Abstract

Dachshund humano homólogo 1 (

DACH1

) é um dos principais componentes da Determinação Retinal Gene rede. A perda da expressão DACH1 foi encontrada no cancro da mama, da próstata, do pulmão, do endométrio, colorrectal e carcinoma hepatocelular. Para explorar a expressão, regulação e função de

DACH1

em câncer de esôfago humano, 11 linhas de células de câncer de esôfago, 10 casos de mucosa esofágica normais, 51 casos de diferentes graus de displasia e 104 casos de câncer epidermóide do esôfago primária foram empregado. PCR específica de metilação, imuno-histoquímica, western blot, citometria de fluxo, foram utilizados pequenos RNAs interferentes, colônia técnicas de formação e camundongos de xenotransplante modelo. Descobrimos que

DACH1

expressão foi regulamentado pela hipermetilação da região promotora em linhas de células de câncer de esôfago. 18,8% (6 de 32) de grau 1, 42,1% (8 de 19) de grau 2 e grau 3 displasia (ED2,3) e 61,5% (64 de 104) de câncer de esôfago foram metilado, mas não metilação foi encontrado em 10 casos de mucosa esofágica normal. A metilação foi aumentada em tendência de progressão durante a carcinogênese esofágica (

P Art 0,01).

DACH1

metilação foi associada com pobre diferenciação (

P Art 0,05) e estágio do tumor tarde (

P Art 0,05). Restauração da

DACH1

crescimento celular expressão inibida e sinalização TGF-β ativado em KYSE150 e KYSE510 células.

DACH1

suprimiu o crescimento do esôfago humano tumor de células de câncer em ratos de xenotransplante. Em conclusão,

DACH1

é frequentemente metilado em câncer de esôfago humano e metilação de

DACH1

está envolvido na fase inicial da carcinogênese esofágica. expressão DACH1 é regulada por hipermetilação da região promotora.

DACH1

suprime o crescimento do câncer de esôfago através da activação de sinalização TGF-β

Citation:. Wu L, Herman JG, Brock MV, Wu K, Mao G, Yan W, et al. (2014) Silenciando

DACH1

Para promover o crescimento cancro esofágico por inibir TGF-β Sinalização. PLoS ONE 9 (4): e95509. doi: 10.1371 /journal.pone.0095509

editor: Dajun Deng, Peking University Hospital do Câncer e do Instituto, China

Recebido: 17 de fevereiro de 2014; Aceito: 26 de março de 2014; Publicação: 17 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios: o Programa Nacional de Pesquisa básica (973 Programa No. 2012CB934002, 2010CB912802), National High-tech R D Programa (Programa 863 No. SS2012AA020314, SS2012AA020821, SS2012AA020303), National Key Scientific Instrument Programa especial da China ( Grant No. 2011YQ03013405) e da National Science Foundation da China (Grant No. 81121004, 81071953, 81161120432, 81072169, 81172422, 81261120395). As URLs de sites do financiador são: Programa Nacional de Pesquisa básica: https://www.973.gov.cn/Default_3.aspx; Nacional R High-tech D Programa: https://www.863.gov.cn/; Programa Nacional Especial Key Scientific Instrument of China: https://www.most.gov.cn/index.htm; National Science Foundation of China: https://www.nsfc.gov.cn/. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. JGH é um consultor para MDxHealth, no entanto, isso não altera a adesão dos autores a PLOS ONE políticas de dados e materiais de partilha.

Introdução

o câncer de esôfago é a quinta doença mais maligna e tem sido classificada como a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer na China. [1] carcinoma epidermóide de esôfago (CEE) é o tipo histológico predominante de câncer de esôfago, e representa cerca de 90% dos casos de câncer de esôfago na China do norte e central. [2] Apesar do desenvolvimento de terapias multimodais, a sobrevivência global cinco anos permanece abaixo de 20%. [3] Os mecanismos de carcinogênese esofágica permanecem obscuros. alterações genéticas e epigenéticas múltiplas foram considerados como fatores importantes para o desenvolvimento de câncer de esôfago [4] – [6]

