Abstract

Apesar de melhores resultados nos últimos 30 anos, menos de metade de todas as mulheres diagnosticadas com cancro do ovário epiteliais vivas cinco anos após o diagnóstico. Embora geralmente tratadas como uma única doença, câncer epitelial de ovário inclui vários subtipos histológicos distintos, tais como carcinomas serosos e endometrióides papilares. Para avaliar se as diferenças morfológicas observadas nesses carcinomas representam características distintas ao nível molecular foram analisados ​​padrões de metilação de DNA em 11 tumores papilares serosos, 9 endometrióides tumores de ovário, 4 amostras normais trompa de Falópio e 6 tecidos endometriais normais, além de 8 trompa de Falópio normais e 4 amostras serosas de TCGA. Para comparação dentro do subtipo endometrióide adicionamos 6 uterinos tumores primários e 5 endometrióides metástases endometrióides de útero de ovário. Os dados foram obtidos a partir de 27,578 dinucleótidos CpG que ocorrem em ou próximo regiões promotoras de genes de 14.495. Foram identificados 36 locais com aumento ou redução significativa na metilação em comparações de tumores serosos e amostras de tubos de falópio normais. Além disso, técnicas de agrupamento sem supervisão aplicados a todas as amostras apresentaram três perfis principais compreendendo amostras principalmente normais, tumores serosos e tumores endometrióides incluindo ovário, útero e origens metastáticos. A análise de agrupamento identificou 60 locais diferencialmente metilados entre o grupo serosa e do grupo normal. Um conjunto relacionado de 25 tumores serosos validado a reprodutibilidade dos padrões de metilação. Em contraste, 1000 genes foram diferencialmente metilada entre tumores endometrióides e amostras normais. Este resultado é consistente com uma interrupção regulamentar generalizada causada por um fenótipo methylator. Através de análises de metilação de ADN que identificaram genes com funções conhecidas na etiologia do carcinoma do ovário, enquanto que fornecida via análises visão biológica para o papel de novos genes. A nossa descoberta de diferenças entre tumores de ovário seroso e endometrióides indica que as estratégias de intervenção poderiam ser desenvolvidos para tratar especificamente subtipos de câncer epitelial de ovário

Citation:. Kolbe DL, DeLoia JA, Porter-Gill P, estranho M, Petrykowska HM , Guirguis A, et al. (2012) Análise Diferencial de ovário e endométrio cancros Identifica um Methylator fenótipo. PLoS ONE 7 (3): e32941. doi: 10.1371 /journal.pone.0032941

editor: Joseph Califano, John Hopkins Medical School, Estados Unidos da América

Recebido: 29 de setembro de 2011; Aceito: 02 de fevereiro de 2012; Publicação: 05 de março de 2012

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. O financiamento é fornecido pelo Programa de Pesquisa Intramural do Instituto Genoma Humano Nacional de Pesquisa, Institutos Nacionais de Saúde (LE e LB), DoD GOC # 04-124 e Magee Womens Research Institute /Scaife Grant (TCK). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário tem uma incidência de 21.500 casos por ano nos Estados Unidos e 204.000 em todo o mundo, com uma mortalidade anual estimada de 125.000 mulheres. A condição está classificada como a 5

th principal causa de mortes relacionadas ao câncer para as mulheres nos Estados Unidos; a alta taxa de mortalidade é uma consequência da natureza assintomática da doença em estágio inicial e a ausência de um teste de rastreio fiável. A maioria dos casos (75%) são diagnosticados em estágio avançado (III ou IV), em que a taxa de sobrevivência de 5 anos é inferior a 30% [1].

