Abstract

O câncer de pâncreas foi encontrado com expressão anormal ou mutação em proteínas Ras. activação oncogénica Ras explora a sua grande alcance de sinalização para afectar vários processos celulares, em que a sinalização da proteína-quinase activada por mitogénio (MAPK) exerce um importante papel na tumorigénese. Terapias Ras visados ​​são, portanto, de grande benefício para o câncer de pâncreas. Embora pequena molécula APY606 foi escolhido com sucesso pela seleção da droga virtual baseado receptor alvo Ras, o seu mecanismo em profundidade continua a ser elucidado. Nós aqui avaliada a actividade anti-tumoral de APY606 contra Capan-1 e de células SW1990 linhas de cancro pancreático humano e explorado o efeito de Ras-MAPK e via de sinalização relacionados com a apoptose na actividade de APY606. APY606 tratamento resultou em uma inibição dose-dependente do tempo e da viabilidade das células do cancro. Além disso, APY606 exibiram actividade antitumoral forte, como evidenciado não só pela redução na invasão de células de tumor, a migração e potencial de membrana mitocondrial, mas também pela alteração de vários índices apoptóticos. Ras-GTP Além disso, o tratamento APY606 directamente inibidas e a activação a jusante de MAPK, o que resultou na diminuição da regulação da proteína anti-apoptótica de Bcl-2, que conduz ao aumento da regulação das proteínas relacionadas com a via de apoptose mitocondrial (Bax, citocromo citosólica

c

e caspase 3) e da quinase dependente da ciclina 2 e ciclina a, E. Estes dados sugerem que prejudicar a sinalização Ras-MAPK é um novo mecanismo de acção para APY606 durante a intervenção terapêutica no cancro pancreático.

Citation: Guo N, Liu Z, Zhao W, Wang E, Wang J (2016) pequena molécula APY606 Exibe actividade antitumoral extensiva em cancro do pâncreas através prejudicando Ras-MAPK sinalização. PLoS ONE 11 (5): e0155874. doi: 10.1371 /journal.pone.0155874

editor: Hiroyasu Nakano, da Escola de Medicina da Universidade de Toho, JAPÃO

Recebido: 29 de março de 2016; Aceito: 05 de maio de 2016; Publicado em: 25 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Guo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

financiamento:. os autores gostariam de agradecer as seguintes fontes de financiamento que apoiou esta investigação: National Natural Science Foundation da China (81573448, 11174105, 91227114 e 91430217), National Science Foundation (MCB- 0947767) e Natural Science Foundation da província de Jilin (20150101009JC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é uma doença mortal devido à classificação adenocarcinoma ductal pancreático o quarto lugar entre as mortes relacionadas com o cancro [1]. A natureza deste tumor é caracterizado por um mau resultado para todos os estágios da doença e apenas 1-4% dos pacientes com câncer pancreático ainda estão vivos em 5 anos do diagnóstico [2]. Vários esquemas de tratamento não melhorou significativamente a sobrevida dos pacientes [3,4]. Falha de quimioterapia no câncer de pâncreas é principalmente devido à resistência a múltiplas drogas e de reacções adversas dose-limitante. Até o momento, não se sabe como intracelular vias de sinalização levar a propriedades biológicas aberrantes em câncer pancreático. Além disso, continua a ser pouco conhecido sobre como inibições farmacológicas de vias de sinalização específicas melhorar a resposta das células cancerosas do pâncreas à quimioterapia convencional [5]. Assim, os futuros esforços no sentido do desenvolvimento da nova terapia para melhorar a sobrevivência ea qualidade de vida de pacientes com câncer de pâncreas deve incluir nova estratégia para explorar fármacos anticancerígenos eficazes [6].