Dachshund homólogo 1 (

DACH1

), um dos principais componentes do Gene Rede Determinação da retina. , é amplamente expresso em células epiteliais. Redução da expressão DACH1 foi associada com mau prognóstico no cancro da mama, da próstata, do pulmão, do endométrio, colo-rectal e cancro hepático. [7] – [13] A expressão de DACH1 foi regulada por hipermetilação do promotor região no endométrio, colo-rectal e cancro hepatocelular. [11] – [13]

DACH1

suprimida carcinoma hepatocelular humano através da activação de sinalização de TGF-β. [13] Enquanto as mudanças epigenéticas ea função de

DACH1

em ESCC humana permanecem obscuros. Neste estudo, foram analisados, principalmente, as mudanças epigenéticas eo mecanismo de DACH1 na carcinogênese esofágica.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Os protocolos de estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética Comité das chinês Hospital Geral PLA (Permit Number: 20090701-015) e consentimento informado por escrito foi obtido dos participantes. Todos os procedimentos de pesquisas com animais foram aprovados pelo Comitê de Ética animal do chinês Hospital Geral PLA (Permit Number: 2013-X8-40) e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. O estudo foi realizado em conformidade com as orientações de 1975 Declaração de Helsinki e foi compatível com a boa prática clínica orientações e exigências regulatórias locais.

Primária amostras de tecidos humanos e linhas celulares

Um total de 104 casos de carcinoma epidermóide de esôfago primário foram coletados como tecido fresco congelado do chinês Hospital Geral PLA. Todas as amostras foram classificadas por estágio TNM, incluindo a fase I (N = 5), fase II (N = 66), fase III (N = 32), e estágio IV (N = 1). Cinqüenta e um casos de displasia do esôfago foram recolhidos como amostras embebidos em parafina, incluindo 32 casos de displasia de grau 1 (ED1), 11 casos de displasia de grau 2 (ED2) e 8 casos de displasia de grau 3 (ED3). Dez casos de mucosa esofágica normal (NE) foram coletadas por biópsia sob endoscopia do chinês Hospital Geral PLA. Entre 104 amostras de câncer, 30 casos de blocos de parafina estavam disponíveis com tecido adjacente correspondido. Onze linhas celulares CICAc humanos (KYSE30, KYSE70, KYSE140, KYSE150, KYSE180, KYSE410, KYSE450, KYSE510, TE1, TE3 e TE8) foram incluídos neste estudo. Todas as linhas celulares foram CICAc descrito anteriormente [14] – [17], e mantidas em meio RPMI-1640 (Invitrogen) suplementado com soro fetal bovino a 10% e antibióticos. A Comissão de Ética do Hospital Chinese PLA Geral aprovou este estudo (Permit Number: 20090701-015)., E consentimento informado por escrito foi obtido antes da coleta da amostra e linhas celulares de tecido

5-aza-2′- tratamento desoxicitidina, isolamento de RNA e semi-quantitativa de transcrição reversa-PCR

CICAc linhas celulares foram divididas a baixa densidade (30% de confluência) 12 horas antes do tratamento. As células foram tratadas com 5-aza-2′-desoxicitidina (5-Aza) (Sigma-Aldrich) a uma concentração de 2 uM em meio de crescimento, que foi trocada a cada 24 h para um total de tratamento de 96 h. No final do ciclo de tratamento, as células foram recolhidas e o ARN total foi isolado por meio de reagente de Trizol (Invitrogen). Semi-quantitativa de transcrição reversa-PCR (RT-PCR) foi realizada como descrito previamente [12].

