Abstract

Usando o ensaio de triagem baseada em células, identificamos um agente anti-tubulina novel (Z) -5- ((5- (4-bromo-3-clorofenil) furan-2-il) metileno) -2-tioxotiazolidin-4-ona (BCFMT) que inibiu a proliferação de carcinoma cervical humano (HeLa) (IC

50, 7,2 ± 1,8 uM), adenocarcinoma da mama humano (MCF-7) (IC

50, 10,0 ± 0,5 uM), adenocarcinoma da mama altamente metastático (MDA-MB-231) (IC

50, 6,0 ± 1 | iM), resistente a cisplatina de carcinoma do ovário humano (A2780-cis) (IC

50, 5,8 ± 0,3 uM) e multi-droga rato resistente do tumor mamário (EMT6 /AR1) (IC

50, 6,5 ± 1 uM) de células. Utilizando várias estratégias de cortesia, BCFMT foi encontrado para inibir a proliferação de células de cancro na fase G2 /M do ciclo celular, aparentemente por segmentação microtúbulos. Além disso, BCFMT suprimiu fortemente a dinâmica dos microtúbulos em células vivas individuais MCF-7. Na sua concentração inibitória de proliferação máxima de metade (10 uM), BCFMT reduziu as taxas de crescimento e encurtamento fases de microtúbulos em células MCF-7 em 37 e 40%, respectivamente. Além disso, aumentou os microtúbulos tempo gasto na pausa (não crescer nem encurtar detectável) estado 135% e reduziu a dinamicidade (troca de dímero por unidade de tempo) dos microtúbulos em 70%.

In vitro

, BCFMT obrigado a tubulina com uma constante de dissociação de 8,3 ± 1,8 mM, inibiu a montagem de tubulina e suprimiu a atividade GTPase de microtúbulos. BCFMT inibiu competitivamente a ligação de BODIPY FL-vinblastina à tubulina com uma concentração inibitória (K

i) de 5,2 ± 1,5 uM sugerindo que se liga a tubulina no local da vinblastina. Em células cultivadas, BCFMT-tratamento despolimerizado microtúbulos interfase, perturbado a organização do fuso e proteínas do checkpoint acumulados (BubR1 e Mad2) aos cinetócoros. células tratadas com BCFMT MCF-7 demonstraram melhorada acumulação nuclear de p53 e p21 a jusante, o que consequentemente activado apoptose nestas células. Os resultados sugeriram que BCFMT inibe a proliferação de vários tipos de células cancerosas, incluindo células de resistência a drogas através da supressão dinâmica dos microtúbulos e indicou que o composto pode ter um potencial quimioterapêutico

citação:. Um Rai, Surolia A, D Panda (2012) um BCFMT Inibe antitubulina agente proliferação das células cancerosas e induz a morte celular por inibição de microtúbulos Dynamics. PLoS ONE 7 (8): e44311. doi: 10.1371 /journal.pone.0044311

editor: Miklos S. Kellermayer, Universidade Semmelweis, Hungria

Recebido: 27 Abril de 2012; Aceito: 01 de agosto de 2012; Publicação: 31 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Rai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. D.P. é apoiado por uma bolsa DAE-SRC, do Departamento de Energia Atómica. COMO. é apoiado por uma bolsa J. C. Bose, Governo da Índia. A.R. é um CSIR (Conselho de Desenvolvimento Científico Investigação Industrial) companheiro. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Co-autor Avadhesha Surolia é membro do Conselho Editorial PLoS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O desenvolvimento de resistência aos medicamentos anticancerígenos existentes e metástases tumorais estão entre os principais obstáculos na quimioterapia do cancro [1], [2]. ensaios de citotoxicidade baseado em células têm sido encontrado para ser um método de rastreio atraente para descobrir agentes anticancerígenos. Muitos dos agentes anti-cancro clinicamente eficazes foram inicialmente identificados através de rastreio de elevado rendimento [3] – [6]. Por exemplo, o taxol foi descoberto pela primeira vez por meio de um ensaio de rastreio baseado em células de elevado rendimento [6].