Dos quatro principais subtipos histológicos, serosa é o mais comum, seguido por endometrióide, mucinoso e tipos de células claras. Estes subtipos têm perfis de expressão genética distintas [2] e são classificados em virtude de sua semelhança morfológica ao tubo normal de Falópio, endométrio, endocérvice e células claras do endométrio, respectivamente [3]. A semelhança entre os subtipos de tumor e tecidos distantes é consistente com modelos que propõem a migração de lesões precursoras a partir de origens diferentes, tais como o tubo falópico [4] ou o revestimento mesotelial da cavidade peritoneal [5]. Por esta razão, tumores ovarianos serosos (que se assemelham a epitélio de Muller) pode ser legitimamente comparação com trompa de Falópio normal (que é derivado a partir de Mullerian epitélios). No entanto, o epitélio de superfície do ovário (OSE) camada [6] compartilha sua origem com o epitélio do endométrio (conhecido como epitélio celômica [7]) e continua a ser uma explicação alternativa plausível para “de novo” tumorigênese.

Como tumores serosos, a origem de tumores endometrióides é controverso [8], e células progenitoras têm sido propostos para se originam a partir de fontes não-ovarianos, como a endometriose [9]. Os tumores com histopatologia endometrióide são diagnosticados tanto no útero e ovário. Eles frequentemente co-ocorrem, como tumores primários síncronos ou metástases do útero ao ovário [10]. Considerando que as diferenças moleculares têm sido relatados para tumores primários duais, tumores metastáticos são clonalmente idêntica [11].

estudos de tumores ovarianos destinados a detectar perfis específicos do cancro de expressão gênica têm rendido sucesso modesto e reprodutibilidade limitada [12], [13], [14], [15]. No entanto, estudos de perfis de mutação produziram resultados mais consistentes, mostrando que ambos os tumores serosos e endometrióides tem agressivos subtipos, de alto grau [16], [17], [18] com mutações no

gene TP53

[19 ], [20], [21] apesar de suas diferenças histológicas evidentes [16], [17], [18]. subtipos de baixo grau são mais comuns em tumores endometrióides com mutações ocorrendo predominantemente em

WNT Comprar e

PIK3CA

caminhos [2].

Em conjunto com a expressão de genes e padrões de mutação, delineando o epigenoma de células tumorais deve revelar as relações entre as amostras refletem origens comuns embrionárias, resultados histopatológicos semelhantes, ou eventos mutacionais compartilhados. Em tumores de ovário, a metilação do DNA silencia a expressão de genes críticos [22], [23], e cria haploinsu- genética [24], enquanto que em outros locais hipometilação permite a expressão de genes normalmente silenciosos. Como prova de princípio, os padrões específicos do local de metilação do DNA foram recentemente utilizada para distinguir quatro subtipos de cânceres de ovário epiteliais, usando um total de 1.505 alvo loci CpG [25], [26].

A hipótese de que o DNA padrões de metilação em tumores ovarianos iria assemelhar-se as células do seu tecido de origem, putativo, com um pequeno número de alterações representando eventos associados com a malignidade, que representam de forma única cada subtipo do tumor. Além disso, também a hipótese de que os tumores endometrióides uterinas e ovarianas foram relacionados por mecanismos patogênicos, que seriam observadas nos padrões de metilação do DNA. Para lidar com essas ideias, examinamos perfis de metilação de sites 27.578 alvo CpG representando 14.495 genes no genoma humano, usando DNA derivado de tumores serosos e endometrióides ovário, trompa de Falópio normais e endométrio normal e tumores endometriais endometrióides primários e metastáticos. Este grande conjunto de dados foi analisada utilizando uma análise supervisionado e acompanhado pelo

de novo

classificação usando cluster computacional sem supervisão. Para melhorar a força da técnica de profiling epigenética, que incluiu dados de metilação bruto de tumores serosos e trompa de Falópio normais gerados através do Cancer Genome Atlas (TCGA). Estas amostras foram analisadas usando a mesma plataforma metilação, e realizados por laboratórios independentes de pesquisa usando amostras de tumores independentes.