Modificação bissulfito, metilação PCR específicos e bissulfito de Sequenciação

O ADN genómico a partir de linhas celulares e CICAc primária CICAc tecidos foram preparados pelo método de proteinase-K. A metilação de PCR específica (MSP) A sequenciação e bissulfito (BSSQ) foram realizadas como descrito anteriormente. [18], [19] primers MSP e primers BSSQ [12] foram projetados de acordo com sequências genómicas em torno do local de início da transcrição na ilha CpG de

DACH1

gene (GenBank NM_080759.4) da região promotora e sintetizados (BGI ) para detectar alelos não metilados (U) e metilados (M).

imuno-histoquímica (IHQ)

coloração imuno-histoquímica para DACH1 foi realizada em cortes seriados de espessura 4μm derivados de blocos de parafina fixo-dehyde formais usando anticorpo contra DACH1 (1:500 diluição, Proteintech) tal como descrito anteriormente. [12] A intensidade da coloração e da extensão da área manchada foram classificados de acordo com o sistema de pontuação semi-quantitativa alemão, que também foi descrito anteriormente [12].

plasmídeo Construção e transfecção

A

DACH1

vetor de expressão foi um presente do Dr. Cvekl. O

DACH1

vector de expressão e os elementos Smad-vinculativos (SBE) -4 Luc plasmídeo repórter foram descritos anteriormente. [20]

DACH1

foi também subclonado plenti6-GFP vector. construções de vectores de transporte e do mix de embalagens ViraPower foram cotransfectadas 293FT células obter lentivírus de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen). Lentivírus foi então adicionada a KYSE510 e KYSE150 células, e sceened por Blasticidina (5 ug /ml, Invitrogen) para gerar

DACH1

células expressos de forma estável. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) foi utilizado para a transfecção de plasmídeo. Todas as construções foram confirmadas por sequenciação.

Viabilidade Celular Ensaio

DACH1

células expressos de forma estável e controle unexpressed foram semeados em placas de 96 poços (3 × 10

3 células /poço), e a viabilidade celular foi medida diariamente, durante 96 horas, utilizando o Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratorie) de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados foram representados como médias ± DP. Todos os ensaios foram realizados em triplicado e repetido por três vezes.

Formação de Colónias Ensaio

DACH1

células expressos de forma estável e de controle não expressa (5 × 10

2 células /poço) foram plaqueadas em 2 ml de meio de crescimento completo. A médio e reagentes foram alteradas uma vez em 72 horas. Após 2 semanas de incubação, as células foram fixadas com etanol a 75% durante 30 minutos e coradas com violeta de cristal a 0,2% (Beyotime) durante 20 minutos e a contagem. Para cada experiência, o ensaio de formação de colónias foi realizada três vezes.

Análise de Citometria de Fluxo

Para a análise do ciclo celular, o Kit de Detecção de ciclo celular (KeyGen Biotech) foi utilizada de acordo com as instruções do fabricante. Cada amostra foi analisada por citometria de fluxo com um citómetro FACScan de fluxo (Becton-Dickinson) utilizando um laser de 488 nm. Histogramas foram analisadas para compartimentos do ciclo celular utilizando ModFit versão 2.0 (Verity Software House). Para a análise da apoptose, a anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit (KeyGen Biotech) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante.

DACH1 Derrube por siRNA

Quatro pequenos RNAs de interferência selecionados (siRNA) de segmentação

DACH1

e ARNi de controlo negativo duplex foram utilizados neste estudo, e as sequências foram descritas anteriormente. [12] ARNi oligonucleótido ou ARNi de controlo negativo Duplex (GenePharma) foi transfectado em células KYSE140 utilizando Lipofectamina RNAiMAX Reagent (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante.

Dual-luciferase Reporter Assay

e KYSE510 KYSE150 células (3 x 10

3) foram semeadas em placas de 96 poços, incubadas durante 24 horas e transfectadas com uma combinação apropriada do repórter, os plasmídeos de expressão e o vector de controlo, incluindo o plasmídeo repórter SBE4-Luc (20 ng /cavidade ), pRL-TK controle de vetores (2 ng /poço) como um repórter de controle interno, e quantidades crescentes de

DACH1

plasmídeo exprssion. As células foram, durante 36 horas e depois estimuladas com ou sem TGF-β1 (Peprotech) durante 12 horas antes do ensaio de luciferase privadas de soro. actividades de luciferase relativas foram medidas com o sistema Luciferase Reporter Assay duplo (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. Para cada experiência, o ensaio de repórter de luciferase foi realizada três vezes.

