Abstract

O câncer de ovário continua a ser o câncer ginecológico mais letal e novas terapias direcionadas moleculares contra esta doença miserável continuam a ser um desafio . Neste estudo, foram analisados ​​os padrões Expressional de interleucina-6 (IL-6) e seu receptor (IL-6R) expressão em tecidos de cancro do ovário, avaliou o impacto dessas expressões sobre os desfechos clínicos de pacientes e descobriu que um alto nível de expressão de IL-6R, mas não de IL-6 de expressão em células de cancro é um factor independente de prognóstico. Em

in vitro

análises utilizando linhas celulares de ovário, enquanto seis (RMUG-S, RMG-1, OVISE, A2780, SKOV3ip1 e OVCAR-3) de sete overexpressed IL-6R em comparação com um epitélio de superfície ovariana normal primária , apenas dois (RMG-1, OVISE) de sete linhas celulares sobre-expresso de IL-6, sugerindo que a IL-6 de sinalização /IL-6R exerce de uma forma parácrina, em certos tipos de células de cancro do ovário. ascite câncer de ovário foram coletadas de pacientes, e descobrimos que CD11b primária

+ CD14

+ células, que foram macrófagos predominantemente M2-polarizados, são a principal fonte de produção de IL-6 em um microambiente do câncer de ovário. Quando CD11b

+ CD14

+ células foram co-cultivadas com células de cancro, tanto a invasão e a proliferação de células cancerosas foram robustamente promovido e estas promoções foram quase completamente inibida por pré-tratamento com o anticorpo anti-IL-6R (Tocilizumab ). Os dados aqui apresentados sugerem uma base racional para a terapia de anticorpo anti-IL-6 /IL-6R para suprimir a disseminação peritoneal de cancro do ovário, e representam evidência do potencial terapêutico da terapia de anti-IL-6R para o tratamento do cancro do ovário.

Citation: Isobe A, Sawada K, Kinose Y, Ohyagi-Hara C, Nakatsuka E, Makino H, et al. (2015) interleucina 6 receptor é um fator prognóstico independente e um potencial alvo terapêutico de cancro do ovário. PLoS ONE 10 (2): e0118080. doi: 10.1371 /journal.pone.0118080

Editor do Academic: Goli Samimi, Garvan Institute of Medical Research, AUSTRÁLIA

Recebido: 01 de outubro de 2014; Aceito: 05 de janeiro de 2015; Publicação: 06 de fevereiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Isobe et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por um Grant-in-Aid para a investigação científica do Ministério da Educação, Ciência, Desporto e Cultura do Japão (21791555 e 23592447 para KS, 22390308 para HK , e 23659779 para TK). Este trabalho também foi parcialmente financiado pelo Medical Foundation Osaka Investigação para doenças intratáveis ​​(a KS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a principal causa de morte por doenças malignas ginecológicas. dados convincentes recentes suportam o envolvimento do microambiente inflamatório estromal, causada pela sobre-expressão de citocinas ou quimiocinas, na promoção da tumorigénese do ovário, cancro progressão e resistência às quimioterapias. [1] Assim, tendo como alvo destas citocinas a partir do microambiente do estroma podem oferecer um promissor estratégia terapêutica para melhorar a gestão de pacientes com cancro do ovário

Entre as citoquinas relatados até agora, Interleucina-6 (IL-6) é uma das citocinas imunorreguladoras pivot presentes no microambiente do cancro do ovário.; induz várias vias que conduzem ao tumor a proliferação, a angiogénese e quimioresistência. [2] Os níveis séricos elevados e ascite de IL-6 foram encontrados em pacientes com cancro do ovário do que em pacientes com outras doenças malignas, e os níveis de ter sido demonstrado que correlacionado com a extensão da doença e prognóstico clínico. [3-5] Embora Rath et al. mostraram recentemente que a expressão de IL-6-R é altamente expresso em tecidos de cancro do ovário, quando comparada com os tecidos normais ou doenças benignas, [6], o impacto clínico da expressão IL6-R em espécies de cancro do ovário não foi examinada. Portanto, fomos encorajados a investigar os valores clínicos de IL-6 e IL-6R em tecidos de cancro do ovário usando os microarrays de tecido (TMAs) nós construídos e os dados clínicos correspondentes.

