Abstract

MicroRNA-135a (miR-135a) down-modula parâmetros de progressão do câncer e sua expressão é diminuída em cancros da mama metastático (em comparação com tumores não metastáticos), bem como em tumores da próstata em relação ao tecido normal. Estes padrões de expressão e de actividade são opostas às do receptor de estrogénio-relacionadas α (ERRα), um membro órfão da família de receptores nucleares. Com efeito alta expressão de ERRα correlaciona-se com um mau prognóstico em cancros da mama e da próstata, e o receptor promove várias características de agressividade do cancro, incluindo a invasão celular. Aqui nós mostramos que o miR-135a down-regula a expressão de ERRα através de sequências específicas de sua 3’UTR. Como consequência miR-135a também reduz a expressão de alvos a jusante de ERRα. miR-135a também diminui o potencial invasivo de células num modo dependente da ERRα. Os nossos resultados sugerem que a diminuição da expressão de miR-135a em tumores metastáticos conduz a expressão ERRα elevada, resultando em aumento de capacidade de invasão de células

citação:. Tribollet V, Barenton B, Kroiss A, Vincent S, Zhang L, Forcet C, et ai. (2016) miR-135a inibe a invasão das células cancerosas através de Repressão de ERRα. PLoS ONE 11 (5): e0156445. doi: 10.1371 /journal.pone.0156445

editor: Franky L. Chan, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 28 Janeiro, 2016; Aceito: 13 de maio de 2016; Publicado em: 26 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Tribollet et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seu arquivo de Informações de Suporte

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Ligue contre le Cancer (comités Puy-de-Dôme https://www.ligue-cancer.net/cd63/journal e Drôme https://www.ligue-cancer.net/cd26/journal) para JS e JMV. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Jean-Marc Vanacker é membro do Conselho Editorial PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas e critérios editoriais.

Introdução

Os microRNAs (Mirs) são pequenos RNAs não-codificantes que, através de uma “caixa de semente” so-called ligam-se a sequências específicas complementares na 3’UTR do ARNm alvo e induzir a sua degradação ou bloquear a tradução da proteína codificada [1]. Dado o tamanho da região de ligação curto o ARNm in miRs e dado que a ligação imperfeita miR é, em alguns casos suficientes para induzir a regulação de mRNA, um indivíduo miR pode agir em vários mRNAs. Isto levanta a possibilidade de que uma via toda /processo pode ser controlada a diferentes níveis através de um único miR. Mirs pode promover ou reprimir a iniciação ou progressão do câncer, e desregulamentação de sua expressão é uma característica comum nesses processos [2-5]. Humana miR-135a é codificada por dois genes diferentes localizados em cromossomas (3 e 12 para miR-135a1 e miR-135a2, respectivamente), produzindo uma sequência idêntica, activa. resultados contraditórios têm sido publicados sobre os efeitos do miR-135a sobre a progressão do câncer. Relatórios de fato indicam que este microRNA pode promover ou reprimir vários traços relacionados com a agressividade do tumor, como a proliferação, migração e invasão celular em linhas de células do cólon, melanoma, câncer de mama ou de próstata [6-12]. No entanto, foi demonstrado que a expressão de miR-135a é fortemente diminuída em tumores de mama metastático (em comparação com tipos de cancro não metastático, [10]), bem como na próstata tumores relativamente a tecido normal, [11], o que sugere que, pelo menos nestas tumoral tipos, miR-135a neutraliza a progressão do câncer. A este respeito, a re-expressão de miR-135a em células que não expressam reduz a sua capacidade de invasão. Pelo menos três mecanismos moleculares têm sido propostos para explicar essa redução. Dependendo do estudo e no modelo celular, miR-135a tem, de facto foi demonstrado para diminuir a expressão de FAK, Runx2 e ROCK1 /2, todos os regulamentos que levam a uma redução da invasão celular [9-11].