Preparação Proteína e Western Blot Análise

de isolamento de proteínas e Western blot foram realizados tal como descrito anteriormente. [12] Os anticorpos primários foram as seguintes: DACH1 (Proteintech); c-myc, p21, fosfo-Smad3, cyclinD1 (Cell Signaling Technology); CDK4 (Affinity); fosfo-Smad2 (Millipore); cyclinE1, CDK2, Smad2 e Smad3 (Bioworld Technology); p-actina (Beyotime). As manchas foram visualizadas usando quimioluminescência aumentada (Pierce Bioscience).

In vivo

tumorigenicidade

DACH1

expressos de forma estável KYSE510 células e controle não expressa (4 × 10

6 células em 0,2 ml de solução salina tamponada com fosfato-) foi injectada subcutaneamente no flanco dorsal de Babl /c ratinhos nus fêmea com 5 semanas de idade, respectivamente; cada grupo incluiu 5 ratinhos. O tamanho do tumor foi medida a cada 5 dias, durante 4 semanas desde 5 dias após o implante, e o volume do tumor foi determinado com a seguinte fórmula: Volume do tumor (mm

3) = [comprimento (mm)] x [largura (mm) ]

2/2. Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética animal do chinês Hospital Geral PLA (Permit Number: 2013-X8-40). Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Análise Estatística

Os dados recolhidos a partir de várias experiências independentes foram apresentados como a média ± SEM, e analisados ​​utilizando

t

teste de Student. nível de expressão DACH1 entre o cancro esofágico e amostras de tecidos adjacentes combinados foram comparadas pelo teste de classificações de Wilcoxon-assinado. coeficiente de correlação de Spearman foi calculado para a avaliação da correlação entre a expressão e metilação de DACH1. A relação entre as características clínico-patológicas e status DACH1 metilação foram analisadas pelo teste do qui-quadrado. A

valor p

inferior a 0,05 foi considerado significância estatística. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS 15.0.

Resultados

Expression DACH1 é regulada negativamente pelo Promotor Região Hipermetilação em linhas celulares CICAc

expressão DACH1 foi regulamentada pelo promotor hipermetilação região no colo-rectal humano e carcinoma hepatocelular. [12], [13] Para explorar a regulação da

DACH1

em ESCC, a expressão eo estado de metilação de

DACH1

foram detectados por RT-PCR e MSP em linhas de células de câncer de esôfago. Como mostrado na Figura 1A, a perda de expressão DACH1 foi encontrada em KYSE150, KYSE510, TE1 e células TE3, a expressão reduzida DACH1 foi apareceu em células TE8, e expressão de DACH1 foi detectada em KYSE30, KYSE70, KYSE140, KYSE180, KYSE450 e KYSE410 células . MSP resultados foram mostrados na Figura 1B.

DACH1

estava completamente metilado em KYSE150, KYSE510, TE1 e células TE3, parcialmente em TE8, e não metilado em KYSE30, KYSE70, KYSE140, KYSE180, KYSE450 e KYSE410 células. resultados MSP foram ainda validados por seqüenciamento bissulfito (BSSQ) em KYSE150, KYSE510, TE8 e KYSE140 células (Fig. 1C). Tais resultados indicam que a região promotora hipermetilação está correlacionada com a perda /redução da

expressão DACH1

. Re-expressão /aumento da expressão de

DACH1

foi induzida por 5-aza-2′-desoxicitidina (5-AZA) em

DACH1

metilado linhas celulares de cancro esofágico (KYSE150, KYSE510, TE8, Fig. 1A). Estes dados sugerem que

DACH1

expressão é regulada pelo promotor metilação região em linhas celulares CICAc.