Parece que antagonizar IL-6 /sinalização de IL-6R pode ter actividade terapêutica em doentes com cancro do ovário, através da inibição de uma rede de citocinas promotoras de tumor. Com efeito, alvo de IL-6 anti-anticorpo terapia tem sido utilizada em ensaios clínicos e verificou-se ser bem tolerada em doentes de vários cancros, incluindo o cancro do ovário. [7] Tocilizumab (Chugai Pharmaceutical, Shizuoka, Japão), é um anti humanizado e anticorpo de IL-6R humano liga-se ao site de IL-6 de ligação de IL-6R humano. É conhecido para inibir competitivamente a IL-6 /sinalização de IL-6R e neutraliza completamente a IL-6 actividades. [8, 9] Uma série de estudos clínicos demonstrou com sucesso que a supressão da sinalização de IL-6 /IL-6R por Tocilizumab é terapeuticamente em eficaz aliviar a doença de Castleman e artrite reumatóide. [10, 11] Tendo em conta o seu sucesso no tratamento destas doenças, tocilizumab podem revelar-se úteis no tratamento de cancros relacionados com a IL-6 e que nos motivou a elucidar o potencial terapêutico de tocilizumab contra o cancro do ovário.

Embora não só as células de cancro do ovário mas macrófagos associados a tumores têm sido relatados para produzir IL-6, [12, 13] que permanece discutível se aumentou os níveis de IL-6 em pacientes com cancro do ovário são produzidas pelo tumor si ou principalmente pelos tecidos do hospedeiro. A maioria dos pacientes com câncer de ovário em estágios avançados apresentam doenças metastáticas peritoneal, muitas vezes acompanhada de ascite maciças. [14] ascite maciças de pacientes consistem em não apenas as células cancerosas, mas também fibroblastos, células endoteliais e predominantemente células do sistema imunológico, os quais são cruciais para o crescimento do cancro, progressão e metástase. [15] Os macrófagos peritoneais são pensados ​​para desempenhar um papel fundamental neste contexto, como é evidenciado por vários estudos que revela que a depleção de macrófagos em modelos de cancro do ovário peritoneais suprime a progressão e a acumulação de ascite do cancro. [16, 17] os macrófagos que se infiltram tecidos de tumor, as quais são referidas como macrófagos associados a tumores (TAM), são contribuintes bem conhecidas para a progressão do tumor e estão associados com o mau prognóstico de vários cancros. [18, 19] Uma vez que TAM são conhecidos liberar várias citocinas pró-angiogénico e fatores de crescimento, temos a hipótese de que os macrófagos pode ser uma das fontes potenciais responsáveis ​​da enriquecido acumulação de IL-6 em ascite cancro do ovário.

neste contexto, buscou-se analisar o padrão expressional da IL 6R, bem como a utilização de câncer de ovário TMAs e avaliar o impacto dessas expressões sobre os resultados clínicos dos pacientes. ascite câncer de ovário foram coletadas de pacientes submetidos à cirurgia e descobrimos que CD11b primária

+ CD14

+ células, que eram predominantemente M2 polarizado TAM, foram a principal fonte de produção de IL-6 em um microambiente do tumor de ovário e robustamente promoveu a invasão do cancro do ovário e proliferação. Os dados aqui apresentados sugerem uma base racional para a terapia de anticorpo anti-IL-6 /IL-6R para suprimir a disseminação peritoneal de cancro do ovário e fornecer evidência do potencial terapêutico da terapia de anti-IL-6R para curar esta doença infeliz.

Materiais e Métodos

ética Declaração

as amostras dos pacientes foram obtidas com consentimento informado por escrito, em conformidade com os requisitos do comitê de ética dos institutos e da Declaração de Helsinki. Institutional Review Board (IRB) de Osaka University Graduate School of Medicine aprovou este protocolo de estudo em 2011/02/15 (nº 10064). IRB de Gifu University Graduate School of Medicine aprovou em 2012/07/02 (No. 26-50).

Materiais

Os anticorpos contra a IL-6 (R-49L), IL 6R (C-20) e STAT3 total (C-20) eram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). IL-6 recombinante humana foi obtida da Chemicon (Temecula, CA) e recombinante humano sIL-6R foi de R D systems (Minneapolis, MN). Anticorpos contra-total p44 /42 MAPK (ERK 1/2) (3A7), fosforilada (Thr202 /Tyr204) p44 /42 MAPK fosforilada (Tyr705) STAT3 (p-ERK 1/2) (E10), (p-STAT3) e β-actina foram de Cell Signaling (Beverly, MA). anticorpo humanizado anti-humano IL-6 receptor, Tocilizumab, foi gentilmente fornecida pela Chugai Pharmaceutical Co. Ltd. (Shizuoka, Japão) e de IgG humana não imune foi adquirido a partir de Jackson Immuno Research (West Grove, PA). Anticorpo contra CD68 (25747-1-AP) foi adquirido a partir de Proteintech Group Inc. (Chicago, IL, EUA). proteínas de crescimento reduziu-fator da membrana basal (Matrigel) e câmaras 24 transpo� foram adquiridos da BD Biosciences (Bedford, MA).