proteínas Ras são os principais componentes de regulação que envolvem em condições normais o crescimento celular, diferenciação e transformação maligna [7]. Estima-se que cerca de 90% dos cancros pancreáticos têm sido encontrados com a expressão anormal ou a mutação em Ras proteínas [8]. activação oncogénica Ras explora seu extenso alcance de sinalização para afetar vários processos celulares, incluindo a supressão de apoptose e promoção da proliferação [9]. A morte celular programada, ou apoptose, é um processo fisiológico normal pelo qual célula individual morre e é removido a partir de uma dada população. A morte celular apoptótica iniciada tanto intrinsecamente com as funções da via mediada por mitocôndria como um mecanismo de defesa fundamental contra a malignidade, e a corrupção da maquinaria apoptótica é uma assinatura que define de células cancerosas [10]. erosão oncogénicas de Ras-driven da via apoptótica e a sua contribuição para cancros têm sido bem documentadas [11]. Entre as cascatas de sinalização a jusante de Ras, a proteína activada por mitogénio quinase (MAPK) cascata tem sido relatada a desempenhar papéis importantes no desenvolvimento de cancros [12-14]. Uma das funções principais, a via de Ras-MAPK em uma ampla variedade de células de mamíferos, é a regulação do ciclo celular de transição [15]. Os sinais proliferativos gerados por Ras oncogénicos culminar com a regulação para cima de vários factores de transcrição que desencadeia a expressão de ciclinas que atribuem à activação da via de Ras-MAPK. Oncogénica Ras pode promover a progressão do ciclo celular por inibição de quinases dependentes de ciclina (CDKs). O efeito supressor é mediada por várias vias efectoras Ras incluindo a via de Ras-MAPK [16,17]. Com nosso entendimento, a contribuição de Ras oncogénico a estes processos serão, sem dúvida, uma avenida emocionante da pesquisa do câncer no futuro próximo.

É bem sabido que as pequenas moléculas têm um papel vital na quimioterapia do cancro. Um inibidor de pequena molécula, APY606, foi escolhido por triagem de drogas virtual baseado em Ras alvo receptor em nosso trabalho recente [18]. No entanto, o mecanismo subjacente de propriedades anti-câncer é mal compreendida. Aqui, as investigações aprofundadas foram realizadas para avaliar sua natureza câncer de combate contra o cancro do pâncreas Capan-1 e células SW1990 linhas. Estes resultados mostram que a apoptose induzida por APY606 é atribuída à activação da via de apoptose mitocondrial intrínseca e a prevenção da via de cascata Ras-MAPK. Em paralelo, APY606 foi ainda encontrada para induzir a apreensão fase S e retardar a metástase nas duas linhas celulares, ao alterar a ativação Ras. Consequentemente, a nossa investigação irá estabelecer as bases para a descoberta de medicamentos Ras alvejado e para APY606 aplicação terapêutica no cancro pancreático.

produtos químicos e reagentes

meio de Eagle modificado por Dulbecco Materiais e Métodos

(DMEM), meio L-15 de cultura de células e soro fetal de bovino (FBS) foram obtidos da Gibco (Grand island, NY). Todos os outros reagentes foram adquiridos de Sigma (St. Louis, MO). APY606 foi gentilmente fornecer pelo NCI /DTP Abrir Chemical Repository (https://dtp.cancer.gov) e depois confirmada por HPLC e ESI-MS. Os anticorpos primários contra a caspase-3 humana, caspase-9, citocromo

C

, Bcl-2, Bax, c-Raf, ERK, Perk, MEK, pMEK, ciclina A, ciclina E e CDC2 foram adquiridos a partir de Santa Cruz e BD Bioscience, respectivamente. Os anticorpos contra a GAPDH humana e β-actina foram obtidos de Santa Cruz.

linhas de células e cultura de células

de cancro pancreático Capan-1 e de células SW1990 linhas humanos foram obtidos a partir do Banco de Célula Tipo cultura Colecção Academia chinesa de Ciências (Xangai, China) e cultivadas em DMEM e meio L-15 contendo 10% de FBS, 100 unidades /mL de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina, respectivamente. As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2 incubadora. No processo de cultura de células, não houve qualquer efeito de micoplasmas sobre as duas linhas celulares, o qual foi confirmado por um ensaio de coloração de ADN fluorocromo. APY606 foi dissolvido em DMSO (sulfóxido de dimetilo), e recentemente diluído para a concentração desejada com água duplamente destilada imediatamente antes da utilização. A concentração final de DMSO no meio de cultura é de 0,1% (v /v). As células de controlo receberam o veículo que consiste de água duplamente destilada contendo 0,1% de DMSO única, que não afecte significativamente as células.