Os microtúbulos são componentes estruturais do fuso mitótico e os microtúbulos dinâmicos desempenham um papel importante em diversos processos celulares incluindo o tráfico intracelular, célula migração e divisão celular [7]. Muitos dos inibidores de mitose são conhecidos por inibir a montagem de microtúbulos [8] – [12] e a inibição da dinâmica de montagem de microtúbulos tenha sido mostrado para ser o modo de acção de várias drogas anti-cancro clinicamente bem sucedidos, incluindo vinblastina, vincristina, estramustina e paclitaxel [11 ], [12]. Para além das suas aplicações clínicas em diversos tipos de doenças, incluindo o cancro, doenças fúngicas e parasitárias [13], inibidores de microtúbulos são também altamente útil para a compreensão do papel dos microtúbulos nos processos celulares [14], [15]. inibidores de microtúbulos geralmente bloqueiam a progressão do ciclo celular na mitose e uma prolongada mitótico-prisão desencadeia várias vias apoptóticas [12], [16], [17].

Rodanina compostos derivados estão adquirindo atenção na quimioterapia por causa da presença de anel heterocíclico (2-tioxotiazolidin-4-ona) nos andaimes principal [18]. Substituições no anel heterocíclico são uma excelente oportunidade para formular novos derivados com ampla gama de atividades biológicas [18]. As actividades biológicas dos compostos de rodanina derivados foram examinadas em vários estudos [18] e estes agentes exibiram antibacteriana [19], [20], anti-malária [21], anti-viral [22] e anticancerígena potencial [23]. No presente trabalho, procurou-se encontrar uma nova entidade química tendo actividades antiproliferativa e antimitóticos de um grande subconjunto (uma biblioteca de 156 compostos) de andaimes derivados rodanina com uma idéia que o composto pode ter potencial anticancerígeno.

Verificou-se que três compostos, nomeadamente (E) -5 – ((5- (2-metil-5-nitrofenil) furano-2-il) metileno) -2-tioxotiazolidin-4-ona (MNFMT), (E) -5 – (3,5-dicloro-4-hidroxibenzilideno) -3-fenil-2-tioxotiazolidin-4-ona (DHBPT) e (Z) -5 – ((5- (4-bromo-3-clorofenil) furano-2 -il) metileno) -2-tioxotiazolidin-4-ona (BCFMT) inibiu a proliferação de células HeLa e MCF-7 em cultura. Entre estes compostos, BCFMT foi encontrado para aumentar a população de células mitóticas de células HeLa e MCF-7 mais potente do que os outros dois compostos. BCFMT inibiu a agregação da tubulina purificada

in vitro Comprar e em cultura de células, enquanto MNFMT e DHBPT não mostraram qualquer efeito significativo sobre a montagem de tubulina. Foram obtidas várias linhas de evidência sugerindo que BCFMT exerce as suas actividades antiproliferativas e anti-mitóticos por amortecimento de instabilidade dinâmica dos microtúbulos individuais em células cultivadas por meio da ligação no local da vinblastina em tubulina. Além disso, BCFMT potentemente inibida a proliferação de droga carcinoma do ovário A2780-cis humano ou seja resistente à cisplatina e de tumor mamário de rato resistente a múltiplas drogas de células EMT6 /AR1 resistentes e células-231 MDA-MB altamente metastáticas que sugerem que pode ter potencial quimioterapêutico.

Materiais e Métodos

Materiais

Sulforodamina B, albumina de soro bovino, de IgG de ratinho anti-α-tubulina, de IgG de ratinho anti-β-actina, conjugado com FITC anti-coelho IgG foram obtidos a partir de Sigma, St. Louis, MO, EUA. Alexa Fluor de IgG anti-rato de cabra 568 foi adquirido a partir de Molecular Probes, Invitrogen, CA, EUA. De ratinho anti-ciclina B1, IgG de coelho anti-p53, anti-P-Histona H3 (Ser 10), rato, os anticorpos IgG anti-p21 de ratinho e o kit de detecção de apoptose (anexina V-iodeto de propídio) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA. De ratinho anti-IgG BubR1 foi obtido a partir de BD Biosciences, CA, EUA. IgG anti-coelho Mad2 foi adquirido a partir de laboratórios Bethyl, Montgomery, EUA. De ratinho anti-IgG Hec1 foi comprado de Abcam, Cambridge, MA, EUA. de soro de bovino fetal foi obtido a partir de Biowest, Nuaille, França. Todos os outros reagentes foram de grau analítico e obtidos a partir de Sigma, MO, EUA e Himedia, Mumbai, na Índia. Todos os compostos testados foram obtidos a partir de Chembridge Corporation, San Diego, CA, EUA.

