Abstract

(-) – epigalocatequina-3-galato (EGCG) é o mais extenso polifenóis do chá estudados para a sua função anti-câncer. Neste estudo, relatamos um novo mecanismo de acção para a morte celular mediada por EGCG, identificando o papel crítico da permeabilização da membrana lisossomal (LMP). Em primeiro lugar, a morte celular induzida por EGCG em células de cancro humano (HepG2 e HeLa ambos) foi encontrado para ser acompanhada por vacuolização e citosólica evidente caspase-independente, apenas se pode verificar quando as células foram tratadas, em meio isento de soro. A vacuolização citosólica observado nas células tratadas com EGCG foi provavelmente causado pela dilatação do lisossoma. Curiosamente, EGCG foi capaz de interromper o fluxo autofágica na fase de degradação por comprometimento da função lisossômico, e morte celular induzida por EGCG foi independente da Atg5 ou autofagia. A principal conclusão deste estudo é que EGCG é capaz de desencadear LMP, como evidenciado por coloração Lyso-Tracker Vermelho, translocação catepsina D citosólica e acidificação citosólica. Consistentemente, um agente lysosomotropic, cloroquina, efetivamente resgata a morte celular via suprimindo acidificação citosólica LMP-causado. Por fim, descobriu-se que EGCG promove a produção de ROS intracelular a montante de LMP e a morte celular, tal como evidenciado pelo aumento do nível de ROS nas células tratadas com EGCG e os efeitos protectores do antioxidante N-acetilcisteína (NAC) contra LMP e a morte celular mediada por EGCG . Tomados em conjunto, os dados do nosso estudo revelam um novo mecanismo subjacente a morte celular induzida por EGCG envolvendo ROS e LMP. A compreensão dessa via de morte celular associada a lisossoma lançar novas luzes sobre os efeitos anti-câncer de EGCG

Citation:. Zhang Y, Yang ND, Zhou F, Shen T, Duan T, Zhou J, et al . (2012) (-) – epigalocatequina-3-galato Induz Non-apoptóticos morte celular em células cancerosas humanas via ROS-Mediated Lisossomal Membrane permeabilização. PLoS ONE 7 (10): e46749. doi: 10.1371 /journal.pone.0046749

editor: Shi-Yong Sun, da Universidade Emory, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de julho de 2012; Aceito: 04 de setembro de 2012; Publicação: 08 de outubro de 2012

Direitos de autor: © Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi em parte apoiado por bolsas de investigação da China National Natural Science Foundation (81028014 e 81172659 para ZXQ e SHM) e de Singapura Conselho de investigação médica Nacional (NMRC /1260/2010-IRG09nov070 para SHM). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os benefícios do consumo de chá para a saúde têm sido bem estabelecida através de vários estudos em humanos. A maioria de tais benefícios, incluindo a prevenção de câncer e doenças cardiovasculares, têm sido atribuídas aos componentes polifenólicos no chá [1]. Como componente mais abundante e biologicamente ativa entre os polifenóis do chá, (-) – epigalocatequina-3-galato (EGCG) recebeu uma grande dose de atenção na pesquisa do câncer [2]. Até à data, os mecanismos subjacentes à função anti-cancro de EGCG têm sido estudados extensivamente. Sabe-se que o EGCG se pode ligar a múltiplos alvos moleculares, incluindo receptores transmembranares cinases, ou outras proteínas principais, afecta, portanto, uma variedade de vias de sinalização, resultando em inibição do crescimento, a apoptose ou supressão de invasão, angiogénese e metástase [3]. Entre eles, a capacidade de EGCG para indução de morte celular em células cancerosas é considerado como um dos mecanismos fundamentais relacionados com a sua função de anti-cancro [4]. No entanto, os mecanismos moleculares exactos para a morte celular induzida por EGCG ainda não foram completamente elucidados. A maior parte dos relatórios anteriores concluíram que o EGCG induz a apoptose mediada por caspases em várias células tumorais pela via mitocondrial [5], [6] ou através do receptor de morte [7], enquanto apenas alguns estudos demonstraram a morte de células não-apoptose causada por EGCG [8], [9].

Entre os vários mecanismos de morte celular mediada por EGCG, espécies reativas de oxigênio (ROS) e estresse oxidativo parece ser particularmente importante. Embora EGCG com uma estrutura do tipo de pirogalhol no anel B processa uma forte actividade antioxidante, esta estrutura é provou ser instável no sistema de cultura de células [10]. A auto-oxidação de EGCG em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), produz uma quantidade substancial de ROS, especialmente H

2O

2, o qual desempenha um papel importante no efeito citotóxico de EGCG contra linhas celulares de cancro [11], [12]. A adição de anti-oxidantes no meio de cultura foi relatado para inibir a apoptose induzida por EGCG [13], [14]. Recentemente, os envolvimentos de ROS e estresse oxidativo na morte celular não-apoptótica ou necrose têm vindo a aumentar apreciada [15]. Portanto, é de interesse para melhor compreender o papel das ROS e stress oxidativo na morte celular mediada por EGCG, incluindo tanto a apoptose e morte celular não apoptótica.