Crescimento ensaio de inibição

A contagem celular Kit-8 (CCK-8 ensaio) (Dojindo, Japão) foi realizado para examinar o efeito de APY606 na citotoxicidade. Resumidamente, as linhas Capan-1 e SW1990 de células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 1 x 10

4 células /poço num volume de 100 uL. Após incubação durante a noite, as células foram tratadas com várias concentrações de APY606 durante 24 h e 48 h, respectivamente. As células foram então expostas a 10 uL de CCK-8 reagente durante 3 h; a densidade óptica a 450 nm foi lida com um M200 PRO AutoReader NanoQuant (TECAN, Suíça). Neste ensaio, a CCK-8 não interfere com APY606 e causar uma resposta positiva. As medições realizaram-se pelo menos cinco vezes.

ensaio de formação de colónias

Para testar a sobrevivência das células tratadas com APY606, Capan-1 e linhas de células SW1990 foram semeadas em placas de 24 poços ( 200-300 células por poço) e deixadas a aderir durante 24 h. As células foram incubadas em meio de cultura contendo APY606 com as concentrações de 2, 4, 6, 8 e 10 ug /ml durante 6 dias. Depois disso, as células foram fixadas com metanol e coradas com Giemsa e 5% de colónias (mais de 50 células) foram contadas sob um microscópio invertido (AMG EVOS, vida).

A coloração nuclear ensaio

a condensação nuclear induzida por APY606 e alterações morfológicas foram detectados utilizando DAPI (4,6-diamidino-2-fenilindole). linhas celulares Capan-1 e SW1990 (5 × 10

6 células por placa) foram cultivadas em placas com fundo de vidro a 50% de confluência e, em seguida, cultivadas no meio, na presença de 6,25, 12,5 e 25,0 ug /ml APY606 para 24 h, respectivamente. As células foram fixadas com paraformaldeído a 3,5% e, em seguida, incubadas num fluido contendo 2 mg /mL de DAPI durante 20 min. A morfologia nuclear de células foi observada por microscopia de fluorescência (AMG EVOS, vida).

A quantificação da apoptose das células

No início da apoptose, a fosfatidilserina (PTS) é translocado para a membrana celular externa e pode ser identificados através da ligação de anexina V, um ligando para o PTS. Apoptótica Capan-1 e células SW1990 foram quantificados usando a Anexina isotiocianato (FITC), kit de detecção de apoptose V-fluoresceína (Abcam, Reino Unido), depois as células foram tratadas com APY606 em diferentes concentrações (6,25 e 12,5 ug /ml) durante 24 h. Resumidamente, as células foram tripsinizadas e lavadas duas vezes com PBS frio, e em seguida, as células foram ressuspensas a uma densidade de 1 x 10

6 células /ml em tampão de ligação (HEPES 10 mM /NaOH, pH 7,4, 140 mM de NaCl, 2,5 CaCl mM

2). Em seguida, as células foram incubadas com 5 mL de anexina V-FITC e PI 5 ul no escuro durante 15 min à temperatura ambiente e submetida a análise citométrica de fluxo (FACSAria, BD Biosciences). No total, foram analisados ​​10000 eventos para cada amostra. A análise dos dados foi realizada com o software diva 6,0 (BD Biosciences).

Medição da membrana mitocondrial potencial

Perturbação do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) é uma assinatura característica da apoptose em uma via relacionada-mitocondrial . ΔΨm pode ser medido utilizando a sonda fluorescente de JC-1. Resumidamente, as linhas Capan-1 e SW1990 de células foram semeadas em placas de 6 poços (5 x 10

5 células por poço) e tratou-se com APY606 na concentração de 6,25 e 12,5 ug /ml durante 24 h. As células foram lavadas com PBS e incubadas em 500 ul solução de trabalho de JC-1 a 37 ° C em 5% de CO

2 durante 20 min. Em seguida, as células foram ressuspensas em tampão de incubação 500 uL, seguido de visualização usando o microscópio confocal de varrimento de laser (CLSM, Leica TCS SP2). JC-1 foi excitado pela luz do laser de 488 nm e emissão foi capturado a 530 nm [19]. A diminuição da relação da intensidade de fluorescência vermelho /verde indica que a perda de ΔΨm em células cancerosas.