cultura celular

O ovário linhas celulares de cancro, A2780 e CaOV3, foram adquiridos da American Type Culture Collection (Rockville, MD). RMUG-S, OVISE e linhas celulares RMG-1 foram obtidos a partir da pesquisa da ciência Saúde Banco de Recursos (Osaka, Japão). células OVCAR-3 eram de celular Resource Center for Biomedical Research, Instituto de Desenvolvimento, Envelhecimento e Câncer, Universidade de Tohoku (Sendai, Japão). células SKOV3ip1 foram gentilmente cedidas pelo Dr. Ernst Lengyel (University of Chicago, Chicago, IL). As células foram cultivadas em DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10% e 1000 U /ml de penicilina /estreptomicina, incubadas em 95% de ar /5% de CO

2 a 37 ° C. A2780, CaOV3, OVCAR-3 e SKOV3ip1 células foram estabelecidas a partir de adenocarcinomas papilares serosos de ovário humano. células RMUG-S foram de um cistadenocarcinoma mucinoso do ovário humano. células OVISE e RMG-1 eram de carcinoma de células claras de ovário humano. As células primárias de ovário epitélio de superfície (OSE) foram obtidos a partir de amostras de ovário normais de pacientes submetidos à cirurgia para condições benignas do Hospital da Universidade de Osaka. consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente antes de sua operação. O método de cultura seguiu o protocolo escrito por Shepherd TG, et al. [20] As subculturas foram obtidos por tripsinização e foram usados ​​para experiências em passagens 3 a 5.

Pacientes e tissue microarray

ovário amostras de carcinoma foram coletadas de pacientes tratados no Hospital Universitário de Gifu (Gifu, Japão), entre 2006 e 2011 e foram utilizados para construir as lâminas de tissue microarray (TMA). Resumidamente, os espécimes ressecados foram fixados em formalina a 10% tamponada e regiões representativas foram processados ​​para embebimento em parafina. A partir das regiões correspondentes em blocos de parafina, núcleos de tecido (de diâmetro, 3 mm) foram removidos utilizando uma agulha oca, dispostos em blocos de parafina (TMA) e cortado (4 mm de espessura) em lâminas. aprovação Institutional Review Board foi obtido a partir do Instituto. núcleos de tecidos satisfatórios foram finalmente obtidos a partir de 94 pacientes, e os dados clínicos correspondentes foram recolhidas.

Imunohistoquímica

Os slides TMA foram desparafinados em xileno e desidratadas com etanol a 100% antes de desmascaramento antígeno foi realizada por fervendo as lâminas em alvo Retrieval Solution (pH 9,0) (Dako, Glostrup, Dinamarca). Depois de ser colocada em 3% H

2O

2 e sendo bloqueado com uma solução de (Dako) de bloqueio, que foram incubadas com o anticorpo de IL-6 e IL-6R primária em 1: 200 durante 18 horas a 4 ° C e com o anticorpo CD68 no primário 1: 200 durante 30 min à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS, foram coradas utilizando o sistema Envision (Dako) e depois contra-coradas com hematoxilina de Mayer. Placentas complicado com corioamniotite foram utilizadas como um controlo positivo. As lâminas foram intensamente examinadas por dois patologistas independentes e qualificados (EM, YK) sem o conhecimento dos resultados clínicos e cada amostra foi classificada com base na percentagem de células positivas (0, 25%; 1, ≥25%) e a intensidade da coloração (0, none; 1, fraco, 2, forte). expressão “alta” de IL-6 foi definido se a pontuação composição de densidade de intensidade e foi ≥1. expressão “Baixa” foi definido se a pontuação composição de pontuações de densidade de intensidade e era 0. expressão de IL-6R “alta” foi definido se a pontuação composição de densidade de intensidade e foi = 2. expressão “Baixa” foi definido se a composição pontuação das pontuações densidade e intensidade foi ≤1.

análise-PCR em Tempo real Transcrição reversa (RT)

