Abstract

câncer de ovário seroso (SEOC) é o mais mortal malignidade ginecológica. MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos RNAs não codificantes que regulam a expressão do gene e a tradução da proteína. MiRNAs também são codificados por vírus com a intenção de regular os seus próprios genes e as das células infectadas. Este é o primeiro estudo que avalia miRNAs virais em SEOC. MiRNAs dados de sequenciamento de 487 pacientes SEOC foram baixados do site da TCGA e analisados ​​através de in-house gasoduto sequenciamento. Para análise TCGA cross-validate, medimos a expressão de miR-H25 por imunofluorescência quantitativa em uma coorte adicional de 161 pacientes SEOC. Gene, expressão miARN, e citotoxicidade de ensaio foram realizados em várias linhas celulares de cancro do ovário transfectadas com miR-H25 e miR-BART7. análise dos resultados foi realizada utilizando o método multivariada de Cox e de Kaplan-Meier. miRNAs virais são mais expressos em SEOC do que em tecidos normais. Além disso, miRNAs virais herpéticas (miR-BART7 de EBV e miR-H25 de HSV-2) são biomarcadores importantes e preditivos de resultado na análise multivariada de Cox. MiR-BART7 se correlaciona com a resistência a quimioterapia de primeira linha e morte precoce, ao passo que o miR-H25 parece conferir um efeito protector e sobrevivência a longo prazo. análise integrada da expressão gênica e miRNAs virais sugere que miR-BART7 induz diretamente cisplatina-resistência, enquanto miR-H25 altera processamento do RNA e afeta a expressão de miRNAs humanos nocivos, tais como miR-143. Esta é a primeira investigação que liga expressão miRNA viral para o resultado do cancro do ovário. miRNAs virais pode ser útil para desenvolver biomarcadores para o diagnóstico precoce e como uma potencial ferramenta terapêutica para reduzir SEOC letalidade

Citation:. Pandya D, Mariani M, McHugh M, Andreoli M, Sieber S, Ele S, et al . MicroRNA Expression (2014) Herpes Virus e Significado em câncer de ovário seroso. PLoS ONE 9 (12): e114750. doi: 10.1371 /journal.pone.0114750

editor: Pierre Busson, Gustave Roussy, França |

Recebido: 12 de junho de 2014; Aceito: 13 de novembro de 2014; Publicação: 08 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Pandya et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Análise foi realizada no conjunto de dados TCGA que é livremente acessível no portal de dados TCGA (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/). 3 dados de nível são acessíveis, sem restrições, enquanto o nível 1 de dados e informação clínica é acessível após um pedido for apresentado através do portal de dados TCGA. Políticas de acesso a dados TCGA são explicados no https://cancergenome.nih.gov/abouttcga/policies/policiesguidelines

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente financiado por uma bolsa da AIRC (Associazione Italiana Ricerca sul Cancro, IG11975 ), Associazione OPPO e le sue stanze ONLUS, pelo Cancer Research Program Ruth C. Donovan e por uma doação liberal do Sr. e Sra Ruggles. Este trabalho é dedicado a Monica DeFeo que perdeu sua batalha corajosa contra o cancro na tenra idade de 53. Os patrocinadores do estudo não têm qualquer papel na concepção e gestão estudo

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

câncer de ovário seroso (SEOC) é a neoplasia maligna ginecológica mais letal. Devido à sua preguiça clínica, a maioria dos pacientes são diagnosticados fase tardia quando a cirurgia por si só é insuficiente para erradicar completamente o tumor. Como consequência, a quimioterapia é geralmente necessária para controlar ainda mais a doença. Quimioterapia de primeira linha para o cancro do ovário geralmente inclui um composto de platina (geralmente carboplatina) e um taxano (paclitaxel em geral) [1]. Biomarcadores que são prospectivamente preditivos de sensibilidade ou resistência à quimioterapia são desesperadamente necessários para individualizar corretamente opções terapêuticas e evitar tratamentos tóxicos para os pacientes que serão refratário à quimioterapia. A tarefa de desenvolver tais biomarcadores, problemáticos para todos os tumores sólidos, é particularmente irritante para câncer de ovário em que a heterogeneidade clonal extrema é a norma e para a qual não foram identificadas mutações de condução [2].

Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos RNAs não codificantes, que regulam a expressão de genes e tradução de proteínas e afectam todos os aspectos da fisiologia celular. Evidências acumuladas indicam que muitos miRNAs são expressas de forma aberrante em cancros humanos, e perfis de expressão miRNA têm aumentado informação prognóstica fornecida por sistemas de classificação tradicionais relacionados com a fase e subtipo [3], [4], [5]. Os vírus também codificam miRNAs e, assim, afetar o funcionamento das células infectadas. Nos mamíferos, a infecção virai é um potente gatilho da resposta de interferão, que inibe a replicação viral e atenua danos virais. A infecção de células de mamíferos por vírus de ARN, excepto retrovírus, conduz à geração de longas ARNcd durante o ciclo de vida do vírus. vírus de ADN produzir ARNcd por transcrição convergente dos seus genomas virais compactos. ARNcd virai é um potente gatilho da resposta de interferão que fosforila o factor de translação eIF2a e leva a paragem translacional global e a apoptose [6], [7], [8]. Como uma estratégia adaptativa, os vírus têm evoluído uma diversificada gama de contramedidas para bloquear a produção de interferon, e algumas delas contam com miRNAs virais como efetores de controle celular. Todos os vírus de herpes actualmente conhecidas (humanos e não humanos) codificam múltiplos miARNs [9]. Como exemplo, o hCMV miR-UL112-1 inibe não só a aparência IE1 viral, mas também expressão MICB celular para promover a latência viral e evitar a erradicação de células assassinas naturais [10]. Portanto, parece que o vírus do herpes são capazes de seqüestrar o controle intracelular da expressão do gene /proteína através de miRNAs virais. Infecções

herpéticas são teimosamente comum e generalizada em seres humanos. EBV [11] e do CMV [12] infecções estão presentes em pelo menos 80% da população. Em todo o mundo taxas de infecção do vírus Herpes simplex (HSV), contagem de ambos os herpes (HSV-1) e herpes genital (HSV-2), situam-se entre 65% e 90% [13]. Estes dados epidemiológicos implica uma elevada probabilidade de que os pacientes com cancro do ovário são portadores de pelo menos uma ou mais infecções herpéticas. Devido à sua prevalência generalizada e persistência e capacidade de influenciar a transcrição e tradução em células infectadas, que a hipótese de que herpes miRNAs virais são mediadores clinicamente importantes de SEOC biologia com significativo potencial como biomarcadores e alvos de drogas.

Resultados

A expressão de miRNAs virais é maior em SEOC do que em tecidos normais

O projeto Cancer Genome Atlas (TCGA) [14] analisados ​​e catalogados expressão RNA mensageiro, expressão miRNA (Illumina Hiseq), a metilação do promotor e DNA número de cópias em 489 adenocarcinomas de ovário seroso avançados e as sequências de DNA de exons de genes que codificam em 316 desses tumores. Este trabalho pioneiro é um excelente recurso para o desenvolvimento de estratégias novas e inovadoras para o tratamento de câncer de ovário. Os estudos TCGA miARN publicados até à data utilizados apenas os dados de nível 3, que representa os miARNs mapeados utilizando apenas o humano (não virai) miRNAome como referência. A fim de superar esta limitação, baixamos o nível 1 dados brutos, e realizamos o mapeamento miRNA-seq para 487 pacientes que fazem referência tanto humanos