Resultados

ensaio experimental e design

Analisamos o estado de metilação de DNA de amostras genómicas utilizando a plataforma Illumina Infinium. O DNA foi tratado com bissulfito para converter citosinas não metiladas em uracilo, deixando as citosinas metiladas inalterada. A reacção de hibridação na HumanMethylation27 Illumina BeadChip fornecida sinal específico para os estados metilados e não metilados, usando a extensão de base único ensaio protocolo Illumina [27]. A hibridação diferencial de sondas para locais alvo metilados e não metilados foram tabulados como a fracção do sinal total que corresponde ao estado desnaturado. O conjunto de amostra inicial representados vários tipos de tecidos e tumores, incluindo tubo normal de Falópio, endométrio normal, carcinoma seroso papilífero ovariano, carcinoma endometrioid ovário, e carcinoma endometrioid endometrial primário e metastático de 42 pacientes (Tabela 1). repetições técnicos indicados resultados altamente reproduzíveis para o ensaio (figura S1). Além disso, foram incluídos dados da mesma plataforma de metilação Illumina para 12 amostras adicionais do banco de dados público do projecto Cancer Genome Atlas (TCGA). Este conjunto composto 8 amostras de controlo (trompa de Falópio normal) e 4 amostras de tumores (de ovário seroso), contribuiu em um único lote de amostras analisadas em condições experimentais consistentes de um fornecedor de dados.

metilação massa

Para avaliar as mudanças brutas no grau de metilação, examinamos os níveis de metilação agregadas de todas as amostras. Os valores do ensaio são apresentados como a proporção de fluorescência resultante da sonda para o estado desnaturado, de 0 (todo o ADN não metilado) a 1 (todo o ADN metilado). Comparando todas as amostras, a grande maioria mostrou perfis de metilação consistentes. Em todo o genoma, os locais mais ensaiadas tinham níveis de metilação entre 0 e 0,2, um pequeno número de locais tinham níveis entre 0,2 e 0,8, e um número ligeiramente maior tinha níveis de 0,8 a 1 (Figura 1).

de Frequência metilação em todos os loci para um dado nível de metilação (gama 0-1). Cada amostra biológica é representado como uma linha única; todas as amostras não-metastáticos foram plotados. Respectivamente, os painéis da esquerda para a direita contêm todos os loci (N = 27.561), cromossoma X única (N = 1038), ou cromossoma 10 única (N = 1044).

Por outro lado, considerando-se apenas o cromossoma X, de cópia única silenciamento por aleatório X-inactivação era esperado para produzir um nível de metilação de 0,5. O padrão observado mostrou um pico largo centrado a 0,5 para a maioria das amostras, embora as amostras de tumor tinha mais extensa heterogeneidade. Cinco amostras de tumor seroso mostrou um perfil distinto, com vários loci ser não metilada (isto é, o nível de metilação 0,2), indicando uma falha, quer para manter a X-inactivação ou copiar alterações número com excesso relativo do X activo [28]. Para avaliar se esta variação observada foi simplesmente devido ao pequeno número de loci no cromossomo X, nós níveis de metilação também considerados no cromossomo 10, que teve um número semelhante de sondas. O padrão para o cromossomo 10 se assemelhava o padrão em todos os loci autossômica, com altos níveis de similaridade entre amostras.

análise Supervisionado

Em primeiro lugar, examinou se os subtipos de tumor (definido pela histopatologia) corresponderam para os perfis de metilação específicas. Com a inclusão das amostras TCGA, 12 amostras trompa de Falópio normais e 16 tumores serosos ovarianos rendeu poder estatístico suficiente para uma comparação direta. Sondas com controle de má qualidade, alta variabilidade nos controles, ou localizadas em X ou Y-cromossomas não foram considerados (ver Métodos). Usando um teste de Wilcoxon-Rank somados para identificar os locais que consistentemente associadas com a classificação prévia, 36 foram significativas a p 0,05 após a correcção de múltiplos testes (14 a p 0,01; Quadro 2). Três genes foram identificadas como membros da via canonical para o cancro do ovário na análise Engenho Caminho (IPA) (Tabela 2; [29] [30] [31] [32]). análise supervisionada dos tumores ovarianos endometrióides contra os controles trompa de Falópio ou do endométrio não foi realizada devido ao pequeno número de amostras.