O RNA total foi isolado com Trizol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA). Um? G de RNA total foi transcrito reverso com ReverTra Ás qPCR TA Mistura Principal (Toyobo, Japão). Para análise de expressão de ARNm quantitativa, TaqMan RT-PCR foi realizada no sistema de PCR em Tempo Real StepOnePlus ™ seguindo as instruções do fabricante. Ensaios de Expressão Gênica TaqMan Probe-base foram utilizados para a IL-6; Hs 00174131_m1 e IL-6R; Hs 01075667_m1 (Applied Biosystems). GAPDH foi usada como um controlo interno. níveis relativos de expressão do gene ARNm foram calculados utilizando a 2

-.

ΔΔCT

método tal como descrito anteriormente [21]

análise de RT-PCR

O ADNc foi sintetizado a partir de 1 mg RNA usando um ReverTra Ace qPCR Mix RT master (Toyobo, Osaka, Japão) com iniciadores aleatórios. Para a expressão de IL-6R, os iniciadores foram concebidos para emparelhar com a splicing para região de IL-6R, a fim de detectar não só numa forma ligada à membrana (IL-6R), mas também uma forma solúvel (sIL-6R). As sequências dos iniciadores e os produtos de PCR esperados foram os seguintes; sentido IL-6R, 5′-TCCACCCCCATGCAGGCACT-3 ‘(bases 1419 a 1438) e anti-sentido de IL-6R; 5’-GTGCCACCCAGCCAGCTATC-3 ‘(bases 1840 a 1859), o tamanho; IL-6R, 441 bp, sIL-6R, 341 pb. β-actina-sentido: 5’-CGTGACATTAAGGAGCTGTG-3 ‘, β-actina-anti-sentido: 5′-GCTCAGGAGGAGCAATGATCTTGA-3’, tamanho de 376 pb. As sequências de cDNA foram encaminhados para GenBank (acesso. X12830 para IL-6R e sIL-6R e NM_001101 para β-actina). Os modelos de ADNc foram amplificadas por PCR com Taq PCR Master Mix (Qiagen, Valencia, CA) contendo 1 mM de cada um de dATP, dCTP, dGTP e dTTP, e 2,5 U de Taq DNA polimerase, e cada iniciador específico a 0,2 um sob as seguintes condições : 35 ciclos de 94 ° C durante 45s, 60 ° C durante 45s e 72 ° C durante 60s. Os produtos foram sujeitos a electroforese em géis de agarose a 2% e visualizados por coloração com brometo de etídio e iluminação ultravioleta.

Análise Western Blot

Um total de 4 x 10

5 células foram plaqueadas em 6- bem placas e foram lisadas com 1 × tampão de lise celular (Cell Signaling). Os lisados ​​(30? G) foram separados por 5-20% de SDS-PAGE e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno, seguido por incubação com os anticorpos primários (P-STAT3, 1: 1000 em 5% de albumina de soro bovino (BSA); STAT3, 1 : 1000 em 5% de BSA; p-ERK, 1: 2000 em 5% de BSA, ERK, 1: 2000 em 5% de BSA; p-actina, 1: 10000 em BSA a 5%) e, em seguida, com uma peroxidase de rábano secundária correspondente conjugado IgG. As proteínas foram visualizadas com a Western relâmpago Além disso ECL (PerkinElmer Life Science, Waltham, MA).

celular Ensaio de Proliferação de células

SKOV3ip1 ou RMG1 foram plaqueadas em placas de 24 poços (1 x 10

4 células /cavidade) em 10% de FBS /DMEM durante 24 h e depois incubadas em 0,1% BSA /DMEM, na presença ou ausência de IL-6 com ou sem o anticorpo anti-IL-6R durante 72 h. A proliferação celular foi avaliada por um ensaio MTS modificada usando uma célula Titer 96AQ kit (Promega, Madison, WI), em conformidade com as instruções do fabricante. Em experiências de co-cultura, filtros de policarbonato com poros de 1-im (células não podem passar através dos filtros) foram colocadas em placas de 24 poços, e números iguais de células primárias foram semeadas como um estimulante. A proliferação celular foi expressa como a razão entre o número de células viáveis.

ensaio de invasão de Matrigel

Resumidamente, filtros de policarbonato com poros de 8 mícrons foram revestidas com 25 ug de matrigel (BD Biosciences). células SKOV3ip1 ou RMG1 (1 x 10

