Abstract

histona desacetilases (HDACs) são conhecidos por desempenhar um papel central na regulação de várias propriedades celulares interligados com o desenvolvimento e progressão do câncer. Recentemente, HDAC1 tem sido relatada a ser sobre-expresso no carcinoma hepatocelular (HCC), mas as suas funções biológicas em hepatocarcinogenese permanecem por ser elucidados. Neste estudo, foi demonstrado sobre-expressão de HDAC1 num subconjunto de linhas celulares de cancro e HCCS fígado humanos. HDAC1 inactivação resultou na regressão do crescimento de células tumorais e activação de morte celular independente de caspase autophagic, pela via de activação LC3B-II em células Hep3B. Na regulação do ciclo celular, HDAC1 inactivação induzida selectivamente tanto p21

WAF1 /Cip1 e p27

expressões KIP1, e, simultaneamente, suprimiu a expressão de ciclina D1 e CDK2. Por conseguinte, a inactivação HDAC1 levou à hipofosforilação de pRb em transição G1 /S, a actividade de transcrição e /DP1 assim inactivada E2F. Além disso, demonstramos que HDAC1 suprime p21

WAF1 /Cip1 transcricional actividade através de sítios de ligação de Sp1 no p21

promotor WAF1 /Cip1. Além disso, a supressão sustentada de HDAC1 atenuada

in vitro

formação de colónias e

in vivo

o crescimento do tumor em um rato modelo de xenotransplante. Tomados em conjunto, sugerimos a regulação aberrante de HDAC1 no HCC e sua regulação epigenética da transcrição de genes de componentes autofagia e ciclo celular. Superexpressão de HDAC1 pode desempenhar um papel central através da regulação sistêmica de efetores mitóticas no desenvolvimento de HCC, proporcionando um alvo potencial particularmente relevante na terapia do cancro

Citation:. Xie HJ, Noh JH, Kim JK, Jung KH , Eun JW, Bae HJ, et al. (2012) HDAC1 Inactivação Induz mitótico Defeito e Caspase-Independent autofágica morte celular em cancro do fígado. PLoS ONE 7 (4): e34265. doi: 10.1371 /journal.pone.0034265

editor: Andrei L. Gartel, Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de setembro de 2011; Aceite: 24 de fevereiro de 2012; Publicação: 04 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Xie et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Ministério do meio Ambiente coreana através de “o Eco-technopia 21 projeto” e pelo bem-estar público programa de segurança, através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia (2010-0.020.764); e pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) de subvenção, financiado pelo governo da Coreia (MEST) (Grant No. 2011-0010705). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O carcinoma hepatocelular (CHC) é um tumor primário do fígado humano e uma das principais causas de morbilidade e mortalidade. É o sétimo tipo de câncer mais comum em todo o mundo, ea terceira principal causa de mortes relacionadas ao câncer [1]. No mecanismo molecular, hepatocarcinogenese é aceite como um processo de passos múltiplos caracterizada pela acumulação progressiva e interacção de alterações genéticas causando o crescimento aberrante e transformação maligna de células parenquimatosas do fígado, seguida pela invasão vascular e metástase [2]. As assinaturas de mudança global da expressão gênica e vias de sinalização, envolvido no desenvolvimento de HCC, foram investigados por muitos pesquisadores. No entanto, numerosos genes que contribuem para estas alterações não são ainda suficientemente caracterizadas.