agrupamento não supervisionado

Para avaliar se outras divisões da amostra com compartilhada molecular fenótipos existiu e para obter um quadro mais amplo das relações entre os tipos de amostras, que foi transferida para o agrupamento não supervisionado. Utilizando o conjunto completo de 31 amostras de tumores primários e 18 tecidos normais (e excluindo os 5 amostras metastáticos utilizados para análise secundária), que limita esta análise para sondas que estavam no top 500, quando classificados por variância, conforme relatado pelo Houseman et al. [33] para reduzir a dimensão dos dados. Os resultados de vários algoritmos de agrupamento convergiram para a mesma interpretação de grupos fenotípicos distintos (Figura S2). K-means clustering e particionamento usando um modelo β-mistura projetado para os dados a partir desta plataforma [33] tanto apoiou fortemente a existência de 3 grupos primários, que correspondem aproximadamente a controlar-tipo amostras, amostras do tipo de tumor seroso, e amostras endometrióides. análise adicional com agrupamento hierárquico (através de várias métricas de distância e métodos de ligação) apoiou fortemente os clusters do tipo de controle e tipo endometrial, e indicou as amostras do tipo de tumor seroso foram um grupo externo para as amostras testemunhas, mas foi inconsistente quanto a se estas amostras formado um subgrupo distinto (Figura S2).

os agrupamentos de consenso, tal como mostrado na Figura 2, são marcados com uma barra de cor para indicar o tipo normal, seroso de tipo ou de tipo endometrióide. Notavelmente, o grupo de controlo continha trompa de Falópio normal e endométrio normal, indicando um fenótipo consistente em ambos os tecidos dentro do conjunto de sondas em destaque. As amostras TCGA agrupado com seus tipos de amostras identificados, confirmando a reprodutibilidade ea robustez dos resultados como estes tumores foram obtidos e classificados em várias instituições. Exclusão das amostras TCGA da análise teve impacto relativamente pequeno sobre os resultados, em que uma divisão marcada permaneceram entre a endometrioid e amostras seroso ou de controlo; no entanto, apenas fraco apoio permaneceu por uma subdivisão dos tumores do tipo seroso das amostras de controlo

Heatmap dos níveis de metilação.; azul = 0,0, preto = 0,5, amarelo = 1,0. À esquerda, uma amostra representativa de agrupamento hierárquico, e blocos de cor dando os grupos de consenso. Seis colunas à direita dão características da amostra: número; do tumor (T) ou normal (N); localização no ovário (O), trompa de Falópio (F), ou endométrio (E); histologia da serosa (S) ou endometrióide (O); grau (1-3; onde os símbolos utilizados são ‘-‘ para os normais e ‘NA’ para obter informações não disponíveis.) e na extrema direita, pontos de dados públicos TCGA. Cinco amostras na parte inferior são metástases ovarianas de tumores endometrióides endométrio, excluídos da análise inicial e clustering.

O conjunto de amostras endometrióides, incluindo tumores de ambos os sites do ovário e útero, exibe um perfil extremamente alterado, com a metilação em vários sites que são ilhas normalmente não metiladas CpG, e uma perda de metilação em locais que são normalmente metilado. A extensão e reprodutibilidade dessas mudanças é fortemente reminiscente dos fenótipos methylator observadas em outros tipos de câncer [34] [35]. Um fenótipo methylator foi anteriormente proposto para o carcinoma endometrial endometrióide, com base na metilação de promotores de alguns genes alvo [36], mas não para o nosso conhecimento sido descrito em uma pesquisa de nível genoma ou no cancro do ovário.