e miRNAomes virais

. Tivemos sucesso no mapeamento de 88,2% de leituras. O número médio de mapeada lê para cada paciente foi de 9,2 milhões. Como antecipado, a maior porção de leituras foi mapeado no miRNAome humano. No entanto, um número detectável e bastante considerável de lê-se (n = 184618) foi mapeado para o miRNAome viral, demonstrando assim a presença de miARNs virais em pacientes SEOC. Os resultados foram normalizados para ter em conta que o número total de leituras a partir de cada paciente, não era idêntica e que, na ausência de normalização, as variações do número de leituras de miARN indivíduo poderia ser devido a uma profundidade de sequenciação. Portanto, nós normalizado de dados como TPM (transcrições por milhão) lê. O número médio de miRNA viral lê para cada paciente foi 45,6 TPM. Os miARNs virais mais abundantes foram mapeados no HSV-1 (N = 128701) e o HSV-2 genoma (n = 51709). HH6VB e EBV foram responsáveis ​​por 986 e 1.260 lê, respectivamente. CMV (citomegalovírus) e KSHV (Sarcoma de Kaposi Herpes Virus) estiveram presentes com 96 e 178 lê, respectivamente. O TCGA não incluem controles de tecido ovariano normal para miRNA-seq. A fim de ter uma gama de referência para a expressão de miARN virais em tecidos cancerosos, baixamos 607 tecidos normais do TCGA incluindo bexiga, cabeça da mama pescoço, rins, fígado, pulmão, placenta, da tiróide, da próstata e do útero, para um total de 7,7 bilhões de sequências. As amostras foram analisadas seguindo o mesmo procedimento descrito acima. Em tecidos cancerosos, os níveis de miARN virais média significativamente inferior (TPM 11.8), em comparação com uma média de 45,6 TPM na SEOC (Fig. 1). Estes resultados demonstram que a expressão de miARN virais é maior em SEOC do que em tecidos cancerosos

asteriscos duplos indicam diferença significativa (p 0,0001, teste t). Entre a expressão de miARN viral em SEOC, em comparação com não canceroso tecidos. Os dados são expressos à soma de todos os miARNs virais. Os dados estão expressos como TPM eo bar no gráfico corresponde à média dos tecidos não cancerosos (11,8) e SEOC (45,6).

Em seguida, foi realizada uma análise comparativa dos níveis de miR tanto expressão -H25 e miR-BART7 e alguns miRNAs humanos normalmente expressos no componente epitelial de SEOC (miR-21) [15], [16] e nos glóbulos vermelhos (mIR-16) [17] (Fig. 2). MiR-21 os níveis de expressão foram significativamente mais elevados do que aqueles do miR-16 (p 0,001, teste t emparelhado). Um padrão similar foi também observado tanto para miR-H25 e miR-BART7, que foram expressos em níveis significativamente menores em comparação com miR-21 (p 0,001, teste t emparelhado). Em comparação com o miR-16, mais uma vez ambos os miARNs virais foram significativamente expresso em níveis mais baixos (p 0,001, teste t emparelhado), mesmo se, neste caso, a diferença na expressão foi menos consistente do que o observado para miR-21

As mulheres foram classificados como positivos ou negativos para miR-BART7 e miR-H25 se TPM 0 ou TPM = 0, respectivamente. Em cada parcela a linha horizontal corresponde à mediana, caixa à 25

th-75

percentil e as linhas para o intervalo de confiança (5

th-95

percentil).

papel prognóstico de miRNAs virais em SEOC

a fim de avaliar se a expressão de miRNAs virais era prognóstico, analisamos cada miRNA viral individual em um modelo de regressão de Cox. A análise foi realizada em análise uni e multivariada incluindo idade e estágio, uma vez que estas variáveis ​​foram preditores univariados significativos. O ponto final foi a sobrevida global (OS) medido em meses. Uma taxa de risco (RH) 1 indicam um efeito prejudicial no OS, enquanto AR 1 significava um efeito protector. A análise foi realizada usando a expressão de miARN viral (TPM) como uma variável contínua. A análise total de agrupados para cada vírus não apresentou capacidade preditiva significativa no modelo multivariada Cox (

p Art 0,05). Apenas HSV-1 tenderam em direção a um efeito protetor significativo com um

p

-valor em análise multivariada de 0,053 (HR = 0,33; IC 0,03-1,01). Ao limitar a piscina, no entanto, para incluir apenas as HSV-2 miRNAs virais normalmente expressos durante a infecção produtiva (miR-H9, miR-H11, miR-H12, miR-H13, miR-H19, miR-H20, miR-H21, miR-H22, miR-H23 e miR-H25 [9]), o efeito protetor alcançou significância estatística (HR = 0,2; IC 0,04-0,89,

p

= 0,032). Notavelmente, a expressão de miR-viral H25 (HSV-2) foi encontrada em 233/487 (48% com TPM 0) dos espécimes. A análise multivariada, utilizando o modelo de Cox mostrou que a alta expressão desse miRNA viral estava relacionada a um melhor resultado (HR = 0,1; IC 0,01-,55;

p

= 0,006). Além disso, a expressão de miR-H25 foi mais elevada em pacientes com resposta completa quimioterapia e inferior nos pacientes com doença progressiva (Fig. 3). Embora o mecanismo de infecção é desconhecido, produtiva de HSV-2 com elevada expressão associado de miR-H25 pode inibir a replicação de células de cancro directamente ou aumento de morte de HSV-2 de células de cancro infectadas pelo sistema imunológico.