histona desacetilases (HDACs) são famílias de enzimas de modificação de histona que regulam a expressão e a actividade de numerosas proteínas envolvidas em ambos iniciação e progressão do cancro, através da remoção os grupos acetilo, e assim permitindo que a estrutura da cromatina compacta [3]. As HDAC compreendem uma família de 18 genes, que estão agrupadas em classes I-IV, com base na homologia para os seus respectivos ortólogos de levedura [4]. HDAC1, como um membro da classe I partilha uma homologia elevada sequência com Rpd3 fermento, é um gene regulador global e co-repressor da transcrição com a atividade da histona deacetilase [5]. expressão aberrante de HDAC1 aparece comum em cancros do sistema gastrointestinal, e está associada com desdiferenciação, proliferação aumentada, invasão, doença avançada e de prognóstico reservado [4]. pacientes com CHC com alta expressão de HDAC1 apresentaram maior incidência de invasão de células cancerosas na veia porta, mais pobre diferenciação histológica, mais avançado do tumor-nódulo-metástase (TNM) estágio e baixa taxa de sobrevivência [6]. Verificou-se ainda que altamente expressão de HDAC1 em células cancerosas está correlacionada com a resistência à quimioterapia e um mau prognóstico em uma série de carcinomas [7],. O silêncio de HDAC1 por pequeno RNA de interferência (siRNA) ou inibidor específico de MS-275 em células cancerosas pode paragem na fase G1 do ciclo celular ou a G2 /de transição M, o que resulta na perda de células mitóticas, a inibição do crescimento celular, e aumentar a percentagem de células apoptóticas [10], [11], [12]. Além disso, HDAC1 knockdown afectada motilidade celular e invasão por regulação da expressão de E-caderina [13], [14], e também foi demonstrado induzir autofagia em células HeLa [15], e senescência celular em células de fibroblastos humanos e células de cancro da próstata [ ,,,0],16]. Embora estas funções moleculares de HDAC1 foram bem documentados em diversos resultados anteriores, o papel de HDAC1 em hepatocarcinogenese não tem sido elucidado.

No presente estudo, a fim de investigar as funções biológicas de HDAC1 que conferem o potencial oncogénico em HCC humana, avaliamos a regulação aberrante de HDAC1 em um subconjunto de fragmentos de CCH humanos e examinou os mecanismos de regulação da HDAC1 na apoptose, autofagia e do ciclo celular de células de carcinoma hepatocelular. Além disso,

in vitro

e

In vivo

potencial tumorigénico experimental de HDAC1 foram explorados utilizando linhas celulares HDAC1 estável knockdown.

Resultados

causas de supressão HDAC1 defeitos mitóticos em células do CHC

Nós relatado anteriormente em grande escala mudanças transcriptomic de lesão pré-neoplásica para HCCs humanos evidentes [17]. A partir de dados de microarray primárias, que condensa a expressão de HDAC1 em um processo histopatológico de multi-passo, de nódulos de baixo grau displásicas (LGDNs) e nódulos displásicas de alto grau (HGDNs) para HCC primário (Edmondson graus 1-3). Como mostrado na Figura 1A, a expressão relevante de HDAC1 foi aumentada gradualmente a partir de não-tumor para o cancro manifesta. Para confirmar a superexpressão de HDAC1 em CHC, foi realizada a análise de imunotransferência de HDAC1 em um subconjunto de HCC humanas. Como mostrado na Figura 1B, HDAC1 pareceu ser altamente sobre-expresso em todos os tecidos seleccionados HCC em comparação com os tecidos não cancerosos correspondentes. Expressão de HDAC1 foi também analisado em dez linhas celulares HCC diferentes (HepG2, Hep3B, PLC /PRF /5, SNU182, SNU354, SNU368, SNU387, SNU423, SNU449 e SNU475) e comparados com três linhas de células de hepatócitos do fígado seletivos imortalizadas normais (THLE -2, THLE-3 e MIHA). Como mostrado na Figura 1C, a expressão endógena de HDAC1 em todas as linhas celulares de carcinoma hepatocelular exibiu relativamente mais elevada do que a de linhas de células de hepatócitos de fígado normais.

(A) mostra a expressão de ARNm de HDAC1 aumento gradual a partir de pré-cancro para os HCC evidentes (* p 0,05). LGDN, nódulos displásicos de baixo grau; HGDN, nódulos displásicos de alto grau; G1-3, Edmondson graus 1-3. (B) Dez pares de tumor (T) e seus tecidos hepáticos correspondentes não-tumoral (N) foram obtidos a partir de ressecções cirúrgicas. O nível de proteína de HDAC1 foi avaliada por análise de transferência de Western. (C) Os níveis endógenos de HDAC1 em dez cancro do fígado e três linhas de células normais. Um anticorpo contra a GAPDH serviu como controlo de carga. (D) Targeted-ruptura de HDAC1 faz com que o retardamento do crescimento de linhas celulares de carcinoma hepatocelular. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT nas linhas celulares indicadas, quer transfectadas com precipitação (Si-SCR) ou siARN HDAC1 (Si-HDAC1). Os dados foram expressos como média ± DP (* p 0,01). Todas as medições foram realizadas em triplicado, e cada experiência foi repetida pelo menos duas vezes.