Estes dados confirmam a hipótese de que endometrióides tumores do tipo, seja em sites de ovário ou do útero, partilhar semelhanças ao nível molecular. Para aprofundar esta conclusão, foram analisados ​​cinco metástases ovarianas derivadas de tumores de endométrio primário, utilizando um teste de log-verossimilhança-ratio aninhada. Este teste dirigida consistência do cluster com as amostras endometrióides primários versus os tumores e controles serosa combinados, e, secundariamente, permitiu a classificação dentro dos grupos seroso ou de controlo, quando necessário. Quatro das cinco amostras foram fortemente identificado como endometrióide-tipo, enquanto que a quinta era mais similar ao das amostras de controlo (amostra 54; Figura 2). A quinta amostra não parecem grosseiramente alterado a partir da metilação de tecido endometrial normal, indicando que o fenótipo do tumor maioria não é universal. Este outlier pode representar uma subdivisão incomum de tumores endometrióides, resultante de diferentes patologia subjacente, no entanto, não representa um tumor de baixo grau (Figura 2).

Avaliação de tumores primários de todos os histopathologies também identificados casos anómalos infrequentes. Exemplos incluiu amostras endometriais endometrióides 47 e 49, que agruparam com tecidos normais e contribuíram para a 15% das amostras que apresentaram discordantes colocação em relação à sua histopatologia atribuído (grau 1 e grau não estão disponíveis, respectivamente; Figura 2). Quatro tumores serosos ovarianos também agrupado com os tecidos normais, mostrando alterações muito limitadas na metilação em relação aos controles (graus 2 e 3). Dada a semelhança fenotípica destas amostras aos controles normais, a base biológica deste subconjunto tumor requer uma investigação mais aprofundada. Além disso, uma amostra endometrioid ovário agrupado com os tumores serosos (amostra 36, ​​grau 2), sugerindo quer um subtipo raro endometrioid com um perfil mais agressivo, serosa-like, ou erros de digitação de uma amostra pouco diferenciado.

Diferencial análise de clusters

Tendo em conta os três grupos primários fornecidos pela análise de agrupamento não supervisionado, queríamos identificar metilação loci mais preditiva de participação em uma determinada classe. Repetimos o teste-rank resumiu Wilcoxon utilizado na análise supervisionada, após a remoção da consideração as 500 sondas utilizadas no agrupamento. Comparando-se o aglomerado de tipo serosa com o cluster de tipo de controlo, sondas de 35 permaneceu significativa a p 0,01 após a correcção de Bonferroni para múltiplos testes rigorosos e 60 manteve-se a p 0,05 (Quadro 3). Os resultados mostraram uma mistura de hiper e hipometilação relativamente aos controlos (Figura S3). Uma análise IPA identificados biomarcadores conhecidos para o câncer de ovário entre esta lista (Figuras S4 e S5). Foram identificados dois genes com relevância gravado para a metilação do DNA, incluindo

DNMT3A

, um gene DNA metiltransferase e

RB1 ​​

.

APC

(da via beta-catenina),

RBAK1

(um

RB1 ​​

parceiro de interacção),

MAPK15

e

MAP2K2

quinases, e histona deacetilase

HDAC1

também estavam na lista (Tabela 3). Embora as análises supervisionadas e não supervisionadas utilizados diferentes conjuntos de comparação, as listas de genes contido 10 entradas sobrepostas (Tabela 3).

Considerando o endometrioid-cluster versus o conjunto de balizas, determinou-se que o número e grau de Sites diferencialmente metilados aumentou em mais de uma ordem de magnitude. Por exemplo, 954 sondas foram significativas a p 0,01. O grande número de sites de hypermethylated sugere um defeito subjacente nas vias de metilação do DNA, e limita a utilidade de considerar metilação alterada de genes individuais.

