Abstract

Fundo

Atualmente, está bem estabelecido que o cancro surge no tecido cronicamente inflamado. Um certo número de receptores (NLRs) inflammasomes NOD forma semelhante, os complexos multiproteicos intracelulares críticos para a geração de citocinas pró-inflamatórias maduros (IL-1 e IL-18). Como a inflamação crônica da mucosa gástrica é uma consequência da

infecção por Helicobacter pylori

, investigamos o papel dos polimorfismos genéticos e expressão de genes envolvidos na via de sinalização NLR em

H. câncer gástrico infecção e afins pylori

(GC).

Materiais e Métodos

Cinquenta e um polimorfismos genéticos foram genotipados em 310 etnia chinesa (87 casos GC não-cárdia e 223 controles com dispepsia funcional). Além disso, a expressão do gene de 84 moléculas envolvidas na via de sinalização NLR foi avaliada em células THP-1 desafiados com dois

H.

trens pylori s, GC026 (GC) e 26695 (gastrite).

Resultados

CARD8

-rs11672725,

NLRP3

-rs10754558,

NLRP3

-rs4612666,

NLRP12

-rs199475867 e

NLRX1

-rs10790286 mostraram associações significativas com o GC. Na análise multivariada,

CARD8

-rs11672725 continuou a ser um fator de risco (OR: 4,80, IC 95%: 1,39-16,58). Além disso,

NLRP12-

rs2866112 aumentou o risco de

H. pylori

infecção (OR: CI 2,13, 95%: 1,22-3,71). As análises estatísticas avaliar o efeito conjunto de

H. pylori

infecção e os polimorfismos selecionados revelou fortes associações com GC (

CARD8,

NLRP3

,

CASP1

e

NLRP12

polimorfismos). Em análises de expressão gênica, cinco genes que codificam NLRs foram significativamente regulada em

H. pylori

células -challenged (

NLRC4

,

NLRC5

,

NLRP9

,

NLRP12

e

NLRX1

). Curiosamente, persistente aumento da regulação do

NFKB1

com simultânea down-regulação da

NLRP12

e

NLRX1

foi observada em

H. pylori

células desafiou-GC026. Além disso, os genes alvo de NF-kB que codificam citocinas pró-inflamatórias, quimiocinas e moléculas envolvidas na carcinogénese foram acentuadamente regulada para cima em

H. pylori

células desafiou-GC026.

Conclusões

Federações Novel entre polimorfismos na via de sinalização NLR (

CARD8

,

NLRP3

,

NLRP12

,

NLRX1

, e

CASP1

) e GC foram identificados em indivíduos chineses. Nossos polimorfismos genéticos e resultados de expressão gênica destacar a relevância da via de sinalização NLR na carcinogênese gástrica e sua estreita interacção com NF-kB

Citation:. Castaño-Rodríguez N, Kaakoush NO, Goh KL, Fock KM, Mitchell HM (2014) O NOD-Like Receptor Sinalização Caminho no

Helicobacter pylori

Infection and Related Câncer gástrico: A case-Control Estudo e análises de expressão gênica. PLoS ONE 9 (6): e98899. doi: 10.1371 /journal.pone.0098899

Autor: David M. Ojcius, University of California Merced, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de março de 2014; Aceito: 08 de maio de 2014; Publicação: 05 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Castaño-Rodríguez et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Conselho do Câncer de Nova Gales do Sul, Austrália (Grant no.66 /04). NÃO. Kaakoush é apoiado por uma bolsa de carreira precoce do Nacional de Saúde e Pesquisa Médica do Conselho, na Austrália. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A incidência global de câncer gástrico (GC) varia amplamente entre os países. De acordo com estatísticas de câncer globais, um total de 952,000 novos casos de GC e 723.000 mortes relacionadas com o GC são estimados para ter ocorrido em 2012, representando 6,8% do total de casos de câncer e 8,8% do total de mortes relacionadas com o cancro [1]. Mais de 70% dos novos casos e mortes ocorrem em países em desenvolvimento, com as maiores taxas de incidência que está sendo relatado no Leste da Ásia, Europa Oriental, América Central e América do Sul [2].