Em seguida, explicar as consequências biológicas da expressão aberrante de HDAC1 na hepatocarcinogênese, expressão HDAC1 foi revogada pela RNA-interferência mediada gene knock-down em quatro linhas celulares HCC diferentes; As células HepG2, Hep3B, SNU182 e SNU449. Tal como mostrado na Figura 1D, a depleção de HDAC1 resultou na redução significativa do crescimento de células tumorais (HepG2, Hep3B e SNU449). Este efeito anti-crescimento pode ser parcialmente explicada pela interrupção da regulação do crescimento celular, como a interrupção do ciclo celular, a senescência celular ou apoptose. Assim, o próximo explorou os efeitos de supressão HDAC1 na regulação do ciclo celular e apoptose celular.

expressão aberrante de HDAC1 proliferação mediada de células de câncer de fígado através da desregulamentação expressão de proteínas do ciclo celular G1 /S

o facto de que a supressão de HDAC1 causou a regressão do crescimento das células do cancro do fígado HDAC1 implica que está envolvido na regulação da progressão do ciclo celular. Assim, foi realizada a análise do ciclo celular de células coradas com PI em transfectantes HDAC1 siRNA utilizando citometria de fluxo. depleção HDAC1 conduziu a um aumento na fase G1 de 17,0%, com uma diminuição concomitante na fase S e G2 fase /M de 1,1% e 15,9%, respectivamente, em comparação com o controlo (SI-Scr) às 48 h após transfecção (Figura 2A) . O facto de que a supressão de HDAC1 causada paragem do ciclo celular na fase G1 que implica HDAC1 pode modular actividades dos componentes que regulam o ciclo celular. Portanto, foram examinados os efeitos de depleção de HDAC1 sobre as proteínas reguladoras do ciclo celular G1 transição /S. Em G1 transição /S, tem sido bem estabelecido que os reguladores do ciclo celular negativos, tais como p15

INK4B, p16

INK4A, p18

INK4C, p19

INK4D, p21

WAF1 /Cip1 e p27

KIP1, são os moduladores-chave que suprimem a ciclina D1 /CDK4 e 6, ou ciclina e /CDK2 complexos. Quando estes moduladores do ciclo celular foram examinados, depleção HDAC1 causada selectivamente a indução de p21

WAF1 /Cip1 e p27

KIP1 entre os reguladores negativos da transição do ciclo celular em células Hep3B (Figura 2B). Notavelmente HDAC1 inactivação usando HDAC1 siRNA não afetou a expressão endógena de HDAC2, e acumulação também causou de histona H3 acetilada e H4 HDAC1 implicando indução específica do esgotamento de p21

WAF1 /Cip1 e p27

KIP1 em células Hep3B. Além disso, a depleção de HDAC1 também induziu a supressão concomitante de CDK2 e ciclina D1 (Figura 2C). Em geral, o complexo CDK /ciclina activada pode causar a hiperfosforilação de pRb, que perde a sua actividade supressora de tumores, e que permite o aumento da actividade de transcrição E2F /DP1. Assim, o próximo investigaram se a desregulação da CDK e ciclinas por HDAC1 afeta a atividade transcricional E2F /DP1 em células Hep3B. Targeted-ruptura de HDAC1 eliciada hipofosforilação de p130, uma isoforma de pRb (Rb2). Consequentemente, alguns dos genes alvo a jusante do factor de transcrição E2F /DP1, tais como E2F4, CDC2 e ciclina A, foram significativamente regulada para baixo (Figura 2D). Além disso, para validar esses resultados e para confirmar os níveis de transcrição de genes diferencialmente expressos, foi realizada quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) para

HDAC1

,

CDKN1A

(p21

WAF1 /Cip1),

CDKN1B

(p27

KIP1),

genes

CCND1

(ciclina D1) CDK2 Comprar e. Tal como mostrado na Figura 2E, células Hep3B com depleção de HDAC1 exibiu uma expressão muito baixa HDAC1 endógena. Nós também foram capazes de confirmar que ambos

CDKN1A

(p21

WAF1 /Cip1) e

CDKN1B

(p27

KIP1) foram significativamente up-regulada por inactivação HDAC1. Inversamente,

CDK2

e

CCND1

foram apareceu a ser regulada por HDAC1 inativação (Figura 2E). Estes resultados sugerem que a regulação exclusiva de proteínas do ciclo celular, tais como p21