Os lisossomas são organelos citoplasmáticos fechado por uma membrana que contêm enzimas hidrolíticas e que controlam o volume intracelular /degradação de macromoléculas [16]. Nos últimos anos, a função biológica dos lisossomos tem sido cada vez mais apreciados, e é conhecida por desempenhar um papel crítico em diversos processos fisiológicos, tais como autofagia e em doenças humanas, tais como as doenças de armazenamento lisossómico, cancro e doenças neurodegenerativas [17]. proteases lisossomais, que são realizadas dentro da membrana em condições normais, iria vazar para o citosol, tanto apoptose e necrose [18]. Um processo chave que é conhecido por ser estreitamente associado ao processo de morte celular é a permeabilização da membrana lisossomal (LMP) [19]. O resultado exacto de LMP é dependente da extensão de dano da membrana lisossomal. Uma ruptura maciça dos lisossomos e rápida liberação de seu conteúdo ácidas são muitas vezes um passo crítico para a necrose; enquanto o vazamento parcial do lisossoma e selectiva é frequentemente associada com o processo apoptótico [20], [21]. Há muitos fatores conhecidos por danificar a integridade da membrana lisossomal e causar LMP, incluindo ROS, detergentes lysosomotropic, toxinas de microtúbulos e alguns lipídios [17], [19]. Por exemplo, alguns agentes anti-cancro tais como a vincristina e siramesine são conhecidos por causar morte celular dependente de lisossoma-[22], [23]. Até agora, não se sabe se o lisossoma está implicado na morte celular induzida por EGCG em células cancerosas.

Neste estudo teve como objetivo analisar os mecanismos moleculares subjacentes à morte celular mediada por EGCG. Os nossos resultados mostram pela primeira vez que EGCG induz uma forma de morte celular não apoptóticas caspase-independente, que pode ser significativamente aumentada no meio isento de soro. Em segundo lugar, verificou-se que EGCG desencadeia LMP, resultando em vazamento de suas proteases chave (catepsinas) para o citosol e morte celular. Curiosamente, tal morte celular independente da autofagia. Finalmente, fornecemos provas claras de que o EGCG promove intracelular ROS formação que funciona como um processo chave levando à LMP e morte celular. Portanto, os dados deste estudo identificar um mecanismo de morte celular induzida por nova EGCG em células de cancro que envolve o stress oxidativo, danos lisossomal e, eventualmente, morte celular.

(A) privação de soro promove a morte celular induzida por uma concentração em EGCG dependente e tempo de curso maneira. As células HepG2 foram tratadas com diferentes doses de EGCG em meio completo ou isento de soro durante 12 h (painel da esquerda) ou com 60 fiM de EGCG por horário diferente, tal como indicado (painel da direita). A viabilidade das células foi determinada por coloração dupla Hoechst-PI (n = 3, média ± DP). (B) imagens representativas de dupla coloração Hoechst-PI. As células HepG2 foram cultivadas em meio completo (como um controlo); tratou-se com 60 uM de EGCG por 12 h em meio isento de soro; ou incubadas com 20 ng /ml de TNFa e 10 ug /ml CHX durante 12 h em meio completo (como um controlo positivo para a apoptose). (C) EGCG induz a morte celular independente de caspases. As células HepG2 foram tratadas com EGCG (60 uM × 24 h) ou na ausência ou na presença de 40 uM de Z-VAD-fmk. O co-tratamento com TNFa (20 ng /ml) e CHX (10 ug /ml) durante 12 h foi usada como um controlo positivo. A viabilidade celular foi determinada como descrito no Painel A. **

p Art 0,005 em comparação com o grupo sem z-VAD (Student

t

-teste, n = 3). (D) Nenhuma ativação caspase-3 e causa clivagem PARP por morte celular induzida por EGCG. As células foram tratadas com EGCG ou TNF /CHX conforme descrito no painel C, e os lisados ​​celulares foram recolhidos e sujeitos a western blot.