(A)

DACH1

nível de expressão detectado por RT-PCR em células de câncer de esôfago linhas. (B) de metilação na região promotora; IVD:

in vitro

DNA metilado, utilizado como controle de metilação; NL: DNA dos linfócitos do sangue normal, utilizado como controle unmethylation; L: alelos não metilados; M: metilado alelos. (C) BSSQ de

DACH1 e região promotora (-426 pb para -140 pb) em KYSE150, KYSE510, TE8 e KYSE140 células; duas pontas de seta: MSP produto de PCR, abrangendo 130 pb. círculos preenchidos: locais CpG metilados; círculos abertos:. sítios CpG não metiladas

DACH1 é metilado frequentes no cancro esofágico Humano

Para explorar ainda mais o estado de metilação de

DACH1

durante o desenvolvimento CICAc humana, 10 casos de mucosa esofágica normal, 51 casos de diferentes graus de displasia e 104 casos de ESCC primária foram detectados por MSP. Como mostrado na Figura 2A e 2B, 18,8% (6 de 32) do esôfago grau 1 displasia (ED1), 42,1% (8 de 19) de grau 2 e grau 3 displasia (ED2,3), e 61,5% (64 de 104) de câncer de esôfago invasiva (CE) foram metilado, mas nenhum dos 10 casos de mucosa esofágica normal foi metilado. A frequência de

DACH1

metilação foi aumentada em tendência de progressão durante a carcinogênese esofágica (

P Art 0,01).

DACH1

metilação foi associada com pobre diferenciação (

P Art 0,05) e estágio do tumor tarde (

P Art 0,05) significativamente. Não foi encontrada associação entre o

DACH1

metilação e idade, sexo, metástase ou tamanho do tumor (

P Art 0,05, Tabela 1). Tais resultados indicam que o

DACH1

metilação é um evento precoce da carcinogênese esofágica e metilação do

DACH1

é acumulado durante a progressão do câncer de esôfago. A expressão de DACH1 foi avaliada por imuno-histoquimica (IHC) em 30 casos de cancro do esófago combinados e amostras de tecidos adjacentes. A expressão foi reduzida significativamente em amostras de câncer (

P

. 0,01, Fig 2C e 2D). Ele sugere que

DACH1

é um supressor de tumor possível em câncer de esôfago. Para ver se a expressão DACH1 foi regulamentado pela metilação do DNA no câncer primário humano, foi analisada a associação de DACH1 expressão e região promotora hipermetilação. expressão reduzida foi encontrada em 19 casos de tecido de câncer e 15 casos foram metilados (Fig. 2E). Redução da expressão DACH1 foi associada a hipermetilação da região promotora de forma significativa (

P

0,01). Estes resultados sugerem que a expressão DACH1 é regulada por hipermetilação da região promotora em ESCC primária humana.

(A) Os resultados representativos MSP de

DACH1

estado de metilação na mucosa normal do esôfago (NE), displasia do esôfago ( ED) e câncer de esôfago (CE). (B)

DACH1

frequência de metilação no NE, ED1, ED2 e ED3 e CE. A frequência de metilado

DACH1

foram plotados de acordo com o grau histológico e analisados ​​por meio do teste do qui-quadrado. **,

P Art 0,01. resultados (C) Representante IHC para a expressão DACH1 em câncer de esôfago primário (esquerda) e tecidos adjacentes (direita); fase superior, X200; fase inferior, X400. (D) nível de expressão DACH1 em 30 casos pareados câncer primário e amostras de tecidos adjacentes; gráfico de caixa: representa o nível de expressão DACH1; linha horizontal: representa o nível médio; a linha de topo e de fundo das caixas representam 75% e o nível de expressão 25%, respectivamente; barras verticais representam nível de expressão diferente. **,

P Art 0,01 versus amostras de tecidos adjacentes usando Wilcoxon ensaio assinado-rank. (E) A associação de

DACH1

/expressão reduzida metilação e perda em 30 casos ESCC. **,

P

. 0,01, o coeficiente de correlação de Spearman

Restauração de DACH1 Expressão suprime o crescimento do cancro esofágico ambos

in vitro

e

in vivo

Para ver o efeito de

DACH1

sobre a proliferação celular ESCC, KYSE510 e KYSE150 células com expressando estavelmente

DACH1

ou vector vazio foram estabelecidas por transdução de lentivírus. A viabilidade celular e formação de colónias foram analisadas em

DACH1

células expressos de forma estável e controle não expressa. Re-expressão de

DACH1

proliferação celular inibida (

P Art 0,01, Fig 3A.) E formação de colónias (

P Art 0,05, Fig 3B.) Em estas linhas celulares. A função de

DACH1

em câncer de esôfago também foi estudado em ratos modelo de xenotransplante (Fig. 3C). O tamanho do tumor foi menor no