O patógeno bacteriano

Helicobacter pylori

é um factor etiológico essencial para GC (IARC, 1994), no entanto, estudos anteriores sugerem que, além de

H. pylori

infecção e dietéticos fatores, a genética do hospedeiro contribuir para GC [3]. polimorfismos genéticos têm surgido nos últimos anos, como determinantes da susceptibilidade e gravidade da doença, o que é particularmente verdadeiro no malignidade gastrintestinal [4]. Portanto, polimorfismos em genes envolvidos na imunidade inata e adaptativa pode desempenhar um papel importante na patogénese de

H. pylori

infecção e desenvolvimento de

H. pylori

complicações relacionados com incluindo GC.

receptores de linha germinal codificado conhecidos como receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) fazem parte do sistema imune inato e são fundamentais para a detecção de motivos microbianas invariantes conhecido como patógeno padrões moleculares -associated (PAMPs). PRRs foram divididos em cinco subtipos genéticos e funcionais distintas: domínio de oligomerização (NOD) -como receptores (NLRs), receptores Toll-like, receptores de lectina tipo C, gene induzível-ácido retinóico (RIG) -I-like de ligação de nucleotídeos receptores e ausente em melanoma 2 (AIM2) -como receptores [5] [6].

a família NLR não só reconhecer PAMPs mas padrões moleculares também danos associados (amortece) no citoplasma, que são ligantes endógenos produzido após lesão do tecido ou morte celular [7]. A estrutura característica NLRs inclui um domínio central e oligomerização (NACHT) de ligação ao nucleótido que está presente em todos os membros da família NLR, um repetições ricas em leucina C-terminal (Lrrs) e de um recrutamento N-terminal da caspase (CARD) ou pirina (PYD ) domínio. Com base na análise filogenética de domínios Nacht, determinou-se que a família NLR compreende três subfamílias: 1) a família NOD que inclui NOD1-2, NOD 3 /NLRC3, NOD4 /NLRC5, NOD5 /NLRX1 e CIITA, 2) os NLRPs incluindo NLRP1-14 (também conhecido como NALPs), e 3) a subfamília IPAF que consiste em IPAF (NLRC4) e NAIP [7]. O inflammasome NLRP3, o inflammasome mais plenamente caracterizado, consiste da proteína andaime NLRP3, a apoptose associada proteína pontinho-like (ASC) e caspase-1. NLRP3 interage e recruta o ASC adaptador via PYD-PYD interação [8]. Esta interacção conduz ao recrutamento de caspase-1, um aspartato protease intracelular específico de cisteína, o que subsequentemente levar à maturação e libertação de citoquinas pró-inflamatórias, tais como IL-1β e IL-18.

H. pylori

infecção, as quatro primeiras barreiras físico-químicas são a camada de muco, as células epiteliais gástricas, os TLR e as NLRs. Um número limitado de estudos avaliaram a interação entre a via de sinalização NLR e

H. pylori

. Por exemplo, um estudo inicial por Basak et al. [9] mostrou que não só

H. pylori

lipopolissacárido (LPS) activa da caspase-1, mas que esta activação da caspase-1 está envolvida na maturação induzida por LPS de IL-1β. Mais tarde, Hitzler et ai. [10] mostraram que

H. pylori

activa da caspase-1, levando a IL-1β /IL-18 de processamento e secreção, tanto em células dendríticas em cultura (DCs) e

In vivo

. Consistentemente, dois estudos recentes, utilizando linhas de células humanas gástricas, confirmou a expressão aumentada de caspase-1, IL-1β e IL-18 em

H. pylori

células infectadas pelo [11], [12]. Além disso, um estudo recente realizado por Kim et al. [13] demonstraram que a secreção de IL-1β por DCs infectadas com

H. pylori

requer TLR2, NOD2 eo inflammasome NLRP3.

Portanto, estudos anteriores mostram claramente que, em resposta a

H. pylori

, caspase-1-activação dependente inflamassoma é crítica para a geração de citocinas pró-inflamatórias maduras que são cruciais para as respostas Th1 associados a imunopatologia gástrico. Uma vez que pouco é conhecido sobre o papel de inflammasomes e outras moléculas envolvidas na sinalização de via NLR em resposta a

H. pylori

infecção, e que os polimorfismos em genes funcionalmente relevantes de este braço do sistema imunitário têm o potencial de afectar a magnitude e direcção da resposta do hospedeiro contra a infecção, foi investigado o papel da via de sinalização NLR, incluindo inflammasome- moléculas relacionadas, em

H. pylori

desenvolvimento GC -relacionados avaliando 51 polimorfismos genéticos em indivíduos chineses, uma população de alto risco conhecido para GC, e abordar a expressão gênica de 84 moléculas envolvidas na NLR vias de sinalização em uma linha de células monocíticas após a exposição a

H . pylori

.