5 células /poço) foram semeadas em câmaras superiores em 0,1% BSA /DMEM e incubadas no mesmo meio contendo IL-6 como um quimioatractivo na câmara inferior 72 para h.Thereafter , os filtros foram fixados e corados com uma solução de hematoxilina de Carazzi. Noninvading células foram removidos usando um cotonete de algodão, e invadir as células no lado inferior do filtro foram contados utilizando um microscópio invertido. Cinco campos microscópicos orbitais de cada filtro foram escolhidos aleatoriamente. Em experiências de co-cultura, um número igual de células primárias foram semeadas na câmara inferior como um quimioatrativo.

enzima ligada ensaio imunossorvente (ELISA)

Para o ensaio quantitativo de VEGF-A, SKOV3ip1 células (1 x 10

5 células) foram cultivadas sob meio isento de soro na presença ou ausência de IL-6 durante 72 h. O anticorpo anti-IL-6R (10 ug /ml) ou uma quantidade equivalente de IgG de controlo foi aplicado simultaneamente. Depois disso, os meios de cultura condicionados foram recolhidos e armazenados a -80 ° C até à análise. O VEGF-A platina kit ELISA Humana (eBiosecience, SanDiego, CA) foi utilizado para determinar a concentração do VEGF-A, de acordo com o protocolo do fabricante, com uma sensibilidade de 7,9 pg /mL. Para o ensaio quantitativo da IL-6 humana ou sIL-6R humano, 1 x 10

5 SKOV3ip1 de células primárias e as células foram cultivadas sob meio isento de soro durante 72 h, e estas concentrações em meio de cultura foi medida utilizando IL-humano 6 ELISA Pronto-SET-GO com uma sensibilidade de 2 pg /mL ou Human sIL-6R instantâneo ELISA (eBioscience) com uma sensibilidade de 10 pg /mL.

O isolamento de células primárias de ascite de cancro do ovário

as amostras dos pacientes foram obtidas com consentimento informado por escrito de acordo com o Hospital Universitário Osaka exigências de comitê de ética e da Declaração de Helsinki. Ascite foram recolhidos assepticamente, e as células foram isoladas por padrão de Ficoll-Paque em gradiente de densidade (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia). Em seguida, CD11b positivo (CD11b

+) células, bem como as células CD14 positivas (CD14

+) foram purificadas por selecção positiva utilizando magnética de células activada por triagem (MACS) tecnologia (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Alemanha). Finalmente, CD11b

– células, CD11b

+ CD14

– células e CD11b

+ CD14

+ células foram recolhidas. As células foram cultivadas em FBS a 20% de RPMI 1640 e usado para experiências nas passagens 2 a 3.

de células activadas por fluorescência (FACS)

para a coloração de superfície de células, suspensões de célula única foram incubadas com ficoeritrina (PE) -conjugated anticorpo anti-CD11b monoclonal (ICRF44) (BD Biosciences), aloficocianina (APC) -conjugated anticorpo monoclonal anti-CD14 (M5E2) (BD Biosciences), Alexa Fluor 488 conjugado-CD68 monoclonal anti- anticorpo (Y1 /82A) (Miltenyi Biotec) e eFluor-450 conjugado com anticorpo anti-CD206 (19,2) (eBioscience, San Die go, CA) durante 30 minutos a 4 ° C. Após lavagem, as células foram ressuspensas em 500 ul de 1% de BSA /PBS. As células coradas foram corridos num fluxo FACSCanto citómetro II (BD Biosciences). Os dados foram analisados ​​usando o programa de software FlowJo (TreeStar, Ashland, OR):

A análise estatística

Statcel versão 3 (OMS-Publishing Inc., Saitama, Japão) e JMP versão 10.0.2. (SAS Institute Japan Ltd., Tóquio, Japão) foram utilizados para análises estatísticas. As diferenças foram analisadas pelo teste de Mann-Whitney. estimativas de sobrevivência foram calculadas pelo método de Kaplan-Meier, e as comparações entre os grupos foram analisadas pelo teste de log-rank. A análise multivariada foi realizada utilizando um modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas na bicaudal

P Art 0,05.