Cultura celular

Humano carcinoma cervical (HeLa), adenocarcinoma da mama humano (MCF-7) e adenocarcinoma de mama metastático ( ), as células MDA-MB-231 foram obtidas a partir do repositório de células do Centro Nacional para Cell Science, (NCCS) Pune, índia. NCCS caracteriza as células por sequência mt-rDNA para confirmar a espécie. Estas linhas celulares foram encontrados para ser livre de micoplasma. (A2780-cis) células de carcinoma do ovário humano resistente a cisplatina e de tumor mamário de rato resistente a múltiplas drogas de células (EMT6 /AR1) foram adquiridos da Sigma, St. Louis, MO, EUA. autenticação linha celular foi feito por curto de repetição em tandem de perfis e análise de isoenzimas pelo fornecedor e foi também relatada negativo para a presença de micoplasma.

células

HeLa e MCF-7 foram cultivadas em Meio Mínimo Essencial de Eagle (MEM). As células MDA-MB-231 foram cultivadas em de Leibovitz meio L-15. células A2780-cis foram mantidas em meio RPMI-1640 contendo 1 uM cisplatina. células EMT6 /AR1 foram crescidas em meio MEM contendo 1 ug /ml de doxorubicina. Os meios foram suplementados com 10% de soro fetal bovino, 2,2 g /L de bicarbonato de sódio e solução de antibiótico-antimicótico a 1% contendo estreptomicina, anfotericina B e penicilina. As células foram cultivadas e mantidas a 37 ° C na incubadora de atmosfera húmida de 5% de CO

2 e 95% de ar.

rastreio da actividade antiproliferativa dos Rodanina série de compostos

O potencial antiproliferativo de 156 compostos de rodanina derivado contra células HeLa foi determinada por ensaio de sulfo-rodamina B [24], [25]. células HeLa (1 × 10

5 células /ml) foram semeadas em placas de cultura celular de 96 poços. Os stocks de compostos foram preparadas em DMSO. Após 24 horas de sementeira, o meio foi substituído com meio fresco contendo quer veículo (0,1% DMSO) ou 2 fiM de cada um dos compostos de rodanina. Após 24 h de incubação com diferentes compostos, as células foram fixadas com TCA a 10% e processados ​​para ensaio de sulfo-rodamina B [24], [25].

Para determinar a concentração inibitória máxima metade (IC

50) de MNFMT, DHBPT e BCFMT, 1 × 10

5 células /ml de células HeLa e MCF-7 foram semeadas em 96 placas de cultura de células bem. Diferentes concentrações dos compostos foram diluídas em meios e adicionados nos poços, após 24 h de sementeira de células. células HeLa e MCF-7 foram cultivadas na ausência e na presença de compostos durante 24 h e 48 h, respectivamente. A inibição da proliferação celular na presença dos compostos foi determinada utilizando o ensaio de sulforrodamina B padrão. Os dados foram uma média de três experimentos independentes.

Light Scattering Experiment

Os efeitos da MNFMT, DHBPT ou BCFMT sobre a agregação da tubulina purificada foram monitoradas por espalhamento de luz a 400 nm. Tubulina foi purificada como descrito anteriormente [26], [27]. Tubulina (10 uM) em tampão PEM (25 mM de PIPES, pH 6,8, MgCl 3 mM de

2, EGTA 1 mM) e 1 M de glutamato foi incubado sem e com diferentes concentrações de MNFMT, DHBPT ou BCFMT em gelo durante 10 min. Em seguida, GTP 1 mM foi adicionado às misturas de reacção e a cinética de montagem foi monitorizada a 37 ° C utilizando um espectrofluorómetro FP-6500 JASCO, Tóquio, Japão.

Microscopia Electrónica

tubulina (10 ^ M) foi polimerizada com ou sem BCFMT 25 e 50 uM, a 37 ° C durante 15 min como descrito acima. As amostras foram fixadas com glutaraldeído 0,5%, transferidos para grades revestidas de carbono-formvar (Electron Microscopy Sciences, EUA) e coradas negativamente com 2% de acetato de uranilo. As amostras foram visualizados sob microscópio eletrônico (Tecnai G

212, FEI, Eindhoven, Holanda).

Efeitos de BCFMT sobre a atividade GTPase dos microtúbulos in vitro

Tubulin (25? M) em 4 M de glicerol, 5 mM MgCl

2 e 1 mM de GTP foi polimerizada a 37 ° C durante 30 min. Microtúbulos sementes foram geradas por cisalhamento dos polímeros por meio de uma agulha de calibre 23 numa seringa de 5 ml. Tubulina (15 uM) em tampão PEM e GTP 1 mM foi polimerizada por adição de 20% (v /v) de sementes de microtúbulos a 37 ° C durante 10 min. Após 10 minutos de polimerização, diferentes concentrações de BCFMT foram adicionados para as misturas de reacção e além disso é polimerizada durante 30 min. A reacção de hidrólise foi terminada através da adição de 10% (v /v) de ácido perclórico a 7 M e a quantidade de fosfato inorgânico libertado foi determinado por ensaio de verde de malaquite [28].