Materiais e Métodos

A genotipagem de polimorfismos envolvidos na instrução NOD-like Receptor Sinalização Pathway

Ética.

Este estudo foi aprovado pelo Comité de Ética Humana (HREC) da Universidade de Nova Gales do Sul (UNSW) (HREC 08.115 e HREC 02144). consentimento informado por escrito foi obtido de cada indivíduo recrutados para o estudo.

Os sujeitos do estudo.

Os indivíduos eram indivíduos de etnia chinesa que foram submetidos a endoscopia digestiva alta no Hospital Geral de Changi (Singapura) e do Hospital Universitário da Malásia (Kuala Lumpur), entre janeiro de 2004 e abril de 2007. os doentes que se sabe estarem infectados com o vírus da imunodeficiência humana, ou que havia sido prescrito não-esteróides anti-inflamatórios, agentes anti-microbianos ou supressores de ácido no período de dois meses antes do recrutamento foram excluídos.

Oitenta e sete pacientes recém-diagnosticados com uma primária não-cárdia GC (Classificação Internacional de Doenças, 9

th revisão, código 151) com base na confirmação histológica foram convidados a participar na o estudo. O grupo controle foi composto de 223 indivíduos com diagnóstico de dispepsia funcional (FD), que foi definida como sintomas persistentes ou recorrentes (dor ou desconforto centrado na parte superior do abdómen), na ausência de doença orgânica (incluindo a endoscopia digestiva alta), de acordo com Roma II sistema de classificação [14].

detecção de Helicobacter pylori

.

H. pylori

anticorpos IgG nestes indivíduos chineses foram determinadas usando um in-house enzima-imunoensaio [15] e immunoblot (MPD Helico Blot 2.1, MP Biomedicals, Austrália).

selecção Polimorfismos.

bases de dados eletrônicas (PubMed, Scopus, Science Direct, Ovid, Biosis Previews, bancos de dados Scirus, CINAHL, IMBIOMED, ​​Scielo e LILACS) foram pesquisados ​​até fevereiro de 2013 para polimorfismos envolvidos na via de sinalização NLR que foram associados com o cancro, doenças infecciosas ou eram funcionalmente relevantes. Cinqüenta e um polimorfismos em 6 genes, que foram relatados para ter uma menor freqüência do alelo . 1% no Centro Nacional de Biotecnologia da Informação (NCBI) dbSNP, foram selecionados para análise (Tabela S1 nas Tabelas S1)

técnicas de genotipagem.

para a genotipagem de polimorfismos os 51 seleccionados na via de sinalização de cada indivíduo NLR incluídos no estudo, o DNA genómico foi extraído de amostras de sangue total periférico usando o kit QIAamp Blood DNA Mini como descrito pelo fabricante (Qiagen; Chadstone, Austrália). O DNA foi re-hidratadas em água estéril e normalizadas para 10 ng /ul para genotipagem de SNP personalizado por meio da aplicação de matriz de dessorção a laser assistida por ionização de tempo-de-voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa, o Sequenom MassARRAY Iplex? Ensaio (San Diego, CA , EUA) [16], [17] no Centro australiano Genome Research Ltd, St Lucia, da Universidade de Queensland, Austrália.

Um polimorfismo que não puderam ser incluídos no ensaio Sequenom MassARRAY Iplex, conhecido como

NLRP3-

42 bp-VNTR, foi genotipados através da PCR padrão. Os iniciadores foram concebidos com Software Análise Oligo Primer versão 6.71 (Insights Biologia Molecular, Inc; Colorado Springs, EUA). Os experimentos foram realizados usando o 2720 Termociclador (Applied Biosystems, Foster City, EUA). Os produtos de PCR foram submetidos a electroforese em gel de agarose a 1,5% e visualizado sob transiluminação UV utilizando o Sistema de Gel Doc 2000 (Bio-Rad; Hercules, EUA). As sequências dos iniciadores e condições de ciclos térmicos para genotipagem desse polimorfismo estão descritos na Tabela S2, em nas Tabelas S1.