Validação de metilação diferencial

Para explorar se o nosso conjunto de 60 diferencialmente locais metilados em tumores serosos foi reprodutível, avaliamos a metilação de 25 amostras adicionais que eram independentes do conjunto de análise original. Todos foram tipificados como carcinoma seroso do ovário e analisados ​​de forma independente (independente na apuração e no tempo da análise) dos originais. Para cada local e para cada amostra de validação, avaliamos se a metilação se assemelhava mais de perto o cluster amostra normal ou o cluster amostra de tumor seroso. Das amostras de tumor 25, 4 se assemelhava o padrão de metilação de amostras normais, sete foram alteradas em 21 ou mais dos 60 locais, e 14 amostras apresentaram o padrão alterado em 40 ou mais dos 60 locais (Figura 3).

a metilação a 60 loci foi usado para avaliar um conjunto independente de tumores serosa. Cada linha representa uma amostra individual; cada coluna corresponde a um dos sites diferencialmente metilados previamente identificados. Uma caixa vazia indica metilação mais similar ao conjunto de controlo (não necessariamente não metilado); uma caixa preta cheia indica metilação mais similar ao conjunto de tumores ovarianos serosas. As amostras são ordenados pelo número de sites com metilação que se assemelha ao grupo tumor seroso.

Avaliação de eventos de metilação publicados

A nossa análise de metilação diferencial focado em mudanças que definiram as características de cada grupo e foram compartilhados entre todas ou quase todas as amostras. Muitas mudanças importantes no estado de metilação, previamente relatados na literatura, têm menor prevalência e não estão directamente identificado por nossa abordagem. Quando avaliamos nossas amostras para os padrões de metilação conhecida, os nossos dados eram consistentes com os resultados publicados. Por exemplo,

BRCA1

foi hipermetilado em 2 dos 16 (12,5%) das amostras seroso do ovário. O supressor de tumor

RASSF1A

mostrou provas de metilação completa em 11 tumores, e de cópia única de metilação em mais de 4 (31% de seroso, e 60% de endometrióide). Estas mudanças, e outros, são susceptíveis de ser eventos transformadoras importantes, mas são restritos a subconjuntos menores das amostras

Gene ontologia via analisa

Para amarrar estes resultados para a literatura sobre câncer de ovário, foi realizada uma análise ontologia gênica (GO) e uma análise IPA dos genes diferencialmente metilados da comparação baseado em cluster de tumores serosos quando comparados aos controles. Os genes correspondentes aos loci metilado na nossa lista mostrou um enriquecimento estatisticamente significativa para os termos GO envolvendo regulação do ciclo celular (Tabela 4). As duas principais redes identificadas pelo IPA incluiu “do ciclo celular e celular Morfologia” e “Resposta Inflamatória” com dezenas de rede de 24 e 23, respectivamente. A pontuação de rede é baseado em uma distribuição hipergeométrica e é calculado com o teste exato de Fisher direito de cauda, ​​o que implica que existe um 1 em 10

23 ou 10

24 probabilidade de qualquer rede que ocorre a partir de uma lista aleatória de genes (Tabela 4, Figura S4, S5). Notavelmente, diferencialmente genes metilados teve uma grande presença nestas redes, interagindo com genes importantes no desenvolvimento do tumor de ovário, incluindo

AKT

,

PI3K

,

VEGF

e receptor de estrógeno.

Discussão

Este trabalho representa um dos maiores estudos de metilação usando vários subtipos normais e tumorais de cancros ginecológicos. Inicialmente analisou o estado de metilação de 27,578 locais em 49 amostras, incluindo tubo normal de Falópio e endométrio, câncer de ovário seroso, câncer de ovário endometrioid, cancro do endométrio endometrioid primários e metástases ovário do cancro do endométrio. Independentemente do tumor ou o estado normal, todas as amostras apresentaram perfis semelhantes na distribuição geral dos sites metilados. Embora não encontramos mudanças globais em direção a hiper ou hipometilação através das amostras testadas, um subconjunto de amostras apresentaram metilação drasticamente alterada para o cromossomo X, consistente com a perda do cromossomo X inativo, a amplificação dos restantes X ativo, ou ambos [28 ]. Exemplos de aneuploidia, incluindo os autossomos, são comuns no câncer de ovário seroso de alto grau e não estão directamente apurado por esta análise, mas influenciam os níveis de metilação proporcionais em cada locus. Por isso nós removemos todas as sondas no cromossoma X do nosso conjunto de dados.