Determinação de Ras-GTP

linhas celulares Capan-1 e SW1990 foram cultivadas em meio completo, durante a noite, fome durante 8 horas em meio contendo 1% de FBS e depois tratou-se durante 24 h com várias concentrações de APY606. No final do tratamento, as células foram estimuladas com EGF (10 ng) durante 10 min. Em seguida, as células foram lisadas e o lisado celular foi processado por um kit de ensaio de activação de Ras (Upstate, Millipore). O total de Ras e as proteínas Ras activas foram detectadas utilizando o ensaio de transferência de Western, como descrito abaixo.

Fluxo quantificação citométrica de pERK

A quantidade de expressão de cinase regulada por sinal extracelular fosforilada (pERK) era um leitura de Ras-MAPK via cascata. Para medir a extensão de inibição de ERK activação experimentalmente, análise citométrica de fluxo foi utilizado para obter uma medição de uma única célula quantitativa da quantidade de pERK. Resumidamente, as linhas Capan-1 e SW1990 células foram tratadas com APY606 na concentração de 6,25 e 12,5 ug /ml durante 24 h, em seguida, fixadas e permeabilizadas utilizando Cytofix /Cytoperm Kit (Becton Dickinson, Mountain View). Após centrifugação, adicionou-se 0,05 mg de anticorpo por poço em 100 ul mistura de anticorpo para um anticorpo 2 Alexa Fluor 488 conjugado ERK1 /(anti-fosfo-p44 /42 MAP cinase, Thr202 /Tyr204, BD Bioscience) e incubadas durante 1 h em gelo . Após a lavagem, as amostras foram analisadas usando fluorescência classificador de células activadas FACSAria (BD Bioscience) e a percentagem de células coradas em cada quadrante foi quantificada utilizando software de diva 6,0 (BD Bioscience). No total, foram analisados ​​10000 eventos para cada amostra. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes.

ciclo celular análise

Para testar o mecanismo potente de inibição do crescimento celular induzida por APY606, o efeito do tratamento APY606 sobre a distribuição do ciclo celular foi explorada por fluxo citometria. Resumidamente, as linhas Capan-1 e SW1990 células foram semeadas (1 × 10

6 células por poço em placas de 6 poços) e tratou-se com APY606 na concentração de 6,25 e 12,5 ug /ml durante 24 h, respectivamente. As células foram suspensas, fixado em 70% (v /v) de etanol a 4 ° C durante a noite. Em seguida, as células foram lavadas e ressuspensas em 1 mL de PBS contendo 50 ug /ml de PI e 1 mg /ml de ARNase A, a temperatura ambiente no escuro durante 30 min. No total, 10000 eventos foram analisados ​​imediatamente em cada amostra por citómetro de fluxo (FACSCalibur, BD Biosciences). Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes.

Cicatrização de feridas ensaio

Para explorar a influência de APY606 sobre a capacidade da motilidade das células de cancro, cura de feridas ensaio foi realizado para avaliar a motilidade das células de APY606 células tenha sido tratada com. linhas celulares Capan-1 e SW1990 foram plaqueadas em pratos de 24 cavidades de cultura e depois marcados utilizando uma ponta de micropipeta. O meio foi substituído por 12,5 mcg /ml APY606 no meio completo, e a migração celular foi monitorizada usando CLSM, durante 24 h. As imagens foram capturadas e a distância de fecho de feridas (comparado com o controlo a 0 h) foi medida em três locais independentes de feridas por grupo. motilidade celular relativa é comparada como a diferença de largura ferida entre a 0 he às 24 h.

Trans-well ensaio de câmara

Para examinar o efeito do APY606 na capacidade de invasão das células cancerosas , ensaio de câmara de trans-bem Matrigel foi realizada. Capan-1 e de células SW1990 linhas foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 2 × 10

5 células /poço e cultivadas durante 24 h. Após as células foram privadas durante 24 h, as células foram tratadas com 12,5 ug /ml APY606. Em seguida, as células foram recolhidas e 1 × 10

5 células diluído com meio isento de soro foram plaqueadas para unidades de trans-poços com filtros de policarbonato (Cambridge, MA) contendo poros de 8 ^ m. A membrana de policarbonato foi pré-revestida com 250 ug /ml de Matrigel (BD Biosciences). As câmaras inferiores foram cheias com 600 uL meio contendo 5% de FBS. Após 24 h, as células foram fixadas em metanol e coradas com laranja de acridina (AO, Dingguo, China). A superfície superior da membrana foi suavemente esfregada com um botão de algodão, e as células invasoras através da membrana filtros foram contados em placas de cultura de fundo de vidro, e as imagens correspondentes à superfície da membrana inteira foram capturados por MCVL.