Quatro polimorfismos (

CARD8

-rs2043211,

CARD8

-rs6509368 ,

CARD8

-rs12984929 e

NLRP3

-rs10754558) genotipados por espectrometria de massa MALDI-TOF foram selecionados aleatoriamente para confirmação dos resultados usando PCR em tempo real. As sequências dos iniciadores e condições de ciclos térmicos são descritos na Tabela S2 nas Tabelas S1. Como uma validação da metodologia implementada para a genotipagem de

NLRP3-

42 bp-VNTR, análises de sequenciação foram realizadas em 10% das amostras de estudo selecionadas aleatoriamente, no Centro Ramaciotti, UNSW, Austrália.

a análise estatística.

O Student não pareado

t

-test foi utilizado para analisar as características clínicas. O método de contagem direta foi utilizado para estimar as freqüências genotípicas e alélicas. Desvio de Hardy-Weinberg (HWE) foi testada utilizando o teste de bondade de ajuste qui-quadrado (χ

2). Determinação de desequilíbrio de ligação (LD) baseou-se num teste de rácio de probabilidade em que o significado da razão de probabilidade observada é encontrado pelo cálculo da distribuição nula deste rácio sob a hipótese de equilíbrio de ligação, usando um procedimento de permutação [18]. inferência de haplótipos foi realizada por meio da Expectativa-Maximização (EM) algoritmo para dados genotípicos multi- locus de [19]. As odds ratio (OR) e intervalos de confiança de 95% (IC) foram calculados por meio de teste de probabilidade exato de Fisher (bicaudal

p

-Valores). A fim de corrigir os fatores de confusão, uma regressão logística binária (LR) ajustado por

H. foi realizada pylori

status e gênero.

P

-Valores 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos. filtros de qualidade para a exclusão de polimorfismos da análise estatística incluiu chamar taxas abaixo de 95% e desvio da HWE. Os dados foram analisados ​​por meio do programa Arlequin versão 3.1 [20], GraphPad Prism versão 5.02 (GraphPad Software Inc; San Diego, EUA) e SPSS versão 19.0.0. (SPSS Inc; Chicago, EUA)

Gene Expression de moléculas envolvidas na Receptor Sinalização Pathway

cultura de células de mamíferos NOD-like

a linha de células de leucemia monocítica humana THP-1 (código: TIB-202). (American Type Culture Colecção; Manassas, EUA), foi cultivada em meio RPMI 1640 suplementado com soro a 10% inactivado pelo calor fetal de bovino (FBS) (Invitrogen; Mulgrave, Austrália), piruvato de sódio 1 mM (Invitrogen), 2500 mg /L de bicarbonato de sódio (Invitrogen ) e uma solução de 100 ug /mL de penicilina-estreptomicina (Invitrogen). As células foram mantidas em 25 cm

2 cultura frascos de tecido (Greiner-Bio-On; Frickenhausen, Alemanha).. A 37 ° C com 5% de CO

2

Cultura bacteriana

O

H pylori

estirpe GC026 (

cagA

+,

gaiola

+,

CAGL

+,

cagT

+ ,

vacA

s1 m1 +,

babA

+,

oipA

+,

dupA

+ e

sabA

+) foi isolado de um paciente GC no Hospital Universitário da Malásia, Kuala Lumpur [21], [22]. O

H. pylori

estirpe 26695 (

cagA

+ e

vacA

s1m1 +) foi isolado de um paciente com gastrite [23] (código ATCC 700392). Ambos

H. pylori

estirpes foram cultivadas durante dois dias em placas de agar de sangue de cavalo (Blood Agar Base No.2 suplementadas com 6% estéril sangue de cavalo desfibrinado (Oxoid, Heidelberg Oeste, Vic., Austrália) a 37 ° C numa jarra de anaerobiose contendo um kit gerador de gás (Oxoid) para proporcionar uma atmosfera microaeróbia de 6% O

2, 10% de CO

2 e 84% N

2.

ensaio de Infecção.