asteriscos indicam significativos diminui da expressão de miR-H25 em pacientes com ambas as PD SD e, em comparação com pacientes com RC. Esta descoberta apoia um papel protetor de expressão de miR-H25.

Depois disso, analisamos a expressão de miR-H25 em uma coorte adicional de 161 pacientes SEOC cujo quadro clínico estão resumidos na tabela 1. Para cada paciente, até 12 núcleos de tecido foram colhidas de diferentes regiões de cada cancro (933 núcleos no total), e estes foram interrogados num formato de tecido de micro matriz (TMA). A expressão de miR-H25 (corado com personalizado feito sonda Exiqon) em cada núcleo foi analisado com software AQUA que utiliza um conjunto predefinido de algoritmos e método sem supervisão para avaliar os níveis-alvo em várias sub-compartimentos celulares (ou “máscaras”). anticorpos para citoqueratina e vimentina a coloração desde o tumor do estroma e máscaras, respectivamente, e DAPI serviu para definir a máscara nuclear. Um resumo dos resultados da pontuação AQUA é relatada na Fig. 4. intensidade global de miR-H25 foi maior no citoplasma das células cancerosas e inferior da máscara de estroma. Os controlos negativos e positivos foram obtidas utilizando um oligonucleótido não segmentação de qualquer região do genoma humano (SiC) e o RNA pequeno U6, respectivamente. sonda de SiC não apresentaram coloração (Figuras 5 . 6A). Como esperado, a sonda U6 demonstrou expressão nuclear em quase 100% das células (Fig. 6B). Expressão de U6 foi mais elevada nas células cancerosas epiteliais, em comparação com os níveis notado em células do estroma (Fig. 6B). sonda miR-H25 foi detectada com dois padrões de expressão. Em um deles, a coloração sonda foi confinada ao núcleo das células de tumor (Fig. 6C). Num segundo, houve coloração citoplasmática difusa de ambas as células de tumor e de estroma (Fig. 6D). figuras adicionais para descrever em maior ampliação do padrão de coloração são fornecidos como S1, S2, S3, S4 e S5 Figuras. A análise multivariada Cox incluindo idade e estágio revelou que a expressão de miR-nuclear H25 não foi preditivo do resultado (HR 0,91; IC 0,65-1,24), enquanto que a expressão com um padrão de coloração citoplasmática foi significativamente associada com bom resultado (HR 0,56; IC 0,39-0,79;

p

= 0,0008). Esta análise AQUA suporta plenamente a nossa descoberta de TCGA conjunto de dados, ou seja, que a infecção produtiva de HSV-2 (com concomitante citoplasmática miR-H25 sobre-expressão) oferece protecção aos pacientes SEOC.

Cada ponto corresponde ao valor de um indivíduo núcleo tecido. pontuações AQUA foram calculados na máscara do estroma (pontos azuis), na máscara nuclear (pontos vermelhos), na máscara citoplasmática tumor (pontos verdes) e na máscara de tumor (pontos amarelos). As linhas correspondentes referem-se à média suavizada para cada paciente ea coloração é o mesmo dos pontos.

Na parte superior sonda SiC e, no fundo, sonda miR-H25. sinal azul = DAPI. Amarelo = Cytokeratin. Verde = Vimentin. sonda rosa = miR-H25. tamanho barra equivale a 100 mm

De cima para baixo:. fundiu imagem, coloração nuclear (DAPI), máscara de tumor (citoqueratina imunocoloração), máscara de estroma (vimentina imunocoloração) e sonda de RNA. As sondas são SiC (mexidos controlo interferir) (A), U6 (controlo positivo) (B), e miR-H25 (C D). C representa a expressão de miR-H25 típico de HSV-2 latente infecção (coloração nuclear de células tumorais). D representa a expressão de miR-H25 característica de produção de HSV-2 (expressão citoplasmática no tumor e no estroma). tamanho da barra é igual a 100? M.