WAF1 /Cip1, p27

KIP1, ciclina D1 e CDK2 pela superexpressão HDAC1 exerce uma estimulação mitogênica muito potente durante a progressão do câncer de fígado.

células Hep3B foram transfectadas com o controlo (nenhum), lipofectamina única (Reag), 100 nmol /L mexidos siRNA (Si-SCR) ou 100 nmol /L de siRNA-HDAC1 específica (Si-HDAC1). (A) A análise de citometria de fluxo foi realizada com iodeto de propídio (PI) a coloração na supressão de HDAC1 em células Hep3B. Foram realizadas duas experiências independentes, com os mesmos resultados. (B) Para determinar a supressão da actividade de HDAC1, expressão de proteínas de acetil-H3 e H4 histona foram determinados por immunoblotting. expressões de proteínas de reguladores negativos do G1 transição do ciclo celular /S também foram avaliadas em células Hep3B depleção de HDAC1. (C) Supressão de CDKs e ciclinas no G1 /S de transição pela depleção HDAC1. (d) efeitos do esgotamento HDAC1 sobre pRb e expressões de genes alvo E2F /DP1. (E) Validação da expressão de ARNm de HDAC1 genes regulados por análise de PCR quantitativo em tempo real. O nível de expressão relativa de cada gene foi normalizado para ARNm de GAPDH na mesma amostra. nível de expressão da proteína foi quantificado por ImageJ e normalizadas para GAPDH. Os valores são dados como vezes de mudança relativa aos tansfectants si-RCS. O nível de proteínas em relação é mostrada na forma de gráficos de barras no lado direito de cada imunotransferência (* p 0,05). Todas as experiências foram repetidas três vezes com os mesmos resultados. Um resultado típico de três experimentos realizados é mostrado.

Vários estudos têm mostrado que os inibidores de HDAC ativar fortemente a expressão de p21

WAF1 /Cip1 através do reforço da acetilação das histonas do p21

WAF1 /promotor cip1 incluindo o sítio de ligação Sp1- soltando o HDAC repressor da sua ligação [18], [19]. Além disso, houve algumas evidências de que a expressão endógena de p21

WAF1 /Cip1 é regulada ao nível da transcrição pelo recrutamento de HDAC1 ao p21

região promotora WAF1 /Cip1 [20], [21]. Nossos resultados atuais sugerem também que a supressão transcricional de p21

WAF1 /Cip1 através HDAC1 vinculativa para sua região promotora é predominante em células de câncer de fígado. Para validar essa implicação, foi realizado ensaio de imunoprecipitação da cromatina com PCR quantitativa (CHIP-qPCR) para p21 indicada

regiões promotoras WAF1 /cip1 que foram analisados ​​em nosso relatório anterior (Figura 3A) [22]. Descobrimos que HDAC1 é altamente associado com a região proximal do p21

promotor WAF1 /Cip1 (região D na Figura 3B). Este resultado foi ainda validado por análise ChIP-qPCR com a mesma região do promotor de p21

WAF1 /Cip1 (região D), e que mostrou que o estado de acetilação da histona H3 e /ou H4 é reforçada no locus genómico pela revogação da HDAC1 (Figura 3C).

(a) Um esquema do p21

promotor WAF1 /Cip1 representando as regiões analisadas por Chip-qPCR (barras pretas, a-D). (B) A associação de HDAC1 na p21

promotor WAF1 /Cip1 foi avaliada pela amplificação de cada região imunoprecipitadas com HDAC1. A quantidade de ADN foi precipitado por anticorpo anti-HDAC1 ou IgG de controlo foi expresso como percentagem do ADN genómico total de entrada. O resultado de quatro experiências independentes foi mostrado como média ± DP. (C) acetilações da histona H3 e H4 associada com a p21 proximal

promotor WAF1 /Cip1 foi aumentada através da inibição da associação de HDAC1. células Hep3B foram transientemente transfectadas com o controlo (SI-SCR) ou siARN HDAC1 (Si-HDAC1) durante 48 h, e submeteu-se a análise ChIP-qPCR utilizando H3 histona-acetil (Ac-anti-H3) ou H4 (anti-Ac- H4) IgG anticorpo ou controle. ADN genómico precipitado foi amplificado para o promotor proximal do p21

WAF1 /Cip1 lócus (região D) por PCR em tempo real. A quantidade de ADN precipitado foi expressa como percentagem do total de DNA genómico de entrada. O resultado de três experiências independentes foi mostrado como média ± DP. (D) HDAC1 regula p21