o receptor de estrogênio-Related α (

ESRRA

, doravante referida como ERRα) é um membro da superfamília de receptores nucleares. Como tal, ele exibe um domínio de ligação de ADN localizado centralmente conservado, bem como um domínio de ligação ao ligando putativo no terminal-C localiza-se que contactos co-activadores e é necessário para a activação da transcrição [13]. No entanto, não ligando natural de ERRα foi identificado até o momento. ERRα é, portanto, referido como um receptor “órfão” e activa a transcrição dos seus genes-alvo de um modo independente do ligando aparente. ERRα regula vários processos fisiopatológicos

in vivo

tais como a diferenciação dos osteoblastos e formação óssea (revisto em [14]), a imunidade inata [15-16] e metabolismo energético (revisto em [17-18]). Além disso, a alta expressão ERRα em cancros correlaciona-se com um mau prognóstico em vários tipos de câncer ([19-25], revisto em [26-28]). Consistentemente, foi demonstrado ERRα para promover a várias características de progressão do cancro, variando de proliferação [29-30], epithelio-mesenquimais transição [31], a resistência à hipoxia [32], a angiogénese [33], interruptor metabólico a glicólise aeróbica [34 -35], a migração celular e invasão [36-37]. ERRα aumenta a invasão de células por meio de, pelo menos, dois mecanismos moleculares. Por um lado, o receptor de fato ativa cascata Wnt11-dependente, por outro lado, ERRα indiretamente afina estabilidade RhoA a um nível que é apropriado para a migração celular orientada e invasão.

Aqui nós mostramos que a reintrodução de miR-135a em células não expressando resulta na regulação negativa da expressão ERRα nos níveis de ARNm e de proteína. Isto ocorre através de seqüências 3’UTR que são complementares caixa de semente de miR-135a para. Consistentemente, a expressão de genes alvo ERRα é modulada por miR-135a de um modo dependente da ERRα. Além disso, o miR-135a sobre-expressão diminui a capacidade de invasão de células MDA-MB231 e células PC3 (células de carcinoma de mama e de próstata humanas, respectivamente). Estas capacidades podem ser resgatados por re-expressão de uma construção ERRα que não é alvo de miR-135a. No total, isso aponta para ERRα como um objectivo alternativo miR-135a envolvidos na regulação da invasão celular.

Materiais e Métodos

Células e Reagentes

MDA-MB231 (humana células epiteliais mamárias) e PC3 (células da próstata humana) foram cultivadas em meio de Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal de vitela, 10 U /ml de penicilina, 10 ug /ml de estreptomicina. LNCaP (células da próstata humana) foram cultivadas em RPMI (Invitrogen) suplementado do mesmo modo. As células foram mantidas numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C. siRNAs e miARNs foram introduzidos em células utilizando Interferine (Ozyme) ou Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher), respectivamente, seguindo as instruções dos fabricantes. ERRα siRNAs (sequências na Tabela S1) foram de Invitrogen (siERRα # 1) e Dharmacon (2 siERRα #). Pré-miRNAs (PM11126 para miR-135a; controle negativo miR n ° 2) eram de Ambion

Expression Analysis

Total de RNAs foram extraídos por tiocianato de guanidina /fenol /clorofórmio e convertido em primeiro lugar. cadeia de ADNc utilizando o kit de síntese de ADNc IScript (Biorad). PCR em tempo real foram realizados numa placa de 96 poços utilizando o IQ SYBR Green Supermix (Biorad). Os dados foram quantificados pelo método ΔΔ-CT e normalizada para RPLP0 (36B4) ARNm. As sequências dos iniciadores utilizados neste estudo estão apresentados na Tabela S1.

Para a análise de Western Blot, as células foram lisadas em tampão RIPA. Proteínas (50 ug) foram resolvidas por 10% SDS-PAGE, transferidas para PVDF (Millipore), sondados com anticorpos específicos após saturação e revelada utilizando um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (ECL kit, Amersham Biosciences) com peroxidase específico apropriado Abs conjugado. Os anticorpos foram de Gentex (ERRα, GTX108166), Enzo (hsp90, ADI-SPA-830) e Sigma (Bandeira, F-3165).