Medição da constante de dissociação da ligação de BCFMT à tubulina Usando triptofano fluorescência da tubulina

tubulina (2 uM) em tampão PIPES 25 mM pH 6,8 foi incubado sem e com diferentes concentrações de BCFMT a 25 ° C durante 20 min. A intensidade de fluorescência foi monitorizada através da excitação a mistura de reacção a 295 nm e o espectro de emissão foi registada na gama de 310 nm a 370 nm. Uma célula de fluorescência de comprimento de percurso 0,3 centímetros foi utilizado e as intensidades de fluorescência foram corrigidos para o efeito de filtro interno utilizando a fórmula

Os dados de fluorescência foram montados na seguinte equação, onde, Af é a alteração na intensidade de fluorescência de tubulina na presença de BCFMT, Af

max é a alteração máxima na intensidade de fluorescência de tubulina quando está saturada com BCFMT e C é a concentração de BCFMT. A constante de dissociação (K

d) para a ligação à tubulina BCFMT foi estimada utilizando o Graph Pad Prism 5 software (Graph Pad Software, CA, EUA).

Efeito da BCFMT em BODIPY FL-vinblastina A ligação às tubulina

tubulina (2 uM) em tampão PIPES 25 mM pH 6,8 foi incubado sem e com 10, 25 e 50 BCFMT uM durante 20 min a 25 ° C. BODIPY FL-vinblastina (2 uM) foi adicionado nas misturas de reacção e incubado a 25 ° C durante um adicional de 20 minutos no escuro. Tubulina-BODIPY FL-complexo vinblastina foi excitado a 490 nm e o espectro de emissão foi feita na gama de 500-550 nm [29]. O espectro de BODIPY FL-vinblastina na ausência de tubulina foi também monitorizada.

Microscopia de imunofluorescência

células MCF-7 ou HeLa foram semeadas a uma densidade de 5 x 10

4 células /ml na lamela de vidro revestidas com polilisina, em 24 poços da placa de cultura de células. Após 24 horas de sementeira, diferentes concentrações de BCFMT foram adicionados nas cavidades. As células de controlo foram tratadas com veículo (0,1% DMSO). Após 24 ou 48 h de incubação com BCFMT, a imunocoloração foi realizada usando anticorpo contra α-tubulina, p53, p21, BubR1, ciclina B1, β-actina (1 ° 1:300, 2 ° 1:300 Alexa-568 marcado), phosphohistone-H3 (Ser 10) (1 ° 1:300, 2 ° 1:300 marcado com FITC), Hec 1 (1 ° 1:800, 2 ° 1:800 Alexa-568 marcado) e Mad2 (1 ° 1:500 , 2 ° 1:500 marcado com FITC), como descrito anteriormente [29] – [32]. O ADN foi corado com Hoechst 33258 (1 ug /ml). As imagens foram feitas usando Eclipse TE 2000U microscópio (Nikon, Tokyo, Japão) a 40 × ampliação e processados ​​usando o Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

Medidas de microtúbulos Dynamics em MCF- 7 células

a transfecção de tubulina EGFP-α constroem em células MCF-7 foi feito utilizando Lipofectamine-2000 [29]. Os parâmetros cinéticos para a instabilidade dinâmica dos microtúbulos foram determinados como descrito anteriormente [8], [31] – [34].

Western Blot Analysis

células MCF-7 foram incubadas na ausência e na presença de 20 e 40 uM de BCFMT durante 36 h. O efeito sobre a quantidade de polimerizado microtúbulos nas células foi determinada por transferência de Western utilizando anticorpo monoclonal para α-tubulina como descrito anteriormente [31]. Intensidade das bandas de proteínas foi calculada usando a versão do software Image J. 1.43u.

Efeitos de BCFMT na cinética da libertação de induzida Nocodazole mitótico Bloco em células MCF-7

MCF-7 As células foram bloqueadas em fase M do ciclo celular após 24 horas de tratamento com nocodazol 1 uM. Para remover nocodazol, as células foram lavadas cuidadosamente e cytospinned três vezes com meio fresco. Após a remoção de nocodazole, as células foram incubadas na ausência e na presença de 40 uM BCFMT a 37 ° C. As células foram fixadas em 0, 1, 2 e 4 h de incubação com BCFMT a 37 ° C incubadora. As células fixadas foram coradas com Hoechst 33258 e as células mitóticas foram marcados (n = 3; em cada conjunto de 1000 células foram contadas).