Por outro lado, a análise TCGA miRNA-seqüenciamento demonstraram que a expressão de miR-BART7 (produzido por EBV) estava relacionado com PFI encurtado (platina livre intervalo) e pobres resultado. Embora a expressão de miR-BART7 (TPM 0) foi identificado apenas em 7,9% das amostras No geral, foi sobre-representados em pacientes com doença refratária e resistente em comparação com o grupo sensível à quimioterapia (Fig. 7A e 7B) . Por conseguinte, os pacientes positivos miR-BART7 exibiram encurtado sobrevida global em Kaplan Meier (Fig. 7C) e Cox análise multivariada (HR 3.4, IC 2,2-6,6,

p

= 0,002).

A : Os pacientes foram rotulados de acordo com PFI como refractário (PFI 6 meses), resistentes (PIF 6-12 meses) e sensível (PFI 12 meses). Expressão de miR-BART7 é significativamente menor no sensível em relação aos grupos refractários e resistentes (duplo asterisco, p 0,001, teste t). B: Análise de contingências (trama mosaico) de pacientes agrupadas para a expressão de miR-BART7 (TPM 0 é positivo (n = 38), as barras a azul; TPM = 0 (n = 449) é barras negativos, vermelho) e de acordo com a resposta à quimioterapia, como descrito em A. asteriscos duplos mostram que a proporção de pacientes sensíveis, é mais elevada no grupo de miR-BART7 negativo (teste exacto de Fisher, p 0,001, asteriscos duplos). C: análise de Kaplan-Meier dos pacientes TCGA (n = 487) de acordo com a expressão de miR-BART7. A taxa de mortalidade precoce é significativamente maior nos pacientes positivos miR-BART7 (teste de Wilcoxon, p = 0,01). OS (eixo X) representa a sobrevida global expresso em meses.

A identificação de mecanismos modificadoras de SEOC biologia

Uma das vantagens do conjunto de dados TCGA é a inclusão de ambos miRNA-seq e os dados de expressão de genes. Este recurso permite que o desempenho da gestão integrada análises com vista a identificar genes candidatos regulados por miRNAs virais como descrito anteriormente para miRNAs humanos [18]. Nós tínhamos focado nossas análises sobre os dois miRNAs virais individuais (miR-H25 e miR-BART7), que mostrou significância em estudos de resultados clínicos como descrito acima. Baixamos o nível 2 comunicação de dados de expressão gênica análises utilizando chips de Affymetrix U133. Para 414 pacientes (que foram designados aleatoriamente para um treinamento ou conjunto de teste), foram analisados ​​com sucesso tanto expressão gênica e miRNA viral. Nós agrupamos os pacientes de acordo com os níveis dos dois miRNAs virais de interesse de expressão (positivo = TPM 0 vs. negativo = TPM = 0). Os genes significativamente diferentes entre os dois grupos foram identificados em um nível de confiança de

p Art 0,05, após a correção múltipla hipótese com o método Benjamini-Hochberg. Usando essa abordagem, encontramos 262 genes diferencialmente expressos para miR-H25. De acordo com o recurso de bioinformática DAVID [19], que agrupados em 12 grupos funcionais independentes, com ARN-processamento, o splicing e de transporte como a mais significativa (Fig. 8). O impacto sobre o processamento do ARN foi acompanhada por uma modulação significativa da expressão de algumas miARNs humanos. Por exemplo, as mulheres com níveis elevados de miR-H25 (Fig. 9A), mas não o miR-BART7 (Fig. 9B) mostraram uma redução significativa na expressão de miR-143. MiR-143 é um potente miRNA, que, no estudo TCGA, estava relacionado com mau resultado no modelo de Cox multivariada (HR 14,8, CI 5,9-37,9,