As células THP-1 foram semeadas numa placa de cultura de 6 poços a uma concentração de 5 × 10

5 células /ml e subsequentemente diferenciados em macrófagos com acetato de forbol myrastate (Sigma-Aldrich) durante 72 horas [24]. antes da infecção bacteriana, células de mamífero foram incubadas em meio livre de antibióticos. o

H. pylori

estirpes GC026 e 26695 foram, em seguida, adicionado ao meio a uma multiplicidade de infecção de 1, e incubou-se durante 6 horas a 37 ° C e 5% de CO

2. A concentração de bactérias adicionado foi determinada com base numa curva padrão e densidade óptica (OD) leituras a 595 nm usando um leitor de microplacas modelo Bio-Rad 550 (Bio-Rad). A concentração real adicionado foi confirmada pela contagem de unidades formadoras de colónias (CFU) cultivados em placas de agar de sangue de cavalo depois de diluição em série da suspensão bacteriana.

extracção do ARN, preparação de cDNA e PCR matrizes.

Após infecção, não-desafiado e

H. pylori

-challenged células THP-1 foram usadas para o isolamento de ARNm utilizando o Qiagen RNeasy Mini Kit tal como descrito pelo fabricante (Qiagen). Para a análise da expressão do gene de 84 moléculas envolvidas na via de sinalização NLR, o ADNc foi sintetizado a partir de 0,8 ug de ARN total, utilizando a RT

2 primeira cadeia de cDNA Kit (Qiagen) e analisadas utilizando o inflammasome humano RT

2 Profiler PCR matriz (HAP-097R) (Qiagen), como recomendado pelo fabricante. perfis de expressão de genes foram obtidos a partir de três experiências independentes de

H. pylori

GC026-infectados,

H. pylori

26695-infectado e amostras não-infectados (controle) correspondente. As experiências foram realizadas utilizando o termociclador Rotor Gene-Q (Corbett Life Sciences; Doncaster, Austrália).

Para a análise de dados de expressão de genes, o método baseado em Ct ΔΔ de quantificação relativa foi implementado utilizando a RT baseado na Web

2 matriz Profiler PCR Análise de dados versão 3.5 (https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php). mudanças, pelo menos, de duas vezes (≥ 2, ≤0.5) e

P

-Valores. 0,05 foram considerados como estatisticamente significativos

SDS-PAGE e Western Blotting

THP As células foram semeadas -1, diferenciada e infectadas a uma MOI de 1, como descrito anteriormente. As proteínas foram extraídas com tampão RIPA, separados em 12% de sulfato de poliacrilamida geles de electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio, e transferidos para membranas tratadas com metanol polivinilideno difluoreto utilizando o sistema de transferência de célula Trans-Blot (Bio-Rad). As membranas foram immunolabeled com anticorpos de coelho anti-humanos (policlonais contra NLRX1 1:200) ou anticorpos monoclonais humanos anti-ratinho contra β-actina (1:1000) (Santa Cruz). De cabra anti-coelho e anticorpos anti-IgG de ratinho acoplado a HRP (1:2000; Bio-Rad) foram utilizados como anticorpos secundários, respectivamente. As membranas foram sondadas de acordo com o protocolo Pierce ECL Western Blotting Substrato (Thermo Scientific; Scoresby, Austrália).

Resultados

características clínicas

As características clínicas dos sujeitos do estudo incluindo sexo,

H. pylori

estado de infecção e idade média são apresentados na Tabela S3 nas Tabelas S1. O sexo masculino foi encontrado para ser mais predominante em pacientes GC do que nos controles FD, mostrando uma associação positiva com o desenvolvimento da GC nesta população de etnia chinesa (OR: CI 2,15, 95%: 1,29-3,58,

P

-valor: 0,0036).