DACH1

expressa KYSE510 células do que no controle (104.23 ± 21,38 milímetros

3 vs 494.65 ± 81,98 milímetros

3,

P Art 0,01, Fig . 3D), eo peso do tumor foi menor no

DACH1

expressa KYSE510 células do que no grupo controle (78 ± 28 mg vs 182 ± 37 mg,

P

. 0,01, Fig 3E ). A expressão de DACH1 foi validado por IHQ em xenoenxerto (Fig. 3F). Estes resultados sugerem que

DACH1

suprime o crescimento de esôfago câncer ambos

in vitro

e

in vivo

(A) curvas de crescimento representam ensaio de CCK-8

. resultados para

DACH1

células expressas e cells.Points não expressas, com média de quatro experiências independentes; bares, SEM. **,

P Art 0,01,

t

teste de Student. (B) Os resultados representativos de formação de colónias em

DACH1

expressa e não expressa KYSE510 e linhas celulares KYSE150. Colunas, com média de quatro experiências independentes; bares, SEM. *,

P Art 0,05 versus controles usando

t

teste de Student. (C) Representantes resultados de tumores de xenoenxerto em ratinhos nus para células KYSE510

DACH1

expressas e não expressas. curvas (D) de crescimento representam tamanho do tumor em

DACH1

ratos expressas e células KYSE510 não expressas de xenotransplante em horário diferente. Pontos, com média de 5 ratos; . Bares, SEM *,

P Art 0,01,

t

teste de Student. (E) Os resultados representativos de peso do tumor em

DACH1

ratos expressas e células KYSE510 não expressas de xenotransplante em horário diferente. Colunas, com média de 5 ratos; bares, SEM. *,

P Art 0,01,

t

teste de Student. resultados de expressão (F) representive DACH1 detectados pela IHQ para

DACH1

xenotransplante expressa e células KYSE510 não expressas. expressão DACH1 foi encontrado em

DACH1

expressa KYSE510 xenotransplante celular. (certo). Ampliação: fase superior, X200; fase inferior, X400.

Restauração de DACH1 expressão aumentada G

1 Fase e Células S Fase Redução

O efeito da

DACH1

no ciclo celular foi analisadas por citometria de fluxo em linhas celulares e KYSE510 KYSE150. Como mostrado na figura 4A, a proporção de células de fase G1 foi 51,05 ± 2,28% e 38,56 ± 1,64% em

DACH1

expressa e linhas celulares KYSE510 não expressos (

P

0,05). A proporção da fase S foi 25,72 ± 0,99% e 37,09 ± 1,49% em

DACH1

expressa e linhas celulares KYSE510 não expressas (

P Art 0,05). A proporção de células fase G1 foi 65,46 ± 2,84% e 44,41 ± 2,87% em

DACH1

linhas celulares KYSE150 expressas e não expressas (

P Art 0,05). A proporção da fase S foi de 12,34 ± 0,10% e 32,06 ± 1,32% em

DACH1

expressa e linhas celulares KYSE150 não expressos (

P

0,01). Estes resultados sugerem que

DACH1

aumenta fase G1 e redução de células em fase S em câncer de esôfago

(A) Citometria de fluxo resultados mostram:. A distribuição de fases celular em DACH1 unexpressed e expressou KYSE510 e KYSE150 células . Colunas, com média de três experimentos independentes; bares, SEM. *,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01,

t

teste de Student. (B) os resultados de Western blot mostram: Expressão de ponto de controlo G1 /S em genes relacionados e não expressa DACH1 expressa KYSE510 e KYSE150 células, β-actina foi utilizado como um controlo de carga

A expressão aumentada de CDK2. , CDK 4, cyclinD1 e cyclinE1 geralmente representa a promoção do ciclo celular da fase G1 para a fase S. Como mostrado na figura 4B, a expressão de CDK2, CDK 4, cyclinD1 e cyclinE1 foram reduzidos aparentemente em

DACH1

expressa KYSE510 e KYSE150 células em comparação com células não expressas. Ele sugere que

DACH1

suprime a proliferação celular através da inibição G

1 /S posto de controle em câncer de esôfago. O efeito da

DACH1

na apoptose celular também foi analisada por citometria de fluxo em linhas celulares KYSE510 e KYSE150, mas nenhuma mudança apoptose foi encontrado antes e depois da restauração da

expressão DACH1

nestas duas linhas celulares (dados não mostrados).