/PI coloração

células MCF-7 anexina V (5 × 10

4 células /ml) foram semeadas em lamelas de vidro revestidas com polilisina em uma placa de cultura celular de 24 poços. Após 24 horas de sementeira, as células foram incubadas sem e com diferentes concentrações de BCFMT durante 48 horas. As células foram recolhidas por cytospinning a 2400 rpm a 30 ° C durante 10 min. coloração de anexina V /PI foi realizada como descrito anteriormente [30].

Resultados

Efeitos de derivados de rodanina sobre a proliferação de células HeLa e células MCF-7

Foram examinados os potencial antiproliferativo de 156 compostos de rodanina, utilizando células HeLa. Entre os compostos 156, três compostos, nomeadamente MNFMT, DHBPT e BCFMT (Fig. 1A), foram encontrados para inibir a proliferação de células HeLa 30% em 2 uM. MNFMT, DHBPT e BCFMT foram selecionados para estudos posteriores. MNFMT, DHBPT e BCFMT inibiu a proliferação de células HeLa (Fig. 1B) e MCF-7 (Fig. 1C) com uma metade da concentração inibidora máxima (IC

50) de 16,8 ± 1, 7,3 ± 0,4, 7,2 ± 1,8 ? M, e 12,2 ± 0,3, 4,9 ± 0,3 e 10,0 ± 0,5 mM, respectivamente.

(A) Estruturas de MNFMT, DHBPT e BCFMT. (B C) MNFMT, DHBPT e BCFMT inibiu a proliferação de células HeLa (B) e células MCF-7 (C) em cultura. células HeLa e MCF-7 foram incubadas com diferentes concentrações de MNFMT (▪), DHBPT (•) e BCFMT (▴) para um ciclo celular. A inibição da proliferação celular foi determinada por ensaio de sulfo-rodamina B. Os dados foram uma média de três experimentos independentes. As barras representam SD ±.

Efeitos de MNFMT, DHBPT e BCFMT sobre a progressão do ciclo celular MCF-7

Para determinar o potencial antimitotic, verificamos o efeito desses agentes na ciclina B1 o qual é um marcador específico da fase G2 /M [35]. BCFMT bloqueou a progressão de células MCF-7 na fase G2 /M mais fortemente do que os outros dois compostos (Tabela 1). Por exemplo, em células de controlo, 3,2 ± 0,5% das células foram positivas para a coloração de ciclina B1 Considerando que 11 ± 1,5%, 9 ± 2.5% e 29 ± 3% de células foram consideradas ciclina B1 positivo na presença de 4 × IC

50 concentração de MNFMT, DHBPT e BCFMT, respectivamente (Tabela 1). Na presença de 200 nM e 400 nocodazol, 21 ± 2% e 44 ± 2% das células foram encontrados para ser ciclina B1 positivo. Examinámos também o efeito destes compostos sobre o índice mitótico (número de células em mitose /número total de células) de células MCF-7. Em controlo, o índice mitótico foi encontrado para ser de 3 ± 0,5 ao passo que a ~ 4 × IC

concentração 50 de MNFMT (50 uM), DHBPT (20 uM) e BCFMT (40 uM), os índices mitóticos foram consideradas quatro ± 0,5, 6 ± 1 e 12 ± 1 (n = 3, em cada conjunto de 1000 células foram contadas), respectivamente. Os resultados em conjunto sugeriram que BCFMT bloqueado as células em mitose mais fortemente do que os outros dois agentes; portanto, nós exploramos ainda mais a atividade antimitotic de BCFMT.

BCFMT aumentou o índice mitótico de MCF-7 e células HeLa

Em células mitóticas histona H3 fica fosforilada na serina 10 [36 ] e é utilizado como um marcador para as células mitóticas. tratamento BCFMT aumentou o número de células positivas phosphohistone-H3 (Figura S1 na informação de apoio). Por exemplo, 2 ± 0,5%, 7 ± 1%, e 11,5 ± 1,5% de células foram consideradas phosphohistone-H3 positivo, na ausência e presença de BCFMT 20 e 40 uM, respectivamente. Além disso, BCFMT-tratamento aumentou a razão /anafase da metafase em células MCF-7. Nas células tratadas com o veículo MCF-7, a relação de metafase /anafase foi determinado como sendo 2,7 ± 1,2, enquanto que na presença de 20, 30 e 40 BCFMT uM, os rácios de metafase /anafase foram determinadas como sendo 5 ± 1, 10 ± 2 (p 0,001) e 15 ± 1 (p 0,001) (n = 3, em cada conjunto de 1000 células foram contadas), respectivamente. O aumento da relação do índice mitótico e metafase /anafase sugeriu que BCFMT inibiu a progressão do ciclo celular de células MCF-7, na mitose. BCFMT também encontraram para suprimir a progressão mitótica de células HeLa, conforme determinado pelo índice mitótico, phosphohistone-H3 coloração e taxa de metáfase /anaphase (Figura S2 nas Informações Coadjuvante).