Os nossos dados confirmam que diferentes subtipos histológicos têm padrões distintos de metilação. Além disso, os tumores serosos ovarianos são mais semelhantes aos tecidos ovariano e endometrial normais do que para tumores endometrióides ovário ou endométrio, que são muito semelhantes entre si e mostrar mudanças drásticas e coerentes na sua metilação. Este resultado é consistente com um fenótipo methylator e de acordo com um modelo de tumores ovarianos endometrióides decorrentes da endometriose, em que as células derivam em última análise, a partir de uma linhagem uterina. tumores endometrióides a partir da partilha dos ovários e do útero várias mutações somáticas comuns [6], e esses dados suportam um mecanismo patogênico similar. As diferenças marcantes nos perfis de metilação entre os subtipos histológicos sublinham a importância de caracterizar tumores no nível molecular, a fim de desenvolver estratégias de tratamento adaptado.

Para a identificação dos loci diferencialmente metilado, que usamos rótulos conhecidos e cego (data- dirigidas) subgrupos. etiquetas conhecidas identificadas algumas dúzias de genes, alguns com papéis caracterizado pelo câncer de ovário. No entanto, dada a barra rigorosas para significância estatística para testar um grande número de sites, verificou-se que alguns valores atípicos dentro de um grupo poderia obscurecer padrões importantes. Agrupando dados em uma abordagem imparcial, encontramos padrões de metilação semelhantes entre amostras normais e alguns valores discrepantes de tumor, indicando que as estratégias subtipagem histológicos atuais pode perder distinções moleculares importantes entre tumores. Este ponto foi ainda apoiada em tumores metastáticos endometrióides, que também continham um outlier que parecia uma amostra normal nos seus padrões de metilação. A nossa abordagem de agrupamento identificou claramente um conjunto de 500 genes que poderiam separar a maioria das amostras serosa a partir de amostras endometrióides e controles normais. Embora a aglomeração era distintivo para as três classes principais de amostras, a sua utilização excluída uma avaliação estatística da importância dos genes dentro do conjunto. No entanto, o aumento da potência de agrupamento 49 amostras identificou um 60 loci adicionais que eram independentes do conjunto de clusters e amostras segregados em subtipos normais ou serosa com significância estatística. Vários destes genes corresponde a redes implicados no desenvolvimento do cancro do ovário (Figuras S4 e S5). Nós investigamos a sobreposição entre as listas de genes de genes estatisticamente significativos identificados nas abordagens supervisionadas e não supervisionadas e encontraram 10 genes. Notavelmente, a quinase

PDPK1

é na via de sinalização de PI3K envolvidos no cancro do ovário seroso [37].

PDPK1

e

PLEKHF1

compartilhar um domínio de homologia plecstrina, capaz de se ligar polifosfatos inositol.

PARP3

está envolvida no reparo do DNA e estabilidade do genoma. Dado o sinal reprodutível a partir desses genes independentemente do método, podemos concluir que os genes não caracterizados dessa lista são fortemente implicado no desenvolvimento do tumor de ovário e exigem caracterização adicional.

A limitação da nossa análise é que nós não rastrear o tumor DNA para mutações do gene ou níveis de expressão génica ascertain; no entanto, descobrimos que

RB1 ​​

e

RBAK Quais são diferencialmente metilado entre as amostras trompa de Falópio serosa e normais papilares.