Plasmids e luciferase Ensaios

pSG5Flag-AA /B-ERRα foi descrito em outro lugar [38]. Seqüências em ESRRA (codificação ERRα) 3’UTR que são complementares caixa de semente de miR-135a para eram previsíveis usando TargetScan (https://www.targetscan.org), PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de) e miRanda miRBase (https://microrna.sanger.ac.uk) programas on-line disponíveis. Um fragmento de 400 pb do ESRRA humana 3’UTR englobando tanto previu sequências complementares foi clonado por PCR usando MDA-MB231 originário retrotranscrito mRNA e iniciadores flanqueadas por locais de restrição XhoI e Sall. sequências complementares foram mutados por PCR recombinante. Depois de verificação através de sequenciação, de tipo selvagem e mutados fragmentos foram clonados no vector de expressão pmiRGLO duplo (Promega) como Xhol-Sall insere a jusante da sequência de repórter de luciferase de pirilampo. As sequências dos oligonucleótidos utilizadas para a mutagénese estão disponíveis na Tabela S1.

Para transfecções transitórias, 10

5 células MDA-MB231 foram cultivadas em placas de 24 cavidades e foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000, 50 ng de plasmídeo e o pmiRGLO quantidade indicada de pré-miR. As células foram lisadas 48 h após as atividades de transfecção e Repórter (Renilla e vaga-lume luciferases) foram determinadas usando métodos padrão.

Invasão Ensaios

Para os ensaios de invasão, células (5. 10

4) foram suspensos em 200 ul de DMEM /FCS a 2% e semeadas em cima da invasão Matrigel câmaras (Corning). As células foram deixadas migrar para a câmara inferior contendo DMEM /FCS a 10% durante 48 horas. Matrigel foi removido utilizando cotonetes e as células foram fixadas 1 h com 4% de formaldeído, colorida com 0,1% de violeta de cristal e microphotographed. células invasoras foram contados em todo bem usando o Image J.

Análise Estatística

A significância estatística foi determinada utilizando Student t-testes entre os grupos.

Resultados

miR-135a Diminui ERRα expressão

Durante o decorrer de um estudo anterior, as consequências de pré-miR-135a sobre-expressão em células de cancro da próstata humano LNCaP foi analisada em termos de expressão do gene celular utilizando uma micro-matriz abordagem [11]. Observou-se que a expressão do receptor nuclear órfão ERRα foi diminuída após um tal tratamento. Para validar os resultados obtidos, transitoriamente transfectadas pré-miR-135a em células LNCaP e analisada a expressão de proteína ERRα (Figura 1a). Verificou-se que o nível deste receptor foi reduzida, o mais rapidamente quanto 24 h após a transfecção, um efeito que persistiu (ainda que em menor escala) por 48 h. Resultados semelhantes foram também obtidos em células de carcinoma da mama humano MDA-MB231. O ARNm ERRα-correspondente também foi reduzida 24h e 48h após a transfecção em células tanto de LNCaP e MDA-MB231, como julgado por experiências em tempo real de PCR (Fig 1B), sugerindo um efeito directo sobre o ARNm

.

A as células indicadas foram transfectadas com pré-miR-135a ou controlo pré-miR (-) durante o tempo indicado. uma. Expressão das proteínas indicadas determinados por Western blot. Hsp90 foi utilizado como um controlo de carga. Quantificação da expressão da proteína ERRα (apresentado abaixo os blots) é expressa em relação ao da hsp90, utilizada como um controlo de carga. b. Expressão de ARNm correspondentes ERRα analisados ​​por PCR em tempo real. Os dados são apresentados relativamente a amostras de controlo pré-miR e expressas em relação à expressão de RPLP0. É mostrada a média de experiências realizadas três vezes. Erros barras indicam SEM. ***:

p Art 0,005

Analisamos o mRNA ERRα humana por motivos de reconhecimento de microRNA usando três programas de previsão independentes (TargetScan, PicTar e Miranda), que rendeu idênticos. resultados. Duas sequências complementares possíveis para miR-135a foram identificadas na 3 ‘UTR com o mais alto (8-meros) de probabilidade de ligação (Fig 2a). Digno de nota a sequência, bem como a posição de estes dois locais são altamente conservadas em mamíferos, mas não em aves ou anfíbios, se a referida sequência correspondente puderam ser identificados. Para determinar se estas sequências complementares são funcionais para o reconhecimento de miR-135a, um fragmento de 400 pb da 3’UTR (englobando ambas as sequências potenciais) foi clonado a jusante do gene repórter da luciferase no plasmídeo pmiRGLO. Cada sequência complementar foi então mutado por si só ou em combinação. As construções resultantes foram transfectados em células MDA-MB231, juntamente com pré-miR-135a (Fig 2b). O fragmento de tipo selvagem derivado ERRα-conferiu sensibilidade miR-135a, resultando num decréscimo de 50% na actividade repórter. Este efeito foi abolida com mutação da sequência complementar 2, mas não sequência complementar 1. Isto sugere fortemente um efeito directo de miR-135a na 3’UTR de ERRα, em particular na sequência complementar 2, resultando em níveis diminuídos do ARNm correspondentes e proteína.

a. sequências complementares 1 e 2 (letras maiúsculas) em ERRα 3’UTR são exibidos para as espécies indicadas (

Homo sapiens

,

Mus musculus

,

Bos taurus Comprar e

Felis silvestris

) e alinhada com a sequência de miR-135a. Posição do primeiro nucleótido de cada sequência complementar (CS 1 e 2) é indicada em relação ao primeiro nucleótido 3 ‘UTR e em relação ao início de ARNm humano (em parênteses). Nucleotídeos em negrito foram eliminados nos mutantes correspondentes. b. Esquema dos mutantes gerados em PMIR-Glo está representado na parte superior. As células MDA-MB231 foram transitoriamente transfectadas com os correspondentes derivados PMIR-Glo em conjunto com a concentração indicada de pré-miR-135a. actividades de luciferase foram determinados 48 h após a transfecção e a actividade da luciferase do pirilampo foi normalizada para a da luciferase de Renilla. Os resultados são expressos para cada plasmídeo como percentagem relativa para a transfecção com pré-miR controlo e representam a média de três experiências independentes. Erros bares indicado SEM. **:

p Art 0,01, ***:.

p Art 0,005

miR-135a Regula ERRα moleculares e celulares Atividades

Para analisar as consequências do presente regulamento, examinamos se as funções de ERRα pode ser impactado por miR-135a. ERRα actua como um factor de transcrição e os seus alvos genes em células MDA-MB231 foram previamente identificados através de uma abordagem transcriptómica ARN-sequenciação [37]. Nós fundamentado que a sobre-expressão de miR-135a, levando a níveis diminuídos ERRα, deve também resultar na desregulação da expressão destes genes alvo. Esta hipótese foi examinada em nove genes selecionados, que são, de acordo com a nossa abordagem transcriptomic, seja positiva (DHX33, GDAP1, RAB39A, RAPGEF5, TMEM198 e TNFAIP1) ou negativamente (PDGFRB, RRAS, CEACAM1) regulado por ERRα. Mais importante, estes genes foram escolhidos uma vez que não foram previstos como alvos directos miR-135a, de acordo com TargetScan programa em linha. Usando dois diferentes ARNsi contra o receptor, primeiro verificou-se que a expressão destes genes é desregulada na ausência de ERRα (Figura 3a). Em seguida, analisamos o nível de mRNA destes objectivos ERRα sobre a sobre-expressão de miR-135a. Como se mostra na fig 3b, a expressão destes genes foi dependente do tempo regulado por transfecção de pré-miR-135a. De nota, todas as desregulamentações induzidas-miR-135a estavam no mesmo sentido que as induzidas diretamente pela segmentação ERRα. Isto reforça ainda mais a hipótese de que o efeito de miR-135a sobre estes genes é ERRα-mediada. Analisamos também a expressão de quatro genes (ROCK1, rock2, pTK2 e SMAD5) relatado como miR-135a alvos diretos na literatura [10-11, 39]. Como esperado, a expressão destes genes é dependente do tempo pré-reduzido sobre o miR-135a sobre-expressão (Fig 3C). No entanto, nenhum destes quatro genes parecem desreguladas na ausência de ERRα, como esperado a partir de dados a ARN-sequenciação (Figura 3C e [37]). Em seguida, usamos uma abordagem de resgate para questionar a possibilidade de um efeito ERRα dependente de miR-135a. Para este fim, as células foram transfectadas por um mímico miR-135a complementado ou não por uma construção ERRα que não compreendem a sua 3’UTR natural (

i

.