H. pylori

foi encontrado para estar presente em 68,7% dos indivíduos neste estudo (73/87 pacientes do GC e 140/223 FD controles). A comparação da prevalência de

H. pylori

infecção em pacientes GC e controles FD mostrou que

H. pylori

foi um fator de risco para o desenvolvimento de GC (OR: CI 2,38, 95%: 1,41-3,99,

P

-valor: 0,0001). Embora sujeitos deste estudo foram pareados de acordo com a 5 anos os grupos etários, a idade média dos pacientes do GC (65,3 anos) foi significativamente maior do que a dos controles FD (54,3 anos) (

P

-valor: . 0,0001)

polimorfismos em genes envolvidos na NOD-like Receptor sinalização pathway estão associados com câncer gástrico em étnicas Indivíduos chineses

Cinquenta e um polimorfismos em genes envolvidos na via de sinalização NLR foram genotipados em 310 indivíduos de etnia chinesa (87 casos GC e 223 FD controles). A taxa de chamada de todos os polimorfismos selecionados foi 97-100% neste estudo. Todos os polimorfismos na via de sinalização NLR foram encontrados para estar em HWE no grupo de controle que mostra não significativa χ

2 valores, exceto para

CARD8

-rs12984929 (χ

2: 35.98),

CARD8-

rs4802445 (χ

2: 5,87) e

CARD8-

rs6509368 (χ

2: 5,43). Vinte e um polimorfismos em

NLRP3

(n = 5),

NLRP12

(n = 3),

NLRX1

(n = 3),

ASC

(n = 4) e

CASP1

(n = 6) foram encontrados para ser não-polimórfico nesta população de etnia chinesa (Tabela S1 nas Tabelas S1).

freqüências alélicas e genotípicas como bem como RUP e os IC 95% para os restantes 27 polimorfismos são mostrados na Tabela 1 e Tabela S4 nas Tabelas S1. O

CARD8

-rs11672725 genótipo TT mostrou uma forte associação com a GC na análise estatística bivariada (OR: CI 4,80, 95%: 1,39-16,58). Além de

CARD8

-rs11672725, mais quatro polimorfismos apresentou resultados limítrofes na análise bivariada (

NLRP3

-rs10754558,

NLRP3

-rs4612666,

NLRP12

-rs199475867 e

NLRX1

-rs10790286) (Tabela 1). Outras análises de estatística multivariada, ajustando para

H. pylori

infecção e sexo masculino, mostraram que o

CARD8

-rs11672725 genótipo TT permaneceu um fator de risco para GC nesta população de etnia chinesa (Tabela 2).

análises baseadas em haplótipos são uma abordagem poderosa para dissecar a arquitetura de doenças complexas. No estudo atual, o algoritmo EM identificados 25 haplótipos com uma frequência 0,01 em casos GC (Tabela S5 nas Tabelas S1). Usando o principal haplótipo no grupo controle como o haplótipo de referência, dois

CARD8-NLRP12

(Hap1 e Hap8), um

NLRP3

(Hap3) e três

NLRX1-CASP1

(Hap21, 23 e 24) haplótipos foram encontrados para aumentar o risco de GC nesta população de etnia chinesa. Curiosamente, Hap1 abriga o

CARD8

-rs11672725 alelo T, e Hap21 e Hap23 abrigar o

NLRX1

-rs10790286 C alelo, o que demonstra a coerência com os resultados obtidos com o alelo eo genótipo analisa.

Polimorfismos em genes envolvidos na NOD-like Receptor Sinalização Caminho está relacionado com

Helicobacter Pylori

Infecção em étnicas indivíduos chinês

Uma vez que

H. pylori

é conhecido por ser um importante fator de risco associado com GC, novas análises foram realizadas para avaliar a associação entre os polimorfismos genéticos envolvidos na via de sinalização NLR e

H. pylori

infecção. Curiosamente, o nosso estudo de caso-controle de etnia chinesa mostrou que

NLRX1

-rs10790286,

NLRP12

-rs2866112,

NLRP12

-rs4419163 e

ASC

-rs8056505 foram associados com um risco significativamente aumentado de

H. pylori

infecção nesses indivíduos (Tabela S6 nas Tabelas S1). A análise estatística multivariada confirmou que

NLRP12

-rs2866112 foi associado com um risco aumentado de

H. pylori

em indivíduos chineses (OR: CI 2,13, 95%: 1,22-3,71)

Joint Efeito da

Helicobacter Pylori

Infecção e polimorfismos genéticos aumenta significativamente o risco de câncer gástrico em. indivíduos étnicos chineses

análises adicionais foram realizadas para avaliar não só a presença ou ausência dos polimorfismos seleccionados mas também