Western borrando análise

a fim de esclarecer os mecanismos subjacentes para a apoptose celular induzida APY606 e interrupção do ciclo celular a nível molecular, foram examinadas as análises de mancha Western. linhas Capan-1 e de células SW1990 foram lavadas com PBS frio, depois de 24 h de tratamento com APY606 na concentração de 6,25 e 12,5 ug /mL. Depois de as proteínas celulares foram extraídos e quantificados, uma quantidade igual de proteína foi sujeito a electroforese em gel de SDS-PAGE a 10% e, em seguida, transferidos para difluoreto de polivinilideno (PVDF) de membrana (Millipore, Bedford, MA). Posteriormente, a membrana de PVDF foi sondada com o anticorpo primário indicado durante a noite a 4 ° C e depois colocados a hibridar com anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano apropriado. A visualização foi realizada utilizando detector de quimiluminescência (DNR, Kiryat Anavim, Israel). nível de proteína foi normalizada utilizando GAPDH ou β-actina como um controlo interno.

A análise estatística

Os dados são apresentados como média ± desvio padrão de experiências em triplicado. A análise estatística foi realizada usando SPSS 11.5 software estatístico.

Resultados

1. APY606 inibe a proliferação de Capan-1 e linhas de células SW1990

Para explorar o potencial de inibição do crescimento de APY606 nas duas linhas de células de cancro, os efeitos inibidores dependentes da concentração de APY606 sobre o crescimento de células Capan-1 e SW1990 linhas foram avaliadas como mostrado na Figura 1A. Quando as células Capan-1 foram tratados com APY606 na concentração de 12,5, 25,0 e 50,0 ug /ml durante 24 h, a percentagem de inibição do crescimento sobre as células de controlo (100%) foi de cerca de 21,0 ± 2,6%, 81,3 ± 0,5% e 93,3 ± 0,6%, respectivamente. Por conseguinte, a percentagem de células SW1990 inibidos sobre as células de controlo (100%) foi de 52,3 ± 1,5%, 82,3 ± 0,6% e 90,0 ± 1,0%, respectivamente. Quando as células Capan-1 foram tratados com APY606 nas mesmas condições durante 48 h, a percentagem de inibição do crescimento sobre as células de controlo (100%) foi de cerca de 50,0 ± 1,7%, 90,0% e 93,0%, respectivamente. Enquanto isso, a percentagem de células SW1990 inibidos sobre as células de controlo (100%) foi de 71,7 ± 3,2%, 75,3 ± 1,5% e 87,3 ± 2,3%, respectivamente. A IC

50 valor para APY606 foi de 14,3 ± 1,3 ug /ml (24 h) e 9,5 ± 0,6 ng /mL (48 h) em células Capan-1, bem como 10,3 ± 1,1 ug /ml (24 h) e 6,8 ± 2,3 ug /ml (48 h) em células SW1990, respectivamente. Além disso, temos também estudou o efeito da APY606 sobre a taxa de sobrevivência de Capan-1 e células SW1990 linhas por ensaio de formação de colónias. APY606 tratamento resultou numa inibição significativa da formação de colónias em duas linhas celulares de um modo dependente da dose (Fig 1B). Colectivamente, os nossos resultados indicaram que APY606 induzida efeitos inibidores dependentes da concentração sobre o crescimento e sobrevivência de ambas as linhas celulares Capan-1 e SW1990.

As células foram tratadas com as concentrações indicadas de APY606 para 24 e 48 h e, em seguida, avaliada por CCK-8 (A) e ensaio de formação de colónias (B), respectivamente. Os dados apresentados são a média ± DP de três experiências independentes. imagens coloração nuclear (C) foram tiradas por microscópio de fluorescência com 10 × objetiva. A barra de escala foi de 20 uM.