Materiais e Métodos

produtos químicos, reagentes e anticorpos

(-) – epigalocatequina-3-galato (EGCG, 90%) foi adquirido a Universidade de Zhejiang Instituto de Pesquisa de chá. 5- (e-6) -Clorometil-2 ‘, 7’éster diacetato acetil-dichlorodihydrofluorescein (CM-H

2DCFDA), Hoechst33342, e liso-Tracker® vermelho (NI-99) foi obtido a partir de Invitrogen. z-VAD-fmk era a forma Enzo. laranja de acridina era de Immunochemistry Technologies. E-64D e N-acetilcisteína foram de Merk. iodeto de propídio (PI), digitonina, cloroquina (CQ), bafilomicina A1 (Baf A1), pepstatina A e outros produtos químicos comuns foram todos adquiridos a partir de Sigma-Aldrich. Os anticorpos primários utilizados no estudo são os seguintes: anti-poli (ADP-ribose) polimerase (PARP), anti-caspase-3 e desidrogenase anti-gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) de sinalização celular, anti-β-actina e anti-microtúbulo associado à proteína 1 de cadeia leve de 3 (LC3) a partir de Sigma-Aldrich, anti-p62 de Abnova, anti-Atg5, anti-catepsina D e proteína de membrana anti-associado com lisossoma (LAMP-1) a partir de Santa Cruz. A, a IgG de cabra anti-coelho e anti-cabra de coelho IgG de anticorpos secundários, peroxidase de rábano conjugada com IgG de cabra anti-ratinho, foram todos de Thermo Scientific.

(A) alterações morfológicas das células tratadas com EGCG no soro médio -livre foram analisados ​​usando microscopia de luz. imagens representativas de células HepG2 tratadas com EGCG em concentrações indicados por 12 h (painel superior) ou com 60 fiM EGCG para os cursos indicados tempo (painel inferior) são mostrados (barra de escala: 50 mm). (B) As células HepG2 foram tratadas com EGCG (60 ou 240 uM) durante 12 h. As células foram depois fixadas e coradas por hematoxilina, em seguida analisadas por microscopia de luz (barra de escala: 30 mm). (C) O conteúdo vacúolo não são gotículas lipídicas. As células HepG2 foram EGCG (60 uM) durante 12 h. As células cultivadas em meio completo durante 12 h foram usadas como um controlo negativo, e as células tratadas com ácido oleato de 1 mM (OA) em meio DMEM contendo 1% de BSA durante 12 h foram usadas como controlo positivo. As células foram fixadas e coradas com 0,5% de Oil Red O e hematoxilina (barra de escala: 30 mm). (D) Os vacúolos são de origem lisossoma. imunofluorescência de LAMP-1 foi realizada em células MEF após o tratamento com ou sem EGCG (60 mM) durante 9 horas (barra de escala: 10 mm).

Cultura de Células e tratamentos

linha de células heptoma humano HepG2 foi a partir da American Type Culture Collection. Fibroblastos de rato embrionárias (MEF), ambos do tipo selvagem (WT) e as células m5-7 com deleção inducible de Atg5 foram fornecidos pelo Dr. N. Mizushima (Tokyo Medical and Dental University) [24]. Ambos foram cultivadas em DMEM (Sigma-Aldrich), contendo 10% de soro fetal de bovino (Hyclone) e 1% de penicilina-estreptomicina (Invitrogen), em um de 5% de CO

2 atmosfera a 37 ° C.

viabilidade celular Ensaios

neste estudo, a viabilidade celular foi quantificada utilizando teste de exclusão PI, como descrito anteriormente com modificações [25]. Para cada amostra, as células foram semeadas numa placa de 96 cavidades, com 5 x 10

3 por poço. No dia seguinte, as células foram primeiro tratados como descrito nos resultados e nas legendas das figuras, seguido por incubação com 10 ug /ml Hoechst33342 e 5 ug /ml de PI durante 15 min à temperatura ambiente. Hoechst pode manchar todas as células em azul, enquanto que as células mortas foram mostrado por coloração nuclear PI no vermelho. Para cada amostra, a cerca de 500 células foram visualizados, aleatório capturado e contadas para a viabilidade celular com base na relação de PI-positivas às células negativas utilizando um microscópio de fluorescência invertido (Nikon ECLIPSE TE2000-S).

(A) EGCG aumenta o nível de proteína p62 LC3-II e. HepG2 e células MEF foram tratados com EGCG (60 uM) por períodos indicados em meio completo ou em meio isento de soro como indicado. Os lisados ​​celulares foram recolhidos por western blot. (B) EGCG aumenta a formação de pontos lacrimais GFP-LC3. MEF com uma expressão estável de GFP-LC3 (m5-7 células) foram tratadas com ou sem 60 uM de EGCG por 9 h em meio isento de soro e analisadas por microscopia confocal (barra de escala: 20 mm). (C) EGCG não promove fluxo autohpagic. As células HepG2 foram tratadas em meio isento de soro com 60