RB1 ​​

foi recentemente relatado por TCGA estar envolvido na etiologia do tumor seroso, através de mutação ou deleção em 67% dos tumores [38]. O envolvimento do

RB1 ​​

via é consistente com Rb1 concorrente e Mutações no gene TP53 em camundongos, que simula características de câncer de ovário seroso agressivas, incluindo a formação de ascite e metástase [39]. Embora não encontramos sobreposição significativa com a lista de genes metilados em tumores serosos publicados pela TCGA, essa discordância pode ser devido a questões metodológicas. Por exemplo, nós não limitar a lista de genes para os candidatos que se tornam hypermethylated e encontrados muitos que perdem a metilação. Além disso, o que é necessário que a pontuação seja consistente entre todos os tumores. limites TCGA marcando para o top 10% dos tumores. Além disso, nós não limitar os resultados de genes que se tornam silenciado, como a metilação foi mostrado para causar ambos os resultados regulatórios positivos e negativos [40].

A nossa análise de perfis de metilação em tumores do ovário e do endométrio indica o valor na caracterização tumores ao nível molecular. O fenótipo methylator indica uma aberração na função molecular de enzimas que regulam os níveis de metilação do DNA e sugere que a molécula actua a montante dos genes candidatos é responsável pela cascata de eventos que conduzem ao desenvolvimento de tumores. Estudos em carcinoma hepatocelular foram identificadas mutações no gene da beta-catenina em associação com um fenótipo methylator. Mutações em beta-catenin também são comuns em tumores do endométrio [1], e sugerir experimentos de acompanhamento para avaliar uma relação direta com a metilação do DNA em tumores endometrióides. Além disso, as estratégias terapêuticas destinadas a prevenir extensa metilação (tais como 5-aza-2′-desoxicitidina) deve ser avaliada no contexto dos tumores com um fenótipo methylator.

A consistência dos perfis de metilação, apesar de amostra independente preparação e coleta de dados para amostras TCGA, foi usado para validar e ampliar nossos resultados. Estes dados mostram que os efeitos do lote da amostra é mínima e não perturbar a consistência dos dados. Nossos dados fornecem uma base para futuras análises genômicas e genéticos dos tumores do endométrio e serosa para aplicações de diagnóstico e tratamento. Notavelmente, os nossos resultados mostram que os níveis de metilação em tumores serosas são menos consistentes do que os tumores endometrióides, mas aumentar e diminuir de uma forma dependente do alvo. Em contraste tumores endometrióides mostrar grandes mudanças que são provavelmente ligadas a um mecanismo a montante comum que deu errado.

Materiais e Métodos

Coleta de amostras

ovário, do endométrio e tecidos do tubo de falópio eram recebido do Programa de recolha de tecidos Magee-Womens Hospital (Pittsburgh, PA). Os tecidos foram congelados após a cirurgia e armazenado a -80 ° C. O ADN genómico foi isolado utilizando o Puregene Blood Kit (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante. qualidade do DNA foi avaliada usando um espectrofotômetro SmartSpec Plus (BioRad, Hercules, CA).

amostras normais endometriais

As amostras de tecido foram fornecidos pela Rede Human Tissue Cooperativa, que é financiado pelo National Cancer Instituto. As amostras são de indivíduos pós-menopáusicas com endométrio atrófico e foram obtidos a partir de histerectomia rotina ou ressecção pélvica para o câncer não-endometriais. O DNA foi isolado seguindo o protocolo de Trizol reagente (Invitrogen).

O uso de material sujeito humano foi aprovado pela Universidade de Pittsburgh e do Escritório de Seres Humanos Pesquisa do NIH.

TCGA dados

dados TCGA foram baixadas no momento desta análise a partir do portal de dados (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/dataAccessMatrix.htm). Dados extraídos do mesmo lote continha tumores serosos incomparáveis ​​e amostras de tubos de falópio normais. Normais: TCGA-01-0639-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0631-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0642-11A-02D-0383-05, TCGA-01-0628- 11A-01D-0383-05, TCGA-01-0637-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0633-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0630-11A-01D-0383-05, TCGA-01-0636-11A-01D-0383-05.