WAF1 /Cip1 transcrição através de sítios de ligação de Sp1 no p21

promotor WAF /Cip1. As construções indicadas, pWWP, pWPdel-BstXI, pWP101, pWPmt-Sp1-3, pWPmt-Sp1-5,6, pWPdel-Smal e Sp1-Luc foram transientemente transfectados em células Hep3B, com 100 nmol /L mexidos siRNA (Si- SCR) ou 100 nmol /L HDAC1 siRNA específico (Si-HDAC1), respectivamente. A actividade do promotor foi medido, e a indução de dobragem por depleção HDAC1 foi calculada. No lado esquerdo, foi mostrado o esquema de cada construção. Todos os dados são apresentados como a média ± SD (n = 3) (* P 0,05).

Tal como descrito acima, não são enriquecidos sítios Sp1-Vinculadas na região D. Assim, o próximo investigou se HDAC1 suprime p21

expressão WAF1 /Cip1 através de sites de ligação SP1 no p21

WAF1 /Cip1promoter. Para confirmar isto, realizou-se a ensaio de repórter com construções repórter descritos em Materiais e Métodos. Tal como mostrado na Figura 3D, as células Hep3B HDAC1-deficiente (SI-HDAC1) apresentaram um aumento da actividade de luciferase na presença de locais de ligação SP1-, contendo, pelo menos, para Sp1-3 Sp1-6 (pWWP, pWPdel-BstXI e pWP101). No entanto, p21

actividade de transcrição WAF1 /Cip1 não foi induzida por formas mutantes de Sp1-5,6 (pWPmt-Sp1-5,6) em células SI-HDAC1. Curiosamente, p21

WAF1 /Cip1 transcrição ainda foi induzida por dois plasmídeos mutantes (ou seja pWPdel-Smal e Sp1-luc) com duas ou três repetições em tandem do site SP1-ligação perto da caixa ou transcrição local de início da TATA. Este resultado indica que a região proximal ao redor da caixa TATA de p21

promotor WAF1 /Cip1 é esperado para ser um importante p21 site de regulação

WAF1 /Cip1 transcrição por HDAC1 em células Hep3B.

Targeted- inibição de HDAC1 induz a morte celular de células Hep3B autophagic

estudos recentes sugeriram que o tratamento com inibidores da histona-desacetilase induzida não só, mas também a morte celular por apoptose autophagic [23], [24], [25]. Verificou-se também que o knockdown de HDAC1 induz a morte celular em células HeLa autophagic [15]. Assim, exploraram os efeitos de supressão HDAC1 na activação da morte das células em células Hep3B. Como mostrado na Figura 4A, a análise de citometria de fluxo para medir as células coradas com Anexina V não mostraram indução significativa de células apoptóticas em comparação com o controlo (SI-Scr). Além disso, a depleção de HDAC1 não afectou a expressão de componentes pró-apoptóticos, como FIA, Bax e Apaf-1, nem provocar a caspase-3 e PARP de clivagem (Figura 4B). Estes resultados indicam que a superexpressão de HDAC1 não afectam principalmente o sinal apoptótico em HCC.

(A) A análise de citometria de fluxo foi realizada através de anexina V-FITC e PI rotulagem de coloração sobre a supressão de HDAC1. dupla coloração com anexina V-FITC e PI indica que a quantidade de células na fase tardia de apoptose foi ligeiramente aumentada (superior direito) em células Hep3B com depleção de HDAC1. Foram realizadas duas experiências independentes, com os mesmos resultados. (B) Ambos PARP e a clivagem de caspase 3 não foram detectados por inibição HDAC1. Todas as experiências foram repetidas três vezes com os mesmos resultados.