Além disso, a morfologia nuclear de células foi detectada por DAPI, que é um corante fluorescente azul, especialmente ligação de regiões ricas em A-T no ADN. DAPI pode passar através de uma membrana celular intacta, por conseguinte, ele pode ser usado para corar as duas células vivas e fixas, embora ele passa através da membrana de menos eficientemente em células vivas e, por conseguinte, a eficácia da mancha é inferior. A intensidade de fluorescência azul em Capan-1 e de células SW1990 linhas tratados com APY606 na concentração de 6,25, 12,5, e 25,0 ug /ml durante 24 h era mais forte do que em grupos de controlo tratados com veículo, como mostrado na Figura 1C. Além disso, é evidente que os núcleos condensados ​​e fragmentados aumentou com o tratamento APY606 de um modo dependente da concentração.

2. APY606 induz apoptose de Capan-1 e de células SW1990 linhas

para avaliar o efeito de indução de apoptose em linhas de APY606 Capan-1 e SW1990 celulares, o número de células apoptóticas foi quantificada usando análise de citometria de fluxo. Células coradas positivas para anexina V-FITC e negativo para PI são submetidos a apoptose; células coradas positiva tanto para anexina V-FITC e PI são ou na fase final de apoptose sofrer necrose ou já está morto; células coradas negativo tanto para anexina V-FITC e PI estão vivos sem sofrer apoptose [20]. Como mostrado na Fig 2A, o número de células apoptóticas foi insignificante (0,4-1,0%) nas células das duas linhas de células tratadas com veículo de controlo. Embora a percentagem de células apoptóticas precoces foi aumentada para 21,3 ± 3,5% e 50,4 ± 5,5% após células Capan-1 foram tratados com APY606 a 6,25 e 12,5 ug /ml durante 24 h, respectivamente. Durante 48 h de tratamento, os valores aumentaram para 22,0 ± 2,3% e 54,4 ± 6,2%, respectivamente. Da mesma forma, nas mesmas condições, os valores foram de 23,4 ± 2,4% e 63,9 ± 7,2%, bem como 49,9 ± 3,5% e 75,1 ± 6,3% após as células foram expostas a SW1990 APY606 durante 24 h e 48 h, respectivamente. Os resultados mostraram claramente que APY606 induziu uma apoptose tempo e dependente da concentração na Capan-1 e de células SW1990 linhas.

Percentagens de populações de células apoptóticas em duas linhas de células tratadas com 6,25 e 12,5 ug /ml de APY606 durante 24 e 48 h foram determinados utilizando citometria de fluxo (a). Os dados apresentados são a média ± DP de três experiências independentes. Efeito do tratamento APY606 nas proteínas relacionadas com a via de apoptose foi medida usando a análise de transferência de Western. blots representativos de proteínas respectivas foram exibidos (B). GAPDH foi usada como um controlo interno. (C):. Densidade relativa de proteína alvo foi quantificada e representada graficamente

Para investigar o mecanismo responsável pela apoptose induzida por APY606, foram avaliados os níveis de Bax, Bcl-2, citocromo citosólico

c

, e a activação de caspase-3 e caspase-9 em Capan-1 e de células SW1990 linhas tratados com APY606 na concentração de 6,25 e 12,5 ug /ml durante 24 h, usando análise de Western blotting. Os efeitos do tratamento APY606 sobre os níveis de proteína pro-apoptótica expressão do Bax e proteína anti-apoptótica de Bcl-2 foram examinadas experimentalmente. O tratamento de células aumentou significativamente o nível de expressão da Bax, mas diminuiu a de Bcl-2 de um modo dependente da concentração (Fig 2B). Citocromo

C

é um dos mediadores centrais da mitocondrial ou via apoptótica intrínseca. A libertação de citocromo

C

do espaço intermembranar mitocondrial é o evento precoce durante a morte celular por apoptose [21]. Como tal, os efeitos do tratamento APY606 na libertação de citocromo

C

nas duas linhas celulares foram avaliadas. Observou-se a exposição de células a APY606 para aumentar a libertação de citocromo

C

de mitocôndrias em citosol de um modo dependente da concentração (Figura 2C). Após estimulação apoptótica, citocromo

C

divulgados associados com pro-caspase-9 para formar uma caspase-9 processamento complexo de proenzima inactiva na sua forma activa, eventualmente, provocando a activação e a apoptose [21] a caspase-3. Como mostrado na Fig 2B e 2C, APY606 activação induzida extremamente dependente da concentração da caspase-3 e caspase-9 e, eventualmente, conduziu à morte por apoptose em linhas Capan-1 e de células SW1990.