Resultados

alta expressão do receptor IL-6 é um marcador de prognóstico independente de pacientes com câncer ovariano

A fim de avaliar o potencial terapêutico da IL-6R, nós estabelecemos lâminas TMA de 94 pacientes de cancro do ovário japonês. As características dos doentes estão resumidos na Tabela 1. Expressão de IL-6R foi avaliada por imuno-histoquímica e cada amostra foi classificada com base na percentagem de células positivas e a intensidade da coloração. Tipicamente, a coloração das membranas clara foi observada nos casos de expressão de IL-6R positivo (Fig. 1A). De 94 pacientes, 32 (34,0%) mostraram expressão “alto” IL-6R, incluindo 14 de 34 serosa (41,1%), 3 de 16 mucinoso (18,8%), 1 de 11 endometrioid (9,1%), 10 de 20 de clara celular (50,0%) e 4 de 13 outro (30,8%) carcinomas do ovário. Em contraste, 62 (66,0%) dos casos expressos “baixa” ou negativa expressão IL-6R. Entre os pacientes com câncer de ovário, aqueles que tinham “alta” a expressão de IL-6R mostrou PFS significativamente piores do que aqueles que tinham “baixa” ou negativa expressão IL-6R (PFS, 23,8 vs 32,3 meses,

P

= 0,0029, Fig. 1B). Do mesmo modo, a expressão de IL-6 foi avaliada por imuno-histoquímica e cada amostra foi marcado. coloração citoplasmática foi observada nos casos de positivas para IL-6 de expressão (Fig. 1C). De 94 pacientes, 39 (41,4%) apresentaram “alto” expressão de IL-6, incluindo 13 de 34 serosa (38,2%), 8 de 16 mucinoso (50,0%), 5 de 11 endometrioid (45,5%), 11 de 20 de clara celular (55,0%) e 2 de 13 outros (15,4%) carcinomas ovarianos. Em contraste, 55 (58,5%) casos expressos “baixa” ou negativa expressão de IL-6. Embora o valor prognóstico da IL-6 foi examinada pelo método de Kaplan-Meier e as comparações realizadas pelo teste de log-rank, IL-6 expressão não mostrou correlações significativas com prognósticos de pacientes (Fig. 1D). Para uma análise multivariada foi realizada para selecionar um modelo para a sobrevivência com vários preditores. Idade, estágio FIGO, tipo histológico, tumor residual no momento da cirurgia, “alto” IL-6 expressão e de expressão “alto” IL-6R foram inseridos neste modelo. O modelo final incluiu “alta” a expressão de IL-6R, mas não IL-6 expressão é um preditor significativo independente para redução PFS em pacientes com câncer de ovário (

P

= 0,017,

HR

; 2.388 ( 1,171-4,895), Tabela 2), juntamente com o estágio clínico e cirurgias.

(A) coloração imuno-histoquímica de microarrays de tecido com cortes de tecidos ovarianos malignos. áreas representativas de quatro diferentes cancros do ovário coradas utilizando um anticorpo de IL-6R anti-humano e teve como “baixo” ou “alta”. Placentas complicado com corioamniotite foram utilizadas como um controlo positivo. As setas indicam a coloração das membranas em trofoblastos. Um controle negativo é soro não imune. (B) IL-6 a expressão do receptor correlaciona-se com mau prognóstico em pacientes com câncer de ovário. curvas de Kaplan-Meier de sobrevida livre de progressão (

deixou

) e sobrevida global (

direita) de pacientes com câncer de ovário tratados no Hospital Universitário de Gifu (n = 94). (C) áreas representativas de quatro cancros do ovário diferentes coradas utilizando um anticorpo IL-6 anti-humana e marcou como “Baixo” ou “Alto”. Placentas complicado com corioamniotite foram utilizadas como um controlo positivo. As setas indicam uma coloração citoplásmica nas células mesenquimais vilosas. Um controle negativo é soro não imune. (D) de IL-6 de expressão não afecta o prognóstico em pacientes com cancro do ovário. curvas de Kaplan-Meier de sobrevida livre de progressão (

esquerdo) e sobrevida global (

direito

) dos pacientes. ampliação original, × 200. barra de escala em cada painel representa 50 um.

