SCLC não ordenadas e parecia para o enriquecimento de células de uPAR-positivas na população de células sobreviventes. De facto, detectou-se o enriquecimento significativo de células uPAR-positivo (40-70%) entre as células sobreviventes, em comparação com apenas 1-5% das células uPAR-positivos em culturas de controlo cultivadas na ausência destas drogas (Figura 3B). Estes dados suportam a hipótese de que a expressão de uPAR confere quimiorresistência em CPPC, e que as células uPAR-positivas deve ser considerado como um novo alvo para terapias mais eficazes.

Actividade de células clonogénicas uPAR-positivos

Para demonstrar que células uPAR-positivos possuem elevado potencial clonogénico e auto-renovação, que classificados primário do pulmão (H1417, H69AR), medula óssea metastática linhas (H211) células por FACS utilizando anticorpos monoclonais anti-uPAR-conjugados com FITC. Depois de triagem (97% de pureza), células uPAR-positivos e negativos-uPAR foram plaqueadas em meio de metilcelulose em densidades de 3000, 1000, 100 células /poço (placa de 6 poços). células uPAR-positivos a partir de estas linhas SCLC primário e metastático formado múltiplos colónias distintas (Figura 4A). Foi estimado que cerca de ~ 10% das células positivas (uPAR-pulmão, H1417; medula óssea, H211) colónias formadas (Figura 4B). Por outro lado, as células uPAR-negativos em relação ao primário do pulmão de células (H1417) não formam colónias, e a partir de medula óssea metastática (H211) e pulmão (H69AR) formada apenas algumas colónias (Figura 4B). Depois de células uPAR-positivos foram autorizados a formar colónias durante 16 dias em cultura metilcelulose, 20 colónias foram isoladas e analisadas quanto à expressão de uPAR por citometria de fluxo. Encontrámos ambas as células uPAR-positivos e uPAR-negativos em cada colónia analisados ​​(H1417), com 30-50% de células que apresentem uPAR positividade dentro de cada colónia, após 18 dias de incubação (figura 4c). Isto sugere que as células uPAR-positivas podem dar origem a ambas as células de uPAR-positivos e uPAR-negativas. expressão uPAR foi também analisada nas colônias derivadas de linhas celulares H211 e H69AR. Em todas as colónias derivadas de células positivas uPAR-ordenadas que ambas as células detectadas uPAR-positivos e uPAR-negativas (-50% depois de cada 16 dias em cultura) de metilcelulose (dados não mostrados). Análise de colónias derivadas de células uPAR-negativos (por exemplo, linha de células H211) revelou uma pequena proporção de células positivas em uPAR-essas colónias ( 1%). A razão para isto pode ser possível contaminação durante a classificação. Alternativamente, as células cancerosas uPAR-negativas podem adquirir expressão de uPAR, sob certas condições de cultura. Várias colónias uPAR-positivas foram repicadas e cultivadas ainda durante 2 semanas em meio de cultura RPMI, seguida de separação por FACS e ensaio clonogénico. Curiosamente, foi detectada uma proporção semelhante de células positivas e uPAR-uPAR-negativas (1-5% e 95-99%, respectivamente) nestas culturas, o que sugere que as colónias uPAR-positivas podem recapitular o fenótipo celular parental. Em culturas derivadas a partir de colónias uPAR-negativas, por outro lado, que detectaram níveis inferiores (0,1-0,8%) de células uPAR-positivos, e o crescimento global fraca (dados não apresentados).

de actividade Colony-formando células uPAR-positivos e negativos uPAR-derivados de linhas de células SCLC. (A) H1417- derivado, células classificadas uPAR-positivas formadas várias colónias em meios metilcelulose, enquanto as células uPAR-negativos dos mesmos tipos exibidos pouca ou nenhuma atividade clonogênica. (B) representação gráfica da capacidade de formação de colónias de células uPAR-positivos e uPAR-negativas em diferentes densidades de plaqueamento 3000, 1000, 100 células /placa de 6 poços (H1417, H69AR, H211). (C) distribuição de células positivas uPAR-nas colónias derivadas de uPAR-positivos células separadas cultivadas em meio de metilcelulose. Foram analisados ​​um total de 20 colônias de células da linha de células H1417.

Co-expressão de uPAR com CD44 e MDR1

Nós ainda mais a hipótese de que se as células uPAR-positivos representam droga população resistente e clonogénicas, em CPPC, eles podem expressar genes de CD44 e MDR1 (ABCB1), que estão envolvidos no desenvolvimento do fenótipo de células estaminais do cancro e resistência multi-droga. Para caracterizar ainda mais a população uPAR-positivo, realizamos experimentos de rotulagem duplo com uPAR-FITC e CD44-PE, bem como MDR1-PE em linhas de células H211, H69AR, H1417. células uPAR-positivas provenientes de linhas de células SCLC (H211, H69AR, H1417) expressa CD44 em 50-80%, ao passo que MDR1 em 10-40% das células (Figura 5A). Expressão dos marcadores acima também foi confirmada utilizando a microscopia de fluorescência (Figura 5B). As células uPAR-negativas também expressa CD44 (~ 70% de células H211 e H69AR; ~ 10% para H1417) e MDR1 (1-10% para todas as linhas celulares) (Fig. 5A). Estes dados sugerem um enriquecimento de expressão de CD44 em células H1417, ao passo que a MDR-1 mostraram um aumento da expressão em células de uPAR-positivas provenientes de todas as três linhas de células, em comparação com células uPAR-negativos (Fig. 5A).