A seguir, para determinar se HDAC1 inactivação provoca a activação da morte de células autophagic, examinámos a estrutura microscópica de células por microscopia electrónica de transmissão (TEM) a HDAC1 células Hep3B -depleted. Como esperado, aproximadamente 40-45% das células HDAC1 siRNA-transfectadas desenvolveram vacúolos autofágicos após 72 h de pós-transfecção (Figura 5A). Em ampliações maiores, a maioria dos vacúolos continha material elétron densa e organelas degradadas. Em contraste, controlar siRNA (si-SCR) células transfectadas foram meramente vacuolizado, e menos células contendo vacúolos no citoplasma foram observados (direita dois painéis na Figura 5A). associada a microtúbulos proteína uma cadeia leve de 3 (LC3) é um marcador para a detecção de autofagia comum. LC3 é modificada após a tradução por remoção do seu C-terminal para produzir LC3-I (~18 kDa), com lipidação fosfatidiletanolamina dando origem a LC3-II (-16 kDa). Enriquecimento de ligada à membrana LC3-II em autofagossomas é um fenómeno característico da morte celular autophagic e a quantidade de LC3-II está bem correlacionado com o número de autofagossomas. Nas nossas experiências, HDAC1 knockdown aumentou significativamente a conversão de LC3B-I em LC3B-II, tanto como ceramida, um indutor potente autophgy, fez em células Hep3B (Figura 5B). Em contraste, o tratamento com 3-metiladenina (3-MA, um inibidor específico da autofagia) impediu a conversão LC3B-I-II LC3B por inactivação HDAC1 em células Hep3B (pista 5 na Figura 5B). Além disso, a coloração de imunofluorescência para LC3B revelou que HDAC1 inactivação manchas em forma de anel induzida distribuído uniformemente por todo o citoplasma, indicando uma associação entre LC3 e membranas autophagosomal, e esta associação foi significativamente bloqueada por tratamento de 3-MA (Figura 5C). Consistente com este resultado, a viabilidade celular reduzida causada por inactivação HDAC1 foi eficazmente bloqueada por tratamento de 3-MA (Figura 5D). Estes resultados sugerem que o knockdown de HDAC1 activa a morte celular nas células CHC autophagic. Curiosamente, também descobrimos que HDAC1 inactivação não afectava beclin-1 que participam durante as fases iniciais de autofagia, e que promove a nucleação de vesículas autofágicos, e o recrutamento de proteínas do citosol [26]. Isto implicou que HDAC1 inactivação induzida beclin-1 autophay independente em células Hep3B. Para verificar que a inactivação HDAC1 medeia a morte celular autofágica-dependente LC3B, LC3B foi silenciado em células Hep3B. Como mostrado na Figura 5E, conversão LC3B-II induzida por HDAC1 inactivação foi completamente bloqueada por knockdown LC3B em células Hep3B. Além disso, a viabilidade celular diminuiu significativamente HDAC1 inactivação foi restaurada por co-transfeco de siARN LC3B em células Hep3B (Figura 5F). Colectivamente, estes resultados sugerem que HDAC1 inactivação contribui morte celular independente de caspase através autofagia dependente-LC3 em células Hep3B.

células Hep3B (A) foram transfectadas com ARNsi de HDAC1 (100 nmol /L) durante 72 h, fixadas e revistas sob o microscópio eletrônico de transmissão (TEM) (esquerda dois painéis). Com uma maior ampliação, foram observados autofagossomas contendo material denso elétron e organelas degradados em células HDAC1 deficiente. Em contraste, uma grande quantidade de mitocôndrias intactas foram observados em células Hep3B transfectadas por Si-Scr (direita dois painéis). As setas indicam a presença de autofagossomas. (B) Depois de knockdown de HDAC1, conversão LC3 (LC3B-I para LC3B-II) foi marcadamente aumentada, enquanto que o nível de beclin 1 não se alterou. tratamento paralelo com 5 mM de 3-MA por 48 h inibiram a ativação LC3B-II induzida por HDAC1 knockdown. células Hep3B foram também tratados com 25 ceramida uM durante 24 h, como um controlo positivo para a autofagia. O resultado densitometria dos imunoblots foi mostrado como um gráfico de barras (média ± DP). expressões relativa de proteína de HDAC1, LC3B-II e beclin 1 foram normalizados com o nível de expressão de controlo (SI-Scr) (* P 0,05). (C) Na análise de imunofluorescência, a expressão citosólica de LC3B foi induzida por knockdown HDAC1, e que foi revertido por tratamento com 3-MA em células Hep3B. análise (D) MTT mostra que a viabilidade celular foi regredido por knockdown HDAC1 na célula Hep3B. O número de células viáveis ​​foi aumentada no tratamento paralelo de 3-MA durante 48 h (* P 0,05). (E) Co-transfecção de siRNA segmentação LC3B e /ou HDAC1. A conversão LC3B foi induzida por Si-HDAC1 na ausência de Si-LC3B. O nível de proteínas foram quantificadas por ImageJ e normalizadas para GAPDH. gráfico de barras que mostra a relação em relação ao SI-Con transfectante (* p 0,05). (F) Análise MTT mostra que a viabilidade de células foi recuperado, aparentemente, na presença de Si-LC3B em HDAC1 knockdown células Hep3B (* P 0,05, Si-HDAC1 + SI-LC3B vs Si-HDAC1).