3. APY606 induz ΔΨm

O esgotamento dos ΔΨm é uma resposta rápida e essencialmente apoptótica à terapia anti-câncer. perturbação mitocondrial inicia o processo de apoptose, o que subsequentemente conduz à inibição do crescimento. Para explorar ainda mais o mecanismo de apoptose celular induzida APY606, determinou-se o efeito de APY606 em ΔΨm em Capan-1 e células SW1990 linhas. O corante catiónico JC-1 é útil para detectar ΔΨm ocorrendo na fase inicial da apoptose [22]. Em células vivas, JC-1 exibe um potencial de acumulação dependente nas mitocôndrias conduzindo à formação dependente da concentração de fluorescência vermelha J-agregados [23] que é indicativo da presença de mitocôndrias polarizadas. Em despolarização, de ligação JC-1 monômero com resultados de membrana mitocondrial em fluorescência verde e uma redução na coloração vermelho-alaranjada. Assim, a despolarização mitocondrial é indicado por uma diminuição no rácio de intensidade de fluorescência vermelho /verde. A relação de vermelho para verde fluorescente é apenas dependente do potencial de membrana e não de outros factores tais como o tamanho mitocondrial, forma e densidade que podem influenciar os sinais de fluorescência de um único componente.

Aqui, o controlo e APY606-tratada linhas celulares Capan-1 e SW1990 coradas com JC-1 foram monitorizadas por MCVL. Tal como mostrado na Fig 3, a formação de agregados de J-vermelho fluorescente foi significativamente reduzida nas duas linhas de células tratadas com 6,25 e 12,5 ug /ml APY606 comparação com as células de controlo. Em contraste, a fluorescência verde era particularmente observado em células tratadas com APY606 devido à JC-1 monómero de ligação. A razão de fluorescência vermelha para verde foi aumentada em células tratadas com APY606 de um modo dependente da concentração, o que sugere que a alteração da fluorescência era indicativo de ΔΨm. Perda de ΔΨm foi observada em tratamento APY606, sugerindo que as mitocôndrias são particularmente afectadas precocemente durante o processo apoptótico.

A células tratadas com APY606 controlo e coradas com JC-1 foram monitorizadas por MCVL. A forma J-agregados (fluorescência vermelha) e J-monômero sozinho (fluorescência verde) foram animado com 568 e 480 nm, respectivamente. A barra de escala foi de 20 mm.

4. APY606 inibe Ras-MAPK via indução de resposta apoptótica

Com o intuito de avaliar a estratégia terapêutica Ras possivelmente segmentada, examinamos primeiro a inibição da actividade de Ras-GTP no ensaio baseado em células. Em teoria, APY606 irá actuar para diminuir o nível de actividade de Ras-GTP. Para dar conta desta previsão, o efeito de APY606 em células de câncer de pâncreas foi avaliada utilizando o ensaio de pull-down Raf1RBD. Como previsto, a extensão de activação de Ras em Capan-1 e SW1990 foram substancialmente reduzida na presença de APY606 de uma forma dependente da dose sem uma diminuição significativa no nível total de Ras (Figura 4) privadas de soro.

células privadas de soro foram tratadas com veículo ou concentrações indicadas de APY606 durante 24 h, e, em seguida, estimulada com EGF durante 10 minutos. APY606 atenua a activação de Ras celular em Capan-1 (A) e linhas de células SW1990 (B). GTP-bound Ras foi isolado por ensaio de pull-down RBD e detectados por kit de ativação de Ras-GTP. quantidade total de Ras foi detectada por anticorpo específico anti-Ras. densidade relativa de proteína alvo foi quantificada e representada graficamente.

quinases

Raf são os mais conhecidos como reguladores-chave da cascata de Ras-MAPK, e o bloco de Ras-MAPK via de sinalização tem um papel importante na indução de apoptose de células de cancro [24]. Para verificar o mecanismo subjacente da indução de apoptose, que avaliou o efeito do APY606 em Ras-MAPK percurso em ambas as linhas celulares Capan-1 e SW1990. Tratamento das duas linhas celulares com APY606 a 6,25 e 12,5 ug /ml durante 24 horas diminuiu significativamente a fosforilação de MEK e ERK em comparação com as células de controlo (Fig 5A e 5B). No entanto, a exposição das duas linhas celulares para APY606 não afectou os níveis totais de MEK e ERK. Notavelmente, o nível de expressão de c-Raf foi significativamente diminuída com o aumento da concentração de APY606 quando em comparação com as células de controlo. Este resultado mostrou que APY606 apoptose induzida pelo bloqueio dos Ras-MAPK via de sinalização.