H. pylori

estado em relação ao risco de GC, numa tentativa para determinar a existência de interacção biológica, sob a forma de sinergismo ou antagonismo. Surpreendentemente, os indivíduos que abrigam dez dos polimorfismos selecionados (

CARD8

-rs10405717,

NLRP3

-rs12079994,

NLRP3

-rs3806265,

NLRP3

-rs4612666,

NLRP12

-rs2866112,

NLRP12

-rs4419163,

NLRX1

-rs10790286,

CASP1

-rs2282659,

CASP1

-rs530537 e

CASP1

-rs61751523) e infectados com

H. pylori

foram observadas como sendo de maior risco de GC, a maioria destes RUP estando no intervalo de 4,0-5,0 (Tabela 3). Em contraste, na ausência de

H. pylori

,

CARD8

-rs2043211 diminuiu significativamente o risco de GC (OR: 0,19, 95% CI: 0,06-0,63).

Helicobacter Pylori

Influencia a expressão de várias moléculas envolvidas na NOD-like Receptor Sinalização Pathway

Para caracterizar ainda mais o efeito de

H. pylori

de moléculas envolvidas na via de sinalização NLR, avaliou-se a expressão de 84 genes que codificam NLRs, outros componentes inflammasome, reguladores negativos, citocinas pró-inflamatórias, as caspases pró-inflamatórias e as moléculas envolvidas na sinalização a jusante, em células THP-1 macrófagos -derived após a exposição a dois diferentes

H. pylori

cepas (GC026 e 26695). Em

H. pylori

células THP1 desafiou-GC026, 49 genes foram diferencialmente expressos quando comparado com o grupo controle (Tabela S7 nos quadros S1 e Figura S1 nas Figuras S1). Destes, estatisticamente significante sobre-regulação e a sub-regulação de pelo menos duas vezes foi encontrado em 17 e 28 genes, respectivamente (Tabelas 4 e 5). Trinta e cinco genes foram diferencialmente expressos entre o grupo controle e o grupo exposto a

H. pylori

26695 (Tabela S7 nas Tabelas S1 e S2 nas Figuras Figura S1). Destes, estatisticamente significante aumento da regulação e infra-regulação de pelo menos duas vezes foi encontrada em 5 a 23 genes, respectivamente (Tabelas 4 e 5).

Helicobacter pylori

Cepas Associated com câncer gástrico e gastrite levar a diferentes níveis de expressão de citocinas e quimiocinas

Dado que a inflamação é uma característica da carcinogênese gástrica, analisamos ainda mais a expressão de citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas após a exposição a dois

H. pylori

estirpes. A expressão de nove genes que codificam citocinas pró-inflamatórias (

IFNB1

,

IL1B

,

IL12B

,

IL6

,

IL33

e

TNF

) e quimiocinas (

CXCL1

,

CXCL2, CCL5

) foram significativamente sobre-regulada em células THP-1 desafiados com ambos

H. pylori

GC026 e 26695 estirpes (Tabela 4). Além disso, uma resposta imune intensa (

CXCL1

,

CXCL2

,

CCL5

,

IL6

,

IL12B

,

TNF

e

IFNB1

) foi iniciado contra o

H. pylori

GC026 (Figura 1A). Curiosamente, um número de genes que codificam quimiocinas (

CCL2

e

CCL7

) e citocinas (

IL18

,

TNFSF11

e

CD40LG

) foram regulados negativamente em

H. pylori

células -challenged THP-1 (Tabela 5).

A) A expressão gênica de citocinas e quimiocinas em

H. pylori

células -challenged THP-1, B) A expressão dos genes dos receptores NOD-like no

H. pylori

células -challenged THP-1, C)

expressão NFKB1

em

H. pylori

células -challenged THP-1 e D)

PTGS2

e

BIRC3

expressão em

H. pylori

-challenged células THP-1. Fold-change (2∧ (-Delta Delta Ct)) é a expressão do gene normalizada (2∧ (-Delta Ct)) em células THP-1 desafiados com

H. pylori

(GC026 e 26695) dividiu a expressão do gene normalizada (2∧ (-Delta Ct)) em seu respectivo grupo controle. Dobre-regulação representa dobra-mudança resulta de uma forma biologicamente significativa. Fold-change valores superiores a um indicam aumento da regulação e da dobra-regulação é igual à fold-change. valores fold-change menos de um indicam a regulação negativa, ea dobra-regulação é o inverso negativo da fold-change. Dobre-diferença em relação ao grupo controle, mostrando a *

P

-valor 0,05 e **

P

-valor 0,01.