Além disso, o tratamento BCFMT foi encontrado para atrasar a cinética da libertação do bloqueio mitótico nocodazole- induzida em células MCF-7. Por exemplo, foram encontrados 60% das células para a mitose no momento da lavagem nocodazol, enquanto que 30%, 15% e 5% de células estavam na fase mitótica após 1, 2 e 4 horas de libertação do bloco de nocodazol. Na presença de 40 uM BCFMT, 46%, 38% e 30% das células foram consideradas na fase mitótica após 1, 2 e 4 h de libertação bloco BCFMT sugerindo que pode suprimir a progressão mitótica.

BCFMT inibido in vitro de polimerização da tubulina

Desde BCFMT inibiu a progressão do ciclo celular na fase M do ciclo celular; examinamos se BCFMT poderia perturbar a montagem de microtúbulos

in vitro Comprar e em células cultivadas. BCFMT inibiu a agregação da tubulina purificada de um modo dependente da concentração (Fig. 2A). Por exemplo, na presença de 25, 50 e 100 uM BCFMT, o grau de polimerização da tubulina foi inibida em 27 ± 3%, 38 ± 4.5% e 64 ± 3%, respectivamente. A velocidade inicial de aumento da intensidade da dispersão da luz do conjunto de microtúbulos reacção foi determinada como sendo de 0,97 ± 0,03, 0,54 ± 0,07 e 0,28 ± 0,06 (UA /seg) na ausência e na presença de 50 uM e 100 BCFMT, respectivamente, indicando que BCFMT reduziu fortemente a taxa inicial de montagem de tubulina. Eletromicrografias do controle mostrou polímeros microtúbulos típicos (Fig. 2B). Na presença de BCFMT 25 uM, menos microtúbulos foram encontrados por campo de observação do que o controlo. É também induziu a agregação de dímeros de tubulina. Na presença de 50 uM BCFMT, a formação de microtúbulos era fortemente inibida e apenas agregados de tubulina foram encontrados (Fig. 2B). Em condições semelhantes, DHBPT e MNFMT não teve efeito significativo sobre a montagem de microtúbulos. Por exemplo, 50 uM DHBPT não teve nenhum efeito detectável sobre o espalhamento de luz de montagem de microtúbulos e 50 uM MNFMT diminuiu o sinal de dispersão de luz do conjunto de microtúbulos apenas por 10%.

(A) tubulina (10 uM) foi polimerizada na ausência (▪) e na presença de 10 (◊), 25 (▴), 50 (x), 75 (○) e 100 (□) BCFMT uM. (B) Eletromicrografias de polímeros de tubulina na ausência e na presença de BCFMT 25 e 50 uM. A barra de escala é de 2000 nm. (C) BCFMT suprimiu a actividade de GTPase de microtúbulos. Efeitos de vinblastina na actividade de GTPase de microtúbulos em condições experimentais semelhantes estão apresentados na inserção. Os dados foram uma média de três experimentos independentes. As barras representam SD ±.

Além disso, determinou-se o efeito de BCFMT sobre a atividade GTPase de microtúbulos. BCFMT diminuiu a liberação de fosfato inorgânico de um modo dependente da concentração. Por exemplo, 20, 30 e 50 uM BCFMT reduzida a quantidade de fosfato inorgânico libertado por 17%, 25% e 32%, respectivamente (Fig. 2C). Em condições experimentais semelhantes, 1, 2, 4 e 10 uM vinblastina reduzida a quantidade de fosfato inorgânico libertado por 12%, 20%, 25% e 35%, respectivamente, indicando que BCFMT inibe a actividade de GTPase de microtúbulos tais como vinblastina (Fig. 2C inset).