Restauração de DACH1 Expressão Ativa TGF-β Sinalização na CICAc

O nosso estudo anterior descobriu que

DACH1

realizada efeito anti-proliferação, activando TGF- β sinalização e inibição da expressão de c-Myc em linhas celulares de carcinoma hepatocelular humano. [13] Para se determinar se a sinalização de TGF-β é regulada por

DACH1

em CICAc, ensaio de repórter de luciferase dupla foi utilizado para examinar a actividade de luciferase SBE4 em linhas celulares e KYSE510 KYSE150. Como mostrado na Figura 5A, a actividade do promotor SBE4 foi aumentada mais de 3 vezes na KYSE510 e 2,6 vezes na KYSE150 células após a restauração de

expressão DACH1

, e a actividade foi aumentada de uma forma dependente da dose por restauração da

DACH1

expressão combinada com o tratamento TGF-β1. Para melhor compreender o mecanismo de

DACH1

de sinalização de TGF-β, o nível de Smad2 fosforilado (p-Smad2) e Smad3 fosforilada (p-Smad3), e os seus alvos a jusante, p21 e c-Myc foram avaliados em

DACH1

linhas celulares KYSE510 e KYSE150 não expressas e expressos. O nível de p-Smad2 não foi alterado antes e depois da re-expressão de

DACH1

, enquanto o nível de p-Smad3 foi aumentada após a re-expressão de

DACH1

. O nível de p-Smad2 e p-Smad3 foram aumentadas após a adição de TGF-β1. p-Smad3 foi aumentada, aparentemente, quando adicionado TGF-β1 a

DACH1

re-expressa KYSE510 e KYSE150 células. A expressão de genes a jusante eram diferentes. p21 foi regulado para cima e c-Myc foi regulada para baixo após a re-expressão de

DACH1

(Fig. 5B). Ele sugere que a sinalização TGF-β é ativado pelo

DACH1 Comprar e TGF-β1 aumenta este efeito. Para validar ainda mais o efeito de

DACH1

da sinalização TGF-β, foi empregada a técnica knockdown siRNA. O nível de p-Smad2 não se alterou depois de derrubar

DACH1

em

DACH1

expressa KYSE140 células, mas o nível de p-Smad3 foi reduzida quando derrubando

DACH1

. Ambos p-Smad2 e p-Smad3 foram aumentadas após a adição de TGF-β1. p-Smad3 foi aumentado ligeiramente por adição de TGF-β1 de siRNA transfectadas KYSE140 células em comparação com apenas derrubando

DACH1

. Reduzido p21 e aumento da expressão de c-Myc foram encontrados depois de derrubar

DACH1

em KYSE140 células (Fig. 5C e 5D). Acima resultados sugerem ainda que a sinalização TGF-β é ativado pelo

DACH1

em câncer de esôfago humano.

Elementos

(A) Smad vinculativas (SBE) -4 Luc atividades repórter em KYSE510 e KYSE150 células . Colunas, com média de três experimentos independentes; bares, SEM. (B) O nível de expressão de TGF-β sinalização genes a jusante em

DACH1

expressas células e células não expressas, β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (C) A eficiência dos siRNAs segmentação em

DACH1

em KYSE140 células. (D) O nível de expressão de TGF-β sinalização genes a jusante em

DACH1

-siRNA KYSE140 células e grupo controle, β-actina foi usado como um controle de carga.