p Art 0,001) e análise de Kaplan-Maier (Fig. 9C). O efeito de miR-H25 em miR-143 parece não relacionado com inespecífica a sub-regulação de processamento de miARN, como nenhuma diferença significativa entre os doentes negativos e positivos miR-H25 na expressão total de ARN não codificante foi observada (Fig. 9D). A influência de miR-H25 na expressão de miR-143 podem, de facto, ser específico e directa; fomos capazes de reproduzir o mesmo fenômeno in vitro utilizando duas linhas de células SEOC (A2780 e SKOV-3) transfectadas com um sintético miR-H25. A sobre-expressão de miR-H25 foi testada em três concentrações (0,1, 1 e 10 nm) usando o meio de transfecção, um oligo mexidos não segmentação de qualquer região do genoma humano (SiC) e um miARN não virais expressas em SEOC (miR- UL112) como controles negativos. Apenas o miR-H25 produziu um sub-regulação significativa de miR-143 de expressão (Fig. 10).

A rede de miR-H25 35 mostra genes envolvidos no processamento do ARN, splicing e transporte. Cobertura da rede no banco de dados DAVID é 15/35 (42%, círculos pretos).

gráfico enredo Box-whisker mostrando a expressão de miR-143 (TPM) de acordo com a expressão de miR- H25 (A) e miR-BART7 (B). Os pacientes foram considerados positivos para a expressão de miARN viral se o valor do TPM era 0 (n = 233). Os pacientes com TPM = 0 foi definido negativo (n = 254). O gráfico mostra uma regulação negativa significativa de miR-143 em mulheres positivas para miR-H25 (p 0,001, teste-t), mas não em pacientes positivos para miR-BART7. A análise de Kaplan-Meier de doentes de acordo com a expressão de miR-143 (C). Pacientes com elevada expressão de miR-143 exibem um resultado significativamente pior em comparação com os pacientes com baixa expressão de miR-143 (P 0,001, teste de Wilcoxon). D: Análise da expressão de RNA não codificante (como TPM) em pacientes agrupadas para a expressão de miR-H25. Linhas verdes e diamantes representam os meios e os intervalos de confiança das médias dos dois grupos. A diferença não é estatisticamente significativa (

p Art 0,05, teste t).

A-C e B-D a expressão de miR-H25 e miR-143, respectivamente. Em A-B e C-D, A2780 e células SKOV-3, respectivamente. Azul: controle com transfecção médio; Vermelho: controle Scrambled sonda sintética (SiC); Verde: o miR-UL112 sintético; Black: miR-H25 sintético. Os dados mostram que a expressão de miR-H25 (10 nM) suprime a expressão de miR-143 em ambas as linhas celulares.

Para que o miR-BART7 relativa, realizou-se a mesma análise de rede de genes acima descrito para miR -H25. expressão miR-BART7 agrupado com 221 genes em 6 grupos funcionais, a mais importante das quais é a via de activação de células T (Fig. 11). Além disso, identificamos uma regulação positiva significativa do gene ADH1B. Este gene codifica para a álcool-desidrogenase 1B, a enzima chave para a conversão de etanol em acetaldeído, uma substância que interfere com a reparação do ADN [20]. ADH1B foi significativamente maior em mulheres que expressam o miR-BART7 (Fig. 12A), enquanto que não foi alterada em mulheres que expressam o miR-H25 (Fig. 12B). Apoiando os dados de prognóstico miR-BART7 apresentado na Fig. 5, as mulheres com alta expressão de ADH1B foram relativamente sobre-representados entre os pacientes refratários ou resistentes à quimioterapia de primeira linha (Fig. 12C). A fim de explorar a relação entre a expressão e resistência miR-BART7 à quimioterapia, que transfectadas A2780 e Ei células (duas linhas de células sensíveis a cisplatina) com um sintético miR-BART7 (10 nM, Fig. 13) ou um controlo scrambled (SiC ). A eficiência de transfecção foi confirmada com qPCR (Fig. 13A). Os efeitos de miR-BART7 também foram avaliadas em termos de indução ADH1B ao nível da proteína com a técnica de western blot (Fig. 13B). Mir-BART7 produziu uma expressão aumento significativo de ADH1B em ambos os modelos celulares. Aumento foi quantificada com a análise de densitometria em três experiências independentes e foi de 4,5 e 3,2 na A2780 e Hey células, respectivamente (