Caracterização da ligação da tubulina para BCFMT

a fluorescência intrínseca do triptofano da tubulina tem sido amplamente utilizada para determinar a constante de ligação de um ligando-se à tubulina [37]. BCFMT reduziu a intensidade da fluorescência intrínseca do triptofano da tubulina de um modo dependente da concentração (Fig. 3A). Por exemplo, na presença de 10 uM BCFMT triptofano fluorescência da tubulina foi reduzido em 21 ± 2,5%. Montagem das alterações de fluorescência em uma isotérmica de ligação rendeu K

d de 8,3 ± 1,8 mM (Fig. 3b).

(A) são mostrados os efeitos da BCFMT nos espectros de fluorescência de triptofano da tubulina. Os espectros foram monitorizados na ausência (♦) e na presença de 0,25 (▪), 0,5 (▴), 1 (x), 2 (-), 5 (○), 7 (l) e 10 (•) BCFMT uM. (B) A alteração na intensidade de fluorescência de tubulina (Af) foi representada graficamente contra a concentração de BCFMT. A constante de dissociação (K

d) para a ligação a tubulina BCFMT foi estimada usando uma equação descrito nos métodos. Os dados foram a média de quatro experiências independentes. (C) redução da intensidade de fluorescência de tubulin- complexo FL-vinblastina BODIPY na ausência (♦) e na presença de 10 (▪), 25 (▴) e 50 (•) BCFMT uM. (D) A tubulina (2 uM) em tampão PIPES 25 mM (pH 6,8) foi incubado sem e com diferentes concentrações (5, 10, 15, 20, 25 uM) de BCFMT a 25 ° C durante 20 min. Prepararam-se três desses conjuntos diferentes. Após 20 min de incubação, em um conjunto de 2 um (♦), no segundo set 4 mm (▴) e no terceiro set 6 mM foi adicionado (▪) BODIPY FL-vinblastina. Fluorescência de tubulina BODIPY-FL-complexo vinblastina foi medida e foi calculada a concentração inibidora (Ki) a partir do gráfico de Dixon modificado.

Inibidores de montagem da tubulina em geral, quer se ligam ao vinblastina ou os sítios de ligação da colchicina em tubulina [11], [12]. Por isso, nós examinamos se BCFMT se liga a tubulina no local da colchicina tubulina usando colchicina-fluorescência [38]. BCFMT (10 e 20 ^ M) não inibiu o desenvolvimento da fluorescência da colchicina tubulina, indicando que não inibem a ligação da colchicina à tubulina (Figura S3 na informação Apoiando). BODIPY FL-vinblastina foi utilizado para sondar o local de ligação de vinblastina em tubulina [29]. A intensidade de fluorescência de BODIPY FL-vinblastina aumentada após ligação a tubulina (Fig. 3C). Vinblastina diminuiu o aumento de fluorescência de BODIPY FL-vinblastina sugerindo que se liga ao sítio de vinblastina em tubulina. BCFMT também diminuiu a fluorescência do complexo BODIPY-FL-vinblastina tubulina de um modo dependente da concentração, indicando que BCFMT inibiu a ligação de BODIPY FL-tubulina para vinblastina (Fig. 3C). Por exemplo, 10, 25 e 50 uM BCFMT diminuição da fluorescência do complexo tubulina FL-vinblastina-BODIPY por 40 ± 2,5%, 51 ± 3% e 64 ± 4%, respectivamente.

Além disso, BODIPY FL- vinblastina mostrou um aumento significativo do valor de polarização de fluorescência quando foi obrigado a tubulina (Figura S4 na informação de apoio). Inclusão de BCFMT no meio reaccional diminui a polarização de BODIPY FL-vinblastina indicando que reduziu a ligação de BODIPY FL-vinblastina à tubulina. Em comparação com o controlo, 20 ± 3%, 31 ± 4% e 49 redução ± 2% dos valores de polarização de fluorescência de tubulina-BODIPY FL-vinblastina foram observadas na presença de 10, 25 e 50 uM de BCFMT, respectivamente.

Desde BCFMT inibiu a ligação BODIPY FL-tubulina para vinblastina, examinou-se o modo de inibição utilizando modificadas [39]. Uma análise do gráfico de Dixon modificado sugeriu que BCFMT inibiu a ligação de BODIPY FL-vinblastina à tubulina competitivamente com uma concentração de inibição (K

i) de 5,2 ± 1,5 uM (Fig. 3D).