IL-6 receptor mas não IL-6 é altamente expresso em linhas celulares de cancro do ovário

Uma vez que “alta “expressão de IL-6R, mas não de IL-6 afectado o prognóstico de pacientes com cancro do ovário, que quantifica as expressões de IL-6 e IL-6R em linhas celulares de cancro do ovário por em tempo real de RT-PCR. O nível de expressão de células primárias OSE foi definida como 1,0. Enquanto apenas dois dos sete linhas celulares (RMG-1 e OVISE) expressaram niveis elevados de IL-6 em comparação com células OSE (Fig. 2A), seis (RMUG-S, RMG-1, OVISE, A2780, SKOV3ip1 e OVCAR-3 ) de sete linhas de células mostraram marcadamente elevada expressão de IL-6R (11,0-270,1 vezes) (Fig. 2B). tendências similares foram confirmados por transferência de Western (Fig. 2C). A forma ligada a membrana de expressão IL6R é grandemente restringida aos hepatócitos, células do sistema imune e algumas células tumorais. [6] Por conseguinte, a isoforma solúvel (sIL-6R) é considerado como desempenham papéis importantes em contextos inflamatórias, permitindo que uma resposta aumentada de IL -6 em todos os tipos de células. De modo a determinar se as linhas celulares de cancro do ovário predominantemente expresso de comprimento completo (IL-6R) ou a isoforma diferencialmente spliced ​​que não possui o domínio transmembranar (sIL-6R), que concebido iniciadores que lesões splicing código e realizada por RT-PCR (Fig . 2D). Em todas as linhas celulares excepto OSE, verificou-se que tanto a IL-6R e o sIL-6R foram expressos. A expressão de sIL-6R foi ainda confirmada por ELISA quantitativo. Todas as linhas de células de cancro do ovário testadas produzida uma certa quantidade de sIL-6R (6,3-94,0 pg /10

5 células, a Fig. 2E). Assim, o tratamento com IL-6 (100 ng /ml) sozinho drasticamente induziu a fosforilação da STAT3, uma molécula jusante chave no /IL-6R via de sinalização de IL-6, bem como a de ERK em células SKOV3ip1 (Fig. 2F), e a adição exógena de sIL-6R não foi necessário para estas fosforilações. O pré-tratamento de anticorpo anti-IL-6R inibido as reacções de um modo dependente da dose, indicando que a IL-6R é altamente expressa em certos tipos de células de cancro do ovário e que a sinalização de IL-6 /IL-6R exerce de um modo parácrino na estas células, embora as células não produzem IL-6.

em tempo real de RT-PCR de IL-6 (a) e IL-6R (B). O ARN total foi recolhido a partir de sete linhas de células de cancro do ovário diferentes, utilizando TRIzol e submetido a em tempo real de RT-PCR. O método -ΔΔCT 2

foi utilizada para calcular a abundância relativa em relação à expressão de GAPDH. diferenças vezes em relação em relação ao principal epitélio de superfície do ovário (OSE) são apresentados. (C) Western Blot. Os lisados ​​celulares de células de cancro do ovário sete foram resolvidas por SDS-PAGE e imunotransferidas com um anticorpo contra a IL-6 e IL-6R. p-actina foi utilizado como um controlo de carga. (D) por RT-PCR. O ARN foi recolhido e as expressões de comprimento completo-IL-6R (IL-6R) e de expressão solúveis de IL-6R (sIL-6R) em linhas celulares de cancro do ovário foram examinados. As condições de PCR foram como descrito em Material e Métodos. (E) ELISA ensaio de sIL-6R. Sete células de cancro do ovário (1 x 10

5 cada) foram plaqueadas em placas de 24 poços e cultivadas com 1 ml de meio isento de soro durante 72 h. Os meios condicionados foram recolhidos e a concentração de sIL-6R humano foi medido por ELISA. As experiências foram repetidas três vezes. n.d .; não detectado. (F) Western Blot. tratamento exógena de IL-6 activa de IL-6 /IL-6R de sinalização em linhas celulares de cancro do ovário. SKOV3ip1 células foram estimuladas com IL-6 (100 ng /mL) durante 30 minutos com ou sem pré-tratamento com anticorpo-IL-6R Ranti (1-100 ug /ml) de IgG não-imune como controlo. Os lisados ​​celulares foram recolhidos e uma quantidade igual de lisados ​​celulares (30 ug) foi resolvido por 10% SDS-PAGE e imunotransferidas com STAT3 anti-fosforilado anticorpo (p-STAT3) e p44 anti-fosforilada /42 MAPK (P-ERK1 /2) anticorpo. As membranas foram retirados e rehybridized com anticorpos de detecção das formas totais da proteína. Borrões são representativos de três experiências.

tratamento exógena de IL-6 induz a proliferação, invasão e produção de VEGF de células de cancro do ovário