p Art 0,001 t-teste). Após 12 horas da transfecção, as células foram incubadas com cisplatina durante 72 horas e em seguida contadas. De forma a quantificar os resultados utilizou-se cisplatina a área activa (%), como recentemente descrito por Barretina e Coll. [21]. A transfecção com o miR-BART7 produziu um aumento significativo na resistência à cisplatina em ambas as linhas celulares (Fig. 13C e Fig. 13D). Como notado em pacientes ao nível do gene, o miR-BART7 induziu um aumento significativo da expressão ADH1B em ambas as linhas celulares. Além disso, testou-se o efeito de fomepizol, um inibidor específico da actividade conhecida ADH1B [22]. Fomepizol revogada completamente o efeito de miR-BART7 sobre a toxicidade da cisplatina (Fig. 13E, 13F e 13G), demonstrando assim que o miR-BART7 diminui a eficácia da cisplatina, aumentando a atividade ADH1B.

A rede de miR-BART7 mostra 67 genes envolvida na activação de células T. Cobertura da rede no banco de dados DAVID é 47/67 (70%, círculos pretos).

Box-whisker gráfico gráfico que mostra a expressão de ADH1B de acordo com a expressão de miR-BART7 (A) e miR-H25 (B). O asterisco indica uma sobre-expressão significativa de ADH1B em pacientes positivos miR-BART7 (

P

= 0,02, teste-t), mas não em pacientes positivos miR-H25. análise de contingência (C) (lote mosaico) de pacientes estratificados de acordo com a expressão ADH1B (azul e vermelho estão em alta e baixa expressão, respectivamente) e sensibilidade à quimioterapia (refractário, resistente e categorias sensíveis, como descrito na Fig. 5A). expressão ADH1B é significativamente maior em doentes refractários e resistentes (

p Art 0,05, teste exato de Fisher)., em comparação com o grupo sensível (semelhante a miR-BART7)

representativos qPCR análise de células transfectadas com um A2780 sintético miR (10 nM) correspondendo à sequência de miR-BART7 (linha verde) (a). Os controlos foram representados por células tratadas apenas com o meio de transfecção (linha azul) e uma sequência não alvo o genoma humano (SiC, linha vermelha). Western blot representativo em células tratadas como em (A). O tratamento com o miR-sintética BART7 induziu a expressão de ADH1B ao nível da proteína em ambas as linhas celulares. GAPDH serviu como controlo de carga (B). gráfico de linhas que mostra o efeito da cisplatina em células A2780 (C) e Hey células transfectadas (D) tal como descrito em (A). gráfico de linhas que mostra o efeito da cisplatina com fomepizol (10 fiM) em células A2780 (E) e Hey células transfectadas (F), tal como descrito em (A). gráfico de barras (G) que mostra a área ativa de cisplatina em células A2780 e Hey. As células foram tratadas como em (D-E). efeitos de cisplatina foram monitorados após 72 horas de cultura na presença (ou não) de fomepizole 10? M. Bares e barras de erro correspondem à média e desvio padrão de amostras em triplicado realizadas em duplicado. asteriscos duplos marcar um efeito significativo em um

p

. 0,001 nível (teste t)

Discussão

SEOC é o mais mortal malignidade ginecológica. Os pacientes irão beneficiar da identificação de biomarcadores úteis para o diagnóstico precoce da doença (mais tratáveis), e do desenvolvimento de terapia direcionada. Este estudo é, a nosso conhecimento, a primeira investigação detalhada do papel de expressão miRNA viral no câncer de ovário. Em primeiro lugar, demonstra-se que a expressão do total das miARNs virais é maior em comparação com SEOC como tecidos normais. Como parte das estratégias adoptadas por células de cancro do ovário para escapar ao reconhecimento pelo sistema imune, não é a inibição da resposta do interferon endógeno [23], [24], [25]. A resposta de interferão insuficiente cria um ambiente favorável para o crescimento celular e replicação viral [8], explicando, assim, o aumento dos níveis de miARN virais em tecidos SEOC. Desde miARNs são resistentes à degradação e podem ser detectados no sangue periférico [26], os autores sugerem que circulantes totais miARNs virais será maior na população de cancro do ovário em comparação com os controlos. Uma limitação da nossa investigação é que, no conjunto de dados TCGA não há controles normais provenientes de tecidos ovarianos. No entanto, levamos em consideração os níveis de expressão normais obtidos em um grande painel de tecidos. Em todos estes tecidos não cancerosas não houve diferença significativa na expressão de miARN virais. Portanto, acreditamos extremamente improvável que no tecido normal do ovário por algumas razões há um aumento da expressão de miRNA viral.