A breve exposição das BCFMT despolimerizado microtúbulos em células MCF-7

para examinar o efeito de BCFMT em microtúbulos celulares, células MCF-7 foram incubadas com e sem BCFMT 40 uM, durante 3 h. As células tratadas com o veículo típico apresentado rede de microtúbulos, enquanto as células BCFMT (40 uM) tratado mostrou uma significativa despolimerização dos microtúbulos (Fig. 4a). polímeros de microtúbulos não eram visíveis em 40 uM células tratadas com BCFMT; Observou-se uma coloração difusa de tubulina solúvel nas células MCF-7 tratadas.

(A) células foram tratadas com e sem BCFMT 40 uM, durante 3 h e microtúbulos foram coradas utilizando anticorpos contra α-tubulina (vermelho) . (B) BCFMT perturbado interfase organização de microtúbulos de células MCF-7. As células MCF-7 foram incubadas na ausência e na presença de diferentes concentrações de BCFMT durante 48 h. As células foram fixadas e coradas utilizando anticorpos contra α-tubulina (vermelho). (C) BCFMT diminuiu a proporção de tubulina polimérico /solúvel em células MCF-7 de células determinado por western blot. As células MCF-7 foram tratadas sem (pista 1) ou com 20 ^ M (pista 4) e 40 ^ M (pista 5) de BCFMT durante 36 h. 20 nM de taxol (pista 2) e 200 nM de nocodazole (pista 3), também foram utilizados sob condições experimentais similares. fracções de tubulina e poliméricos solúveis foram isolados e quantidades iguais de proteínas foram carregados em SDS-PAGE. A imunotransferência foi realizada com anticorpo α-tubulina. O experimento foi realizado três vezes, independentemente. É mostrado o blot representativo. (D) BCFMT despolimerizado microtúbulos do fuso em células MCF-7. DNA com detalhes em azul. barra de escala é de 10 mm.

BCFMT despolimerizado microtúbulos de células MCF-7 e HeLa Cells

células MCF-7 ou HeLa foram incubadas com diferentes concentrações de BCFMT para um ciclo celular. BCFMT despolimerizado interfase microtúbulos em células MCF-7 de uma maneira dependente da concentração. Por exemplo, a rede de microtúbulos não estava visivelmente perturbada na presença de BCFMT 10 uM e 20 uM BCFMT induziu uma despolimerização significativa dos microtúbulos interfase e uma forte despolimerização dos microtúbulos foi observada na presença de 30 uM BCFMT (Fig. 4B). A análise por Western blot indicou que nas células tratadas com veículo MCF-7, a proporção de polímero de solúvel tubulina foi de 2,2 ± 0,3 ao passo que era de 1,2 ± 0,1 e 0,8 ± 0,1 na presença de 20 e 40 BCFMT pM, sugerindo respectivamente que o tratamento BCFMT microtúbulos celulares despolimerizado (Fig. 4C). O polímero solúvel à relação tubulina em células MCF-7 foi encontrado ser de 3,1 ± 0,2 na presença de 20 nM de taxol e 1,1 ± 0,1 na presença de 200 nM de nocodazole (Fig. 4C). BCFMT-tratamento despolimerizado microtúbulos fusiformes em células MCF-7 e também induziu a formação de fusos monopolares ou multipolares com cromossomas desalinhados na placa de metafase (Fig. 4D). Similar aos seus efeitos sobre as células MCF-7, BCFMT despolimerizado microtúbulos em células HeLa em sua faixa de concentração inibitória proliferação eficaz (Figura S5 na informação de apoio). No entanto, BCFMT (15 e 30? M) tratamento não perturbar a organização das fibras de actina em células MCF-7 (Figura S6 na informação de apoio).

BCFMT suprimida microtúbulos remontagem em células MCF-7

microtúbulos foram despolimerizado através da incubação de células MCF-7 em gelo durante 1 h e, subsequentemente, a cinética de crescimento de microtúbulos interfase foram monitorizados através da incubação das células a 37 ° C. Os microtúbulos de células tratadas com o veículo cresceu rapidamente e atingiu rede interfase normal dentro de 30 min, enquanto se BCFMT tratamento (40 uM) suprimiu fortemente o crescimento de microtúbulos (Figura S7A na informação Apoiando).

Além disso, o efeito de BCFMT na cinética de montagem do fuso em células mitóticas MCF-7 foi analisado. As células foram bloqueados pela primeira vez em mitose, incubando-as com uma nocodazol uM durante 20 h. As células foram cuidadosamente lavadas com meio fresco e foram ainda incubadas em gelo durante 30 min com e sem 40 jiM BCFMT. Subsequentemente, as células foram colocadas a 37 ° C e a cinética de remontagem dos microtúbulos do fuso foi monitorizada por coloração das microtúbulos em intervalos de tempo diferentes.