P

-Valores foram obtidos com um teste t de Student.

Helicobacter pylori

infecção resulta em aumento da regulação do

NFKB1

com simultânea marcado para baixo-Regulamento do

NLRP12

e

NLRX1

Treze genes que codificam NLRs foram avaliados neste estudo, incluindo os membros da subfamília IPAF (NAIP, NLRC4), NLRPs ( NLRP1, NLRP3-6, NLRP9, NLRP12) e acenos (NOD2, NLRC5, NLRX1 e CIITA) (Figura 1B). A expressão de genes que codificam cinco NLRs foi significativamente regulada em células de H. pylori desafiados (NLRC4, NLRC5, NLRP9, NLRP12 e NLRX1) (Tabela 5). Destes, NLRP12 (dobre regulamento: 0,03, p-value: 0,016298) e NLRX1 (dobre regulamento: 0,02, p-value: 0,01762) foram significativamente regulada em células de H. pylori GC026-desafiados. Como uma técnica de validação, outros ensaios de Western blot que investigam expressão NLRX1, foram conduzidos. Consistentemente, diminuição dos níveis NLRX1 foram encontrados em células THP-1 desafiados com ambos H. pylori GC026 e 26695 (Informações de Apoio Figura S3).

Dado que o NF-kB é regulada negativamente por NLRP12 e NLRX1, que ainda comparado a expressão de

NFKB1

e

RELA

entre

H. pylori

GC026- e as células 26695-desafiado. Notavelmente, embora

RELA

mostrou diminuição dos níveis em células THP-1 expostos a ambos

H. pylori

cepas (dobre regulamento: 0,49,

p

-valor: 0,044673 e dobre regulamento: 0,26,

p

-valor:. 0,131017 para

H pylori

GC026 e 26695, respectivamente), estatisticamente significante aumento da regulação do

NFKB1

só foi observado em

H. pylori

células desafiou-GC026 (dobre regulamento: 2,50,

p

-valor: 0,006825). (Figura 1C)

Helicobacter Pylori

aumenta a expressão de

PTGS2

e

BIRC3

a expressão de outras moléculas envolvidas não só no NLR via de sinalização, mas também na carcinogênese também foi analisada comparando THP-1 células respostas a ambos

H. pylori

estirpes. Curiosamente,

PTGS2

foi significativamente up-regulamentada em THP-1 células após a exposição a ambos

H. pylori

cepas,

H. pylori

células desafiou-GC026 (dobre regulamento: 54.03,

p

-valor: 0,0247) mostrando os níveis de expressão significativamente mais elevados quando comparado ao

H. pylori

células 26695-desafiados (dobre regulamento: 19.56,

p

-valor: 0,016089) (Figura 1d). Além disso, um segundo gene envolvido na carcinogênese,

BIRC3

, era exclusivamente regulado para cima em

H. pylori

células desafiou-GC026 (dobre regulamento: 12,28,

p

-valor: 0,001638). (Figura 1D)

Discussão

GC é agora considerado um multifactorial processo, em que os fatores bacterianos, genética ambientais e de acolhimento estão envolvidos em diferentes fases da fisiopatologia do câncer. Actualmente, é bem estabelecido que o cancro surge no tecido cronicamente inflamado, e isto é particularmente notável no tracto gastrointestinal [4]. Como a inflamação crônica da mucosa gástrica é uma consequência da

H. pylori

infecção e esta bactéria é inicialmente alvo de PRRs, investigamos o papel das moléculas envolvidas na via de sinalização NLR em

H. pylori

infecção e GC relacionada.

Para nosso conhecimento, esta é a primeira evidência de que os polimorfismos envolvidos na via de sinalização NLR estão associados com um risco aumentado de GC numa população humana relatada. pylori

infecção. Tabela S1. Tabela S2. Tabela S3. Tabela S4. Tabela S5. Tabela S6. Tabela S7.