sustentada supressão de HDAC1 atenua potencial tumorigénico de células Hep3B tanto

in vitro

e

in vivo

Nossos resultados mostraram que a interrupção transitória da HDAC1 causada

in vitro

morte celular autofágica e parada de crescimento em células Hep3B. Assim, para investigar se a supressão estável de HDAC1 leva à supressão da hepatocarcinogênese, estabelecemos HDAC1 knockdown linhas celulares estáveis ​​(HDAC1KD # 1 e 2 HDAC1KD #), e confirmou a inativação de HDAC1 através da detecção de p21

WAF1 /Cip1 e p27

indução KIP1 e redução de CDC2 em linhas celulares estabelecidas (Figura 6A). Em seguida, avaliada a taxa de crescimento das linhas de células estabelecidas. Como mostrado na Figura 6B, as células HDAC1KD # 1 exibiu taxa de crescimento reduzida, em comparação com qualquer Mock-transfectante (Mock # 1) ou células parentais Hep3B (Nenhum). Com base neste resultado, o próximo realizada a formação de colónia de ensaio tal como descrito em materiais e métodos. O crescimento de células clonais foi significativamente atenuada pela supressão sustentada de HDAC1 em células HDAC1KD # 1, em comparação com o controlo (Mock # 1) (Figura 6C, p 0,05). Finalmente, para demonstrar que a superexpressão HDAC1 contribui para hepatocarcinogênese

in vivo

, nós, linhas de células injectadas subcutaneamente estabelecidos (isto é HDAC1KD # 1 ou # 1 Mock) em ratinhos nus atímicos. A taxa de crescimento do tumor e o volume total foi significativamente reduzido em linha celular deficiente HDAC1 (HDAC1KD # 1) em comparação com o controlo (Mock # 1) (Figura 6D, p 0,05). Aos 37 dias pós-inoculação, a massa tumoral era detectável no grupo Mock. Em contraste, nos ratos que foram injetados com HDAC1KD # 1, a massa tumoral era detectável apenas a 48 dias pós-inoculação. O volume médio do tumor na altura do sacrifício foi muito menor no grupo injectado com HDAC1KD # 1 do que as células Mock # 1 (Figura 6E, p 0,05). Além disso, a análise de imunotransferência mostrou que as expressões de p21

WAF1 /Cip1, p27

KIP1 e LC3B-II foram significativamente induzida em tecidos de xenoenxerto de HDAC1 deficiente (Figura 6F, p 0,05). Estes resultados implicam que a supressão de HDAC1 contribui para a inibição da carcinogênese hepática

in vivo

.

(A) A confirmação da supressão HDAC1 através da detecção de seus genes-alvo específicos na regulação do ciclo celular. Um resultado típico de três experimentos independentes foi mostrado. As expressões de proteínas foram quantificadas e normalizadas para GAPDH e foram mostrados como proporção em relação ao Mock. (B) taxa de crescimento celular das células Hep3B que expressam estavelmente um shRNA mexidos (Mock # 1) ou shRNA HDAC1 (HDAC1KD # 1) foi determinada por contagem de ensaio em cada ponto de tempo indicado. Os dados foram apresentados como média ± SD de três experiências. (C)

In vitro

ensaio de formação de colónia. Os clones celulares que expressam mexidos shRNA (Mock # 1) ou shRNA HDAC1 (HDAC1 KD # 1) foram mantidas em placas de 6 poços. O gráfico de barras indica o número de colónias. Os dados são apresentados como média ± DP de três experiências independentes (* p 0,05, HDAC1KD # 1 vs 1 # Mock). (D) O crescimento geral do tumor de xenoenxertos de células Hep3B. (E) Os ratinhos foram sacrificados aos oitenta dias após a injecção, e o peso do tumor foi medido. Os dados foram apresentados como a média ± DP (* p 0,05). (F) no momento do sacrifício, os tumores de xenoenxertos foram excisados, e proteína total extraído de cinco ratinhos seleccionados aleatoriamente de cada grupo foi submetido a análise de transferência de Western utilizando os anticorpos indicados. As expressões de proteínas foram normalizados para os de GAPDH, eo nível de expressão relativa de cada proteína foi descrita como gráfico de barras (* p 0,05)