Expressão de e CD44 em células MDR1 uPAR-positivos e uPAR-negativas. (A) Análise FACS de, H211, H69AR e linhas de células SCLC H1417 duplamente marcada com uPAR-FITC e CD44-PE, MDR1-PE. As percentagens de células que expressam CD44 e MDR1 foram calculadas separadamente para as células uPAR-positivos e uPAR-negativas. (B) A análise microscópica fluorescente de células de marcação dupla e FACS-ordenadas. Exemplos de uPAR-FITC /CD44-PE duplo rotulagem (a, b, c) e /MDR1-PE duplo rotulagem uPAR-FITC (d, e, f). (Bf-inserção) linha de células H1417 coradas com IgG de rato isotipo controle-PE (vermelho), isotipo controle-FITC (verde) e DAPI (azul).

Discussão

A principal conclusão deste estudo é a identificação de uma rara subpopulação de células uPAR-positivos em linhas de células SCLC derivados de pulmão e metástase para medula óssea e cérebro. É bem documentado que uPAR sobre-expressão em vários tumores malignos está fortemente correlacionada com fenótipos de câncer mais invasivos e mau prognóstico [2], [4], [15], [18].

Vários estudos sugerem a presença de uma população rara de células de tumores sólidos e leucemia, que possuem a capacidade de regenerar e propagar o tumor [19], [20], [21], [22], [23]. Estas células também podem ser responsáveis ​​por manter o potencial de malignidade do tumor e servir como a causa subjacente de recorrência do tumor [24], [25]. estratégias de tratamento actuais podem não conseguir atingir a subpopulação resistente à droga, e pode explicar a resposta terapêutica inicial da maioria das células tumorais, que é seguido por uma recorrência posterior.

Verificou-se que células de uPAR-positivos eram mais resistentes ao tratamento com o agente citotóxico de 5-FU, enquanto que as células uPAR-negativas foram mortos muito mais eficientemente. O efeito citotóxico de 5-FU tem sido atribuída a incorporação errada de fluoronucleotides em ARN e ADN e à inibição do nucleótido sintético enzima timidilato sintetase, que tem como alvo principalmente células em divisão rápida [26]. Também investigamos cisplatina e etoposídeo, medicamentos quimioterápicos atualmente utilizados no tratamento de doentes com CPPC. Importante, a cultura de células de SCLC, na presença de cisplatina e etoposido resultou na morte selectiva de células de uPAR-negativas com enriquecimento concomitante da população celular uPAR-positiva.

células uPAR-positivos isolados a partir de três linhas SCLC foram capazes a proliferar e formar várias colónias em meios metilcelulose, enquanto as células uPAR-negativos exibido pouco ou nenhum potencial clonogênica. Nós também mostrou co-expressão de uPAR com CD44 e MDR1, o que pode explicar a associação entre neoplasia avançada e resistência aos medicamentos. Vários estudos investigaram o papel individualmente de uPAR, CD44 e MDR1 em várias malignidades [5], [13], [14], [17], [19], 24,27,28,29,30,31,32, no entanto, para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que fornece evidência para a expressão de CD44 em células MDR1 e uPAR-positivos em CPPC. Nós também detectada expressão de CD44 e MDR1 em células uPAR-negativos, as implicações funcionais de que continua a ser determinado.

ATP-ligação cassete (ABC) transportadores de fármacos tem sido demonstrado para proteger as células estaminais a partir de agentes quimioterapêuticos do cancro 33 . Um grande transportador da família ABC é P-glicoproteína, o produto do gene MDR1, que é produzida por células estaminais hematopoiéticas (HSC) 32. o gene MDR1 se torna sub-regulada em HSC na diferenciação de células 32. P-glicoproteína e CD44 têm sido caracterizadas e são conhecidos por serem determinantes de resistência a múltiplas drogas em células cancerosas, que é mediada por interacções físicas e genéticas entre CD44 e MDR1 30. a activação da CD44 ocorre através heterodimerização de CD44 com os receptores do factor de crescimento (por exemplo, EGFR, FGFR, HGFR, VEGFR, o TGF-βR), o que leva à activação de MAP-cinase e vias de sinalização PI3K-AKT 34. estimulação de CD44 pelo seu ligando-se hialuronano-regula a expressão de uPA e uPAR mRNA, através da activação de MAPK-Ras pathway , enquanto a ativação PI3K estimula a expressão MDR1 e função 34. PI3K também atua como um feedback positivo para estimular a produção de ácido hialurônico, que ativa CD44 35,36. A sinalização de CD44-MAPK-PI3K leva à expressão descontrolada de uPA /uPAR e MDR1, que promove o fenótipo de células de cancro invasivo e resistente a múltiplas drogas. Além da sinalização de CD44-MAPK-PI3K, uPAR sobre-expressão pode induzir a sobrevivência celular através da activação do factor anti-apoptose Bcl-xL transcrição 17.

Os estudos futuros em modelos animais irá abordar se a uPAR-positiva As células são responsáveis ​​pelo crescimento do tumor primário e a formação de metástases distantes em CPPC. Em resumo, foram identificados a subpopulação uPAR-positivo das células SCLC que possuem alta resistência a múltiplas drogas e a actividade clonogénicas, enquanto as células uPAR-negativos são sensíveis a drogas quimioterapêuticas e exibir pouca ou nenhuma actividade clonogénico. Nós também fornecemos evidências de associação de uPAR, CD44 e expressão MDR1 em células SCLC. Outras investigações são necessárias para determinar se o alvo desta população celular será fundamental para o sucesso terapêutico.

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Kristine A. Justus para edição especialista do manuscrito, Lucy Brown para ajudar com medições de citometria de fluxo e Sofia Loera de assistência com técnicas de imuno-histoquímica. Agradecemos ao Dr. Kemp Kernstine para a prestação de cisplatina e etoposídeo. Este trabalho é dedicado à memória amorosa de Hrach Shahmanyan.