lisados ​​celulares foram analisados ​​em imunotransferência com o respectivo anticorpo primário seguido de um segundo anticorpo e os blots representativos foram medidos. GAPDH foi usada como um controlo interno. densidade relativa de proteína alvo foi quantificada e representada graficamente. Fluxo de detecção de citometria de fosfo-ERK foi realizada em ambas as linhas Capan-1 e de células SW1990 (C). Os dados apresentados são a média ± DP de três experiências independentes.

De um modo geral, o grau de vantagem foi considerado como um indicador de activação de Ras [25]. Com base nisso, que simultaneamente realizada uma análise de citometria de fluxo para a obtenção de medições de uma única célula quantitativa. Como mostrado na Fig 5C, APY606 causou a produção de menos pERK em Capan-1 (76,7 ± 1,2%) e SW1990 (46,3 ± 2,6%) linhas celulares de 12,5 ug de dose /mL do que em células de controlo tratados com veículo, respectivamente, em acordo com a tendência de análise de Western blot.

5. APY606 prende o ciclo celular na fase S

Muitos agentes citotóxicos paragem do ciclo celular em G1, S ou fase G2-M [26]. Para avaliar o mecanismo de inibição do crescimento celular induzida por APY606, o efeito sobre a distribuição de APY606 ciclo celular foi explorada em primeiro quantitativamente Capan-1 e de células SW1990 linhas utilizando análise de citometria de fluxo. Tratamento das duas linhas celulares com APY606 a 6,25 e 12,5 ug /ml durante 24 h marcadamente alterou o número de células em fases G1 e S a uma forma dependente da concentração, mas o número de células em fase G2 notavelmente não foi alterada em comparação para as células de controlo (Fig 6A). Após o tratamento de Capan-1 com as células APY606 a 12,5 ug /ml, o número de células paradas na fase G1 foi 62,83% em comparação com células de controlo; isto resultou numa diminuição de 18,78% (p = 0,027). Ao mesmo tempo, a percentagem de células paradas em fase S era 35,59%; isto deu um aumento de 18,09% (p = 0,043) em comparação com as células de controlo tratadas com apenas veículo. Para a distribuição de células SW1990 nas fases G1 e S, exposição de células a APY606 deu origem a um efeito mais notável. O tratamento de células SW1990 com APY606 a 12,5 ug /ml reduziu significativamente o número de células em fase G1 presos por 32,84% (p = 0,002) e aumentou o número de células em fase S por 33,57% (p = 0,042), respectivamente. Estes dados indicaram que APY606 resultou na inibição do crescimento que provocou uma acumulação de destaque, prolongada de células em fase S e uma redução de células na fase G1 em ambas as linhas celulares Capan-1 e SW1990.

Capan-1 e SW1990 As linhas celulares foram tratadas com as concentrações indicadas de APY606 durante 24 h. percentagens representativos de populações de células em G1, S, G2 e fases do ciclo celular nas duas linhagens de células foram analisadas por citometria de fluxo (A). proteínas relacionadas com a transição G1-S foram analisadas utilizando um ensaio Western blot (B). Experiências semelhantes foram repetidas pelo menos três vezes com resultados semelhantes e os blots representativos foram apresentados. β-actina foi utilizada como controlo interno. densidade relativa de proteína alvo foi quantificada e representada graficamente (C).

a progressão do ciclo celular é fortemente regulada por ciclinas e CDKs. As expressões reduzidas de ciclina A, ciclina E e CDK2 são as marcas de paragem do ciclo celular na fase S. A fim de examinar qualitativamente o mecanismo de paragem do ciclo celular induzida por APY606, discutimos o efeito do tratamento APY606 sobre os níveis de expressão de ciclina A, ciclina E e CDC2 em Capan-1 e de células SW1990 linhas utilizando o ensaio de transferência de Western.