Discussão

histona desacetilases (HDACs. ) representam uma família de enzimas que cooperam com histona acetiltransferase para modular a estrutura da cromatina e a actividade de transcrição através de alterações no estado de acetilação de histonas nucleossomais [27]. Acumulando evidências sugerem que as HDACs regulam tanto a expressão e a actividade de numerosas proteínas envolvidas em ambos iniciação e progressão de cancro [27], [28]. Recentemente, vários estudos têm mostrado que certas famílias de HDAC são expressas de forma aberrante em tumores e tem a função redundante no desenvolvimento do cancro [4], [29]. Consistentemente, cada vez mais evidências sugeriram a expressão aberrante de HDAC1 em doenças neoplásicas, e demonstrou que a depleção de HDAC1 provoca a paragem do crescimento e apoptose de certas células de cancro humano [10], [27], [29]. No entanto, o papel de HDAC1 em hepatocarcinogenese ainda não foi elucidado. Neste estudo, foi sugerido que a ab-rogação da expressão aberrante de HDAC1 activado a morte celular autophagic independente de caspase e preso a /S transição do ciclo celular G1 em células Hep3B humanas, e, por conseguinte, suprimido o crescimento de células tumorais no modelo de xenoenxerto de animais.

Em um estudo recente de câncer gástrico, expressão HDAC1 foi relatado para ser sobre-expresso e teve valor prognóstico para câncer gástrico [8]. Indução de HDAC1, 2, 3 níveis de expressão também implicado reduziu a sobrevida dos pacientes no cancro colorectal [30] significativamente. A contribuição da expressão HDAC1 para a transformação maligna de fígado normal, também foi estudado num modelo de ratinho transgénico [31]. Além disso, um relatório recente sugeriu que tanto HDAC1 e HDAC2 cooperativa regulada a proliferação de rato embrionárias fibroblastos (MEF) e teve um papel fundamental para a diferenciação hematopoiética [32]. No carcinoma hepatocelular, de expressão elevada de HDAC1 foi associada com a invasão de células de cancro na veia porta, pobre diferenciação histológica e baixa sobrevivência do paciente [6]. Isto também foi confirmado pelos nossos dados publicados anteriormente expressão de microarrays à base de RNAm abrangentes [17]. Destes genes outlier associados com multi-passo hepatocarcinogênese, que recapitulou expressão HDAC1 e mostrou altamente superexpressão no HCC evidente. A análise de imunotransferência de HDAC1 num subconjunto de tecidos humanos e HCC linhas celulares de cancro do fígado demonstraram a superexpressão de HDAC1 em HCC, e segmentados perturbações de HDAC1 causou o atraso de crescimento em várias linhas celulares de carcinoma hepatocelular (Figura 1). As evidências sugerem que se acumulam sobre-expressão de HDAC1 aparece especialmente comum em cancros do sistema gastrointestinal e está associada com desdiferenciação, proliferação aumentada, invasão, doença avançada e de prognóstico reservado. No entanto, nenhuma tentativa foi feita para explicar os mecanismos subjacentes responsáveis ​​pelo potencial oncogénico de HDAC1 no HCC. Por esse motivo, os efeitos da inactivação HDAC1 avaliada com as proteínas reguladoras do mecanismo de crescimento e morte celular.

Tem sido bem documentado que a repressão mediada por HDAC de genes pode causar o crescimento descontrolado de células, como as HDACs reprimir a transcrição de ciclina inibidores de quinase dependentes de (CDKIs), permitindo a proliferação continuada [27]. Em células de osteossarcoma e cancro da mama, foi relatado que o knockdown de HDAC1 resultou na paragem do ciclo celular G1, quer a ou transição de fase G2 /M, e aumentou a percentagem de células apoptóticas [10]. Nossos resultados indicam que a ruptura de HDAC1 p21 induzida

WAF1 /Cip1 e p27

expressões KIP1 implicando assim a inibição do G1 S transição /do ciclo celular (Figura 2B). Além disso, HDAC1 knockdown suprimiu a expressão de ciclina D1 e CDK2 (Figura 2C).