Em segundo lugar, nós relatamos que dois atos viral indivíduo miRNAs miR-H25 e miR-BART7, como moduladores da biologia SEOC. HSV-2 infecção produtiva induz um elevado nível de miR-H25 [27], que se correlaciona com um melhor resultado. Nós documentar essa aparente efeito protetor em duas coortes clínicos independentes, utilizando duas abordagens independentes, miRNA-sequenciação (TCGA) e imunofluorescência quantitativa (AQUA). AQUA permite a análise subcompartimento celular, e este método revela que o efeito protector de miR-H25 é evidente apenas quando a sua expressão é citoplasmática (e característico da infecção produtiva por HSV-2) em vez de Nuclear (implicando a infecção latente por HSV-2). MiR-H25 podem exercer os seus efeitos ao sequestrar processamento de ARN do hospedeiro e regulação negativa de miR-143 humano, um potente miARN em função celular humana [28]. Na verdade, nós fornecemos a evidência direta para este fenômeno em células transfectadas com um miR-H25 sintético. Embora, a utilização de estirpes de VHS oncolíticos como um tratamento para doentes com cancro do ovário foi previamente relatada [29], [30], [31], a estratégia envolveu a vacinação com o objectivo de limitar a infecção produtiva de HSV. Nossas observações sugerem, pelo contrário, que produtiva infecção HSV-2 é potencialmente vantajosa e pode ser explorada para aumentar a eficácia de cepas de HSV oncolytic.

Considerando que miR-H25 proporciona um efeito protector aparente, miR-BART7 está associada com alta mortalidade precoce. De acordo com descobertas recentes no carcinoma da nasofaringe [32], mostramos um papel para miR-BART7 na indução de intervalo livre de platina reduzido (PFI) em um pequeno subconjunto de pacientes nos quais esse miRNA é expressa. estudos de transfecção com um sintético miR-BART7 produziu um aumento significativo em células resistentes à cisplatina, que é totalmente revertido com a utilização de fomepizol, um conhecido inibidor de ADH1B. Em nossa análise, tanto miR-BART7 e ADH1B são elevados em pacientes refratários ou resistentes à quimioterapia de primeira linha. A relação entre o miR-BART7 e ADH1B é de interesse devido ao relatório da ADH1B como uma fonte potencial de chemoresistance no cancro do ovário [33]. Fomepizol está actualmente aprovado para o tratamento de metanol e de etileno-glicol intoxicações com um perfil toxicológico excelente aparente [22]. Assim, parece plausível que, em pacientes com altos níveis de miR-BART7, a inibição ADH1B pode resultar em uma melhor resposta à cisplatina.

Nosso estudo é o primeiro relatório que mostra um potencial envolvimento de miRNA viral como motoristas de biologia do câncer de ovário. Podemos explicar os nossos resultados com três modelos patogênicos não-exclusivos. Na primeira infecção, viral ocorre nas células de cancro do ovário com produção concomitante de miARN viral. Acreditamos que esta possibilidade pouco provável, para a grande diferença entre os níveis das miARNs virais de expressão, em comparação com miARN humano expresso em células de cancro, como o miR-21. Na segunda, a infecção ocorre no tecido do ovário em células do estroma, onde é sabido que o vírus pode replicar tais como as células B e neurais para o EBV e HSV-2, respectivamente. Um terceiro modelo é que a infecção não está ocorrendo no tecido ovariano, mas em um local remoto e o miRNA viral são tomadas pelo câncer através de circulação.

Em conclusão, nós fornecemos evidências convincentes para o papel de herpesvírus codificados miRNAs em SEOC. Nossas observações que totalizam miRNA viral e pelo menos dois miRNAs virais específicas estão aumentadas em doentes com cancro do ovário pode ajudar no desenvolvimento de biomarcadores da doença precoce e formulação de novas estratégias anticancerígenos.

Material e Métodos