e

. Sem miR-135a sequências complementares). Consistentemente, a desregulamentação das metas ERRα foi resgatado por re-introdução do receptor (Fig 3d). Em contraste, a expressão de miR-135a alvos directos (ROCK1, rock2, pTK2 e SMAD5), reduzidas sobre a superexpressão do pré-Mir, não foi restaurada por ERRα transfecção. Em conjunto, estes dados mostram que os impactos miR-135a sobre a expressão gênica em maneiras ERRα-dependentes e independentes.

a. As células MDA-MB231 foram transfectadas com o ARNsi indicados (C: ARNsi de controlo) e RNA foram extraídos após 48 h. b. As células foram transfectadas com pré-miR-135a ou controlar pré-miR (-). Os ARN foram extraídos no tempo indicado após a transfecção. Expressão de alvos ERRα foi examinada (a, b). c. A mesma experiência da análise da expressão de genes alvo directos miR-135a. d. As células foram transfectadas por pré-miR-135a e pSG5Flag vazio vetor (miR-135a) ou plasmídeo ERRα-encoding (miR-135a + ERRα). Como controlos, as células foram transfectadas por controlo pré-miR suplementado com pSG5Flag vector plasmídico. Os ARN foram extraídos após 48 h. Expressão dos genes indicados foi determinada por PCR em tempo real. Os dados são apresentados em relação ao controlo e expressa em relação à expressão de RPLP0. É mostrada a média de três experiências independentes em triplicado com barras de erro indicam SEM. *:

p Art 0,05, **:

p Art 0,01, ***:

p Art 0,005, ns:. Non significativa

a seguir, questionou se os efeitos funcionais de miR-135a pode depender ERRα. Este receptor tem sido mostrado para ser necessário para várias características relacionadas com a progressão do cancro, incluindo migração celular e invasão [36-37]. Por outro lado, o miR-135a tem sido mostrado para reduzir a invasão celular [9, 11]. Usando Boyden ensaios de invasão de câmara, que, assim, examinar se parte destas últimas actividades podem ser mediado pela inibição ERRα. Que sobre-expressam o miR-135a imitar em células MDA-MB231 conduziram a uma redução da expressão ERRα, bem como para a inibição da invasão de células, em comparação com os controlos (Fig 4A). Em contraste, re-exprimir uma ERRα não segmentado construir totalmente restaurado potencial invasão celular. experiências idênticas realizadas na linha de células de próstata humano PC3 produziu resultados semelhantes (Fig 4B). Concluímos que o miR-135a pode inibir a invasão de células, pelo menos em parte, através da inibição da expressão ERRα.

MDA-MB231 (uma) ou PC3 (b) As células foram transfectadas com controlo de miR (miR-C ) ou mímica miR-135a (ambos suplementados com plasmídeo pSGFlag vazia) ou mímica miR-135a suplementado com pSGFlag-AA /B-ERRα (excluído de seu 3’UTR). Expressão das proteínas indicadas é mostrado nos painéis superiores. As células foram deixadas a invadir Matrigel em ensaios de câmara de Boyden. células invasoras foram fixadas e coradas. microfotografias típicas são apresentadas à esquerda. A quantificação foi realizada em todo bem usando o Image J. Os resultados são expressos em relação ao controlo das condições de miR com barras de erro indicam SEM. **:

p Restaurant 0,01, *:

p Restaurant 0,05, NS:.