Uma vez que a sinalização de IL-6 /IL-6R é conhecida para agir em um certo número de formas de intensificar a progressão do cancro, nós examinamos se a tratamento exógena de IL-6 aumenta a proliferação, invasão e angiogénese relacionada com o VEGF em células de cancro do ovário. Para este fim, as células SKOV3ip1 que não expressam níveis detectáveis ​​de proteína de IL-6 e RMG-1 de células que expressam um determinado nível de IL-6 foram empregues. Ambas as linhas celulares têm altos níveis de expressão de IL-6R como confirmado na Fig. 2A. tratamento exógena de IL-6 a invasão de células induzida de forma robusta de células de cancro do ovário de um modo dependente da dose (IL-6 100 ng /ml; SKOV3ip1, 4,27 ± 0,53 vezes, RMG-1, 2,99 ± 0,46 vezes), enquanto que a indução foi quase completamente inibida pelo pré-tratamento com o anticorpo anti-IL-6R (Fig. 3A). A adição exógena de sIL-6R não promover a invasão de células de cancro do ovário induzidas pela IL-6, sugerindo que a IL-6Rs (IL-6R e o sIL-6R) produzida a partir de células de cancro são suficientes para activar a IL-6 /IL sinalização -6R. tratamento exógena de IL-6 também aumentaram significativamente a proliferação de ambas as células de cancro do ovário de um modo dependente da dose (IL-6 100 ng /ml; SKOV3ip1, 1,60 ± 0,29 vezes, RMG-1, 1,64 ± 0,39 vezes) e o pré-tratamento de anti anticorpo -IL-6R quase aboliu essas melhorias (Fig. 3b). Em seguida, examinamos a produção de VEGF a partir de células SKOV3ip1. tratamento exógena de IL-6 (100 ng /ml, 72h) estimulou significativamente a produção de VEGF a partir de células cancerosas (controle; 239,4 ± 16,3 pg /1x 10

5 células, IL-6; 322,4 ± 11,8 pg /1×10

5 células) e o pré-tratamento de células de cancro com o anticorpo anti-IL-6R inibiu significativamente a produção de VEGF (Fig. 3C). Colectivamente, tratamento exógeno com IL-6 induziu a proliferação, invasão e VEGF produção de células de cancro do ovário, embora eles não expressam IL-6, e o co-tratamento com IL-6R solúvel não foi necessária. Estes dados sugerem que, em certos tipos de células de cancro do ovário, a sinalização de IL-6 /IL-6R pode aumentar a progressão do cancro de um modo parácrino.

(A) Um ensaio de invasão de matrigel foi feito usando um sistema de câmara de Boyden modificado . 1 x 10

5 de SKOV3ip1 (

esquerda) ou UR-S (

direita) as células foram colocadas na câmara superior em meio isento de soro e deixou-se durante 72 h invadir . Várias concentrações de IL-6 (1-100 ng /ml) ou 60 ng /ml de sIL-6R foram aplicados na câmara inferior como um quimioatractor. 10 ug /ml de anticorpo anti-IL-6R ou IgG não-imune foi co-tratados. As células não-invasoras foram removidos usando um cotonete de algodão, e invadir as células no lado inferior do filtro foram enumeradas. número relativo de invadir as células em relação ao controlo (sem tratamento com IL-6) são mostrados. (B)

In vitro

ensaio de proliferação celular. 1 x 10

4 células de SKOV3ip1 (

esquerda) ou RMG1 (

direita) as células foram plaqueadas em placas de 24 poços em 10% de FBS /DMEM durante 24 h e, em seguida, incubadas em meio isento de soro na presença ou ausência de várias concentrações de IL-6 (1-100 ng /ml) com ou sem o anticorpo anti-IL-6R ou IgG não-imune como controlo durante 72 h. A proliferação celular foi avaliada por um ensaio MTS modificado. A proliferação celular foi expressa como a razão entre o número de células viáveis. (C) ensaio ELISA de VEGF-A. 1 x 10

5 SKOV3ip1 células foram plaqueadas em placas de 6 poços e cultivadas com 2 ml de meio isento de soro na presença ou ausência de 100 ng /ml de IL-6 durante 72 h. O anticorpo anti-IL-6R ou IgG de controlo foi co-tratados. Os meios condicionados foram recolhidos e a concentração de VEGF-A foi medido por ELISA. As experiências foram repetidas três vezes, e os valores são médias ± desvio padrão de triplicados. n.s .; não significativa, *; P 0,05, **; P 0,01.

CD11b

+ CD14

+ células invasão e proliferação de células de cancro do ovário melhoradas através de IL-6

produção

Uma vez que a sinalização de IL-6 /IL-6R P P