Discussão

A expressão de DACH1 foi reduzida nos cancros da mama, da próstata, do pulmão, do endométrio, colorrectal e carcinoma hepatocelular, mas foi aumentada no cancro do ovário. [7] – [13], [21] expressão DACH1 foi regulada por hipermetilação do promotor região no endométrio, colorrectal e carcinoma hepatocelular. [11] – [13] No presente estudo, demonstramos que a expressão DACH1 foi reduzida e a expressão de DACH1 foi regulamentado pela hipermetilação da região promotora de câncer de esôfago humano. Nós havia relatado que muitos supressores de tumor foram metilado com tendência progressão durante a carcinogênese esofágica. [15], [16], [22], [23] Neste estudo, analisamos o estado de metilação de

DACH1

na mucosa esofágica normal, diferentes graus de displasia e câncer invasivo.

DACH1

foi frequentemente metilado em câncer de esôfago ea frequência aumentou com a progressão da carcinogênese esofágica da mucosa esofágica normal a câncer invasivo. Ele sugere que

DACH1

é um marcador de detecção precoce do câncer de esôfago. A associação de fraca diferenciação e estágio do tumor atrasado com

DACH1

metilação sugere que

DACH1

metilação pode servir câncer marcador de prognóstico, como de esôfago.

DACH1

foi considerado como um supressor de tumor ou um oncogene em diferentes tipos de cancro. [7] – [13], [21] Em nosso estudo,

DACH1

foi encontrado para suprimir o crescimento de câncer de esôfago ambos

in vitro

e

in vivo

. A superfamília do TGF-β é um conjunto de citoquinas multifuncionais que regulam o crescimento celular, diferenciação, apoptose, a migração e a angiogénese. [24] – [27] Nas células epiteliais normais, a sinalização de TGF-β envolve na activação da transcrição do p21Cip1 inibidor de quinase dependente da ciclina, e a repressão do promotor do crescimento factor de transcrição de c-Myc. Cooperativamente, estas respostas de genes medeiam parada do ciclo celular na fase G1. [28] – [30] sinalização de TGF-β desempenha um papel crítico, mas paradoxo em diferentes tipos de cancro [31] – [33]. No cancro da mama, a sinalização de TGF-β suprime o crescimento de células em fase precoce e promover a invasão do cancro em fase tardia. [34] Estudo prévio no câncer de mama mostrou que DACH1 inibida TGF-β sinalização através Smad4 vinculativo. [20] Enquanto no câncer hepatocelular, encontramos DACH1 ativada sinalização TGF-β, aumentando p-Smad3. É realçado a repressão da expressão de c-Myc e a proliferação celular. [13].

Em apoio do relatório anterior que DACH1 induzida abundância de proteína p21 e contrariados Myc induzida por fenótipo oncogénico no cancro da mama, [35] encontramos aqui que a expressão ectópica de DACH1 sozinho em células de câncer de esôfago aumentou p21 e diminuição do nível de proteína c-Myc (Fig. 5B). Além disso, em sinergia com DACH1 TGF-β para aumentar a indução de p21 e repressão de c-Myc; correspondentemente, derrubando DACH1 suprimida sinalização TGF-β em KYSE140 células. sinalização de TGF-β pode crosstalk com muitas outras vias. p53 e Smads fisicamente interagiram e sinergicamente co-regulados genes alvo de TGF-β, tais como p21 e p15. [36] Estudos recentes demonstraram que DACH1 associada com a p53 e a função de p53 melhorados para induzir a apoptose e inibem o crescimento do tumor. Estudos posteriores mostraram que DACH1 compartilhada ocupação de -15% de genes ligados a p53 no sequenciamento Chip. [7], [9] Como DACH1 activado TGF-β sinalização (Fig. 5A) e a fosforilação induzida de Smad2 /3 (Fig. 5B), uma possível explicação é a activação e estabilização do complexo proteína Smad2 /3 por DACH1 como p53 . No entanto, o mecanismo de detalhe precisa ser provado.

Em conclusão,

DACH1

é frequentemente metilado em câncer de esôfago humano e metilação de

DACH1

está envolvido na fase inicial do esôfago carcinogênese. expressão DACH1 é regulada por hipermetilação da região promotora.

DACH1

suprime o crescimento do câncer de esôfago através da activação de sinalização TGF-β.

Reconhecimentos

Graças Dr. Cvekl para fornecer vetores de expressão DACH1.