Discussão

resultados não significativos discrepantes foram publicados sobre o papel do miR-135a na progressão do cancro. Com efeito, este microARN foi reportado para promover ou inibir a traços de agressividade do cancro [6-12]. Aqui, mostramos que o miR-135a reduz a expressão de ERRα nos níveis de ARNm e de proteína, resultando na modulação da expressão de genes alvo o receptor. Curiosamente ERRα exibe um padrão de expressão em cancros que é oposta à do miR-135a. De facto, os níveis de receptores (de ARNm e de proteína) são mais elevados em tumores (em relação ao tecido normal) e a sua alta expressão correlaciona-se com um mau prognóstico em vários tipos de cancros, tais como os da mama ou da próstata (revisto em [26-28 ]). Esta expressão elevada pode resultar de vários mecanismos, tais como a amplificação genómica [40], um loop autoregulatory transcrição [41], ea infra-regulação de microRNAs que visam ERRα [25, 42]. Aqui propõe-se que uma diminuição na expressão de miR-135a pode desreprimir a do receptor. Coerente com a sua definição como um factor de mau prognóstico, ERRα promove diversas características de progressão do câncer, tais como EMT, angiogênese, mude para glicólise aeróbica (efeito Warburg) e resistência à hipoxia [31-35]. Não se sabe se o miR-135a é realmente envolvidos em contrariar o aparecimento destes processos. No entanto, o miR-135a reprime invasão de células [11], um parâmetro que é, em contraste, promovido por ERRα [36-37]. Nossos resultados atuais mostram que a inativação de ERRα por miR-135a é instrumental na prevenção de invasão celular uma vez que este fenômeno pode ser restaurado pela re-introdução de um receptor não-segmentado. Pelo menos dois mecanismos não-mutuamente exclusivas foram evocados para explicar as atividades pró-invasivos do receptor. Por um lado, ERRα Wnt11 induz sinalização que regula directamente a invasão de células por meio de um loop auto-regulatório envolvendo β-catenina [36]. Por outro lado, o receptor regula positivamente a expressão de TNFAIP1, o que reduz a estabilidade da proteína RhoA, bem como a actividade da sua ROCK1 efector a jusante [37]. Na ausência de ERRα o aumento da actividade ROCK1 leva a uma inibição da invasão de células. Curiosamente, foi demonstrado recentemente que o miR-135a induz directamente a degradação de ARNm ROCK1, também resulta na inibição da invasão de células [11]. A este respeito, a redução de expressão de miR-135a em cancros podem resultar em expressão ROCK1 descontrolada que pode tornar-se excessivo e, assim, inibir a invasão celular. No entanto, a redução de miR-135a também prováveis ​​clientes potenciais, em paralelo, a um aumento da expressão ERRα. Por sua vez o receptor reduz a atividade ROCK1 para um nível que é apropriado para a invasão da célula. Em resumo miR-135a e ERRα pode formar uma rede de regulação multi-nivelado que a atividade afina ROCK1.

Lendo a literatura, parece possível que esta rede reguladora ERRα miR-135a- pode ser eficaz em um completamente contexto diferente. De facto, tem sido mostrado que o miR-135a directamente sub-regula a expressão do gene mestre da diferenciação de osteoblastos, Runx2, impedindo assim a osteogénese [39].

Per se

, a diminuição induzida por BMP-2 observada na expressão de miR-135a pode, assim, levar a Runx2 descontrolada sobre-expressão e diferenciação de osteoblastos, portanto, prematuro. Por outro lado, dados independentes revelaram que tanto a expressão Runx2 e atividade são reprimidos por ERRα ([43-45], revisto em [14]). A diminuição na expressão de miR-135a pode assim desreprimir directamente a expressão de ambos Runx2 e ERRα, este último por sua vez moderar a actividade do ex. Essa rede acabaria por resultar em atividade Runx2 fine-tuning, como descrito acima para ROCK1. Mais trabalho é necessário para demonstrar a precisão desta hipótese.

Informações de Apoio

Tabela S1. Oligonucleotídeos utilizados neste estudo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0156445.s001

(PDF)