Abstract

O microambiente do tumor está repleta de proteinases. Como um sensor de proteinases, proteinase receptor 2 activada (PAR

2) desempenha um papel crítico na tumorigênese. Mostrámos que PAR

2 e a sua activação de proteinase foram co-expressos em diferentes linhas de células de cancro do cólon, incluindo HT29. Inativação de proteinase ou knockdown do PAR

2 a proliferação de células significativamente não só reduziu in vitro, mas também tumorigenicidade inibido de HT29 in vivo. Além disso, a activação de PAR

2 a síntese de ADN e promoveu a actividade desregulada de ciclina D1 em ambos os níveis de transcrição e pós-transcrição. Outros estudos mostraram que o miRNA-34-mediada

2 induzida PAR upregulation ciclina D1. A inibição de miR-34a aboliu parcialmente a supressão da ciclina D1 induzida por PAR

2 deficiência. Além disso, mostramos que TGF-β contribuiu para a regulação de miR-34a pelo PAR

2. Finalmente, em amostras de carcinoma colorretal, regulação positiva de PAR

2 e downregulation de miR-34a foram significativamente correlacionados com o grau e metástase lymphomatic. Nossos resultados fornecem a primeira evidência de que miRNA medeia a proliferação de células cancerígenas autócrina proteinase mediada por sinalização

Citation:. Ma Y, Bao-Han W, X Lv, Su Y, Zhao X, Yin Y, et al. (2013) MicroRNA-34a medeia a Autócrino Sinalização de PAR

2-Ativando Proteinase e seu papel no câncer de cólon de Proliferação Celular. PLoS ONE 8 (8): e72383. doi: 10.1371 /journal.pone.0072383

editor: Jun Sun, Rush University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de abril de 2013; Aceito: 09 de julho de 2013; Publicação: 26 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ma et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento do Programa de Pesquisa Fundamental 973 Key Nacional da China (https://www.973.gov.cn/AreaAppl.aspx) (2012CB967003) eo National Nature Science Foundation da China (http: //www.nsfc .gov.cn /Portal0 /default152.htm) (81172034, 91129717 e 81201966). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

com a conclusão do projeto genoma humano, um total de 553 genes são anotados para ser a codificação proteinase [1]. Identificação de receptores de proteinase activado (PARS) revela um papel chave para as proteinases, não só como enzimas de degradação da proteína, mas também como activadores de receptores potenciais que transmitem estímulos extracelulares em eventos de sinalização intracelular. PARs são sete receptores transmembranares que atravessam a domínios acoplados à proteína G (GPCRs) que agem como alvos de certas serina-proteases, como trombina e tripsina. A clivagem proteolítica do seu terminal amino extracelular cria o novo terminal amino, o qual funciona como um ligando amarrado e activa o receptor. O mecanismo de activação única de PAR fornece um novo mecanismo pelo qual afecta o comportamento microambiente celular. Até à data, quatro membros da família foram identificados PAR, PAR

1 para PAR

4, todos os quais possuem semelhanças na estrutura e o seu mecanismo de activação [2]. PAR

2 é o único membro da família que não pode ser activado por trombina. Os estudos em murganhos com o revelado que PAR

2 desempenha um papel mais importante na formação de tumores em comparação com outros PARs [3].

par

2 é amplamente expresso no corpo e desempenha um papel crítico em diversos tipos de câncer humano, incluindo o cancro do cólon e pulmão [4], [5]. PAR

2 promove a progressão tumoral através de uma variedade de mecanismos, tais como a proliferação celular, invasão e metástase. Foi demonstrado que PAR

2 estimulou a proliferação celular em células de cancro diferentes e emergiu como um factor mitogénico potente em diferentes tipos de cancro [6] – [10]. Outros estudos mostraram que a transactivação de EGFR [7], a activação de MAPK [9] e α integrina

5β adesão

1-dependente de fibronectina [10] pode mediar a proliferação de células PAR

2-estimuladas. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais PAR

2 regula o ciclo celular ainda são obscuros.

Como um componente importante do microambiente, proteinases de promover a proliferação de células tumorais e levar a um crescimento celular descontrolado. Algumas das proteases são capazes de actuar como activadores endógenos do PAR

2 in vivo. Além de tripsina, uroquinase-ativador de plasminogênio (UPA) /plasmina, FXA FVIIa, fatores teciduais, matriptase e Calicreínas (KLKs) podem ativar PAR

2 [11]. expressão extra-pancreática de tripsina é mostrado em cancros gástricos e do cólon [12], [13]. A expressão forçada de tripsinogênio aumenta drasticamente a tumorigenicidade das células cancerosas gástricas em ratos pelados [13]. A evidência direta mostra que a tripsina agindo em PAR

2 é um fator de crescimento muito potente para células cancerígenas do cólon humano [9].

Considerando a onipresença do PAR

2, e a produção de proteases por tumores , a existência de um loop autócrino não é inesperado, especialmente em carcinomas colorrectais. A expressão anormal de PAR

2 foi encontrada em cancros do tracto GI e linhas celulares de cancro [14] – [16]. Expressão de matriptase e tripsina foi detectada em DLD-1 [17] e linhas de células de cancro do cólon HT29 [18]. Mais recentemente, KLK14 foi encontrado para ser expressa e ser capaz de ativar PAR

2 em células cancerígenas do cólon [19]. Espera-se que a interação autócrina de serinoproteinases e PAR

2 participa em células cancerosas proliferam no cólon.

No presente estudo, demonstramos que a ação autócrina de tripsina e KLK14 promovido células do cancro do cólon a proliferação através da ativação de PAR

2. A ruptura do circuito autócrino por knockdown de PAR

2 reduziu o crescimento de células de cancro in vitro e in vivo. Além disso, mostramos pela primeira vez que o miR-34a, que tem como alvo ciclina D1, foi essencial para PAR

2 induzida pela proliferação celular.

Métodos e Materiais

Cultura celular e celular linhas

a linha de células epiteliais do cólon humano HT-29, células Caco-2, HCT-116, RKO e a linha celular de adenocarcinoma de pulmão humano A549 foram obtidas a partir de ATCC (Manassas, VA, EUA). As células foram cultivadas em Dulbecco modificado por Eagle Médium /F12 (Hyclone), complementado com 10% de FBS (Gibco).

linhas celulares transfectantes estáveis ​​com o par

2 knockdown

shRNA vector pRFP- C-RS contendo quatro diferentes PAR

2 sequências interferentes específicos e sequência mexidos foram adquiridos de OriGene Technologies. células HT29 foram transfectadas com um dos shRNAs e seleccionadas com puromicina (1 jag /mL). Quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) e Western blot foram realizados para verificar a expressão dos PAR

2.

produtos químicos e reagentes

Os inibidores de tripsina (Nº Cat. T6522 e T9128) e actinomicina D foram adquiridos a Sigma-Aldrich. (Cat. No. 04 693 159 001) cocktail inibidor de proteinase e TGF-β foram adquiridas a partir de Roche e R D, respectivamente. repórter luciferase E2F-driven foi generosamente fornecida pelo Professor Nathalie Rivard, da Universidade de Sherbrooke, Sherbrooke, QC, Canadá. O

2 selectivo peptídeo PAR activação (SLIGRL-NH

2) e de seqüência reversa peptídeo inativo (LRGILS-NH

2) foram preparados em Shanghai Apeptide Co. Ltd. (Xangai, China). SiRNA para o RNA beta-catenin e controle foram descritos anteriormente [20].

Foram analisados ​​

Declaração de Ética e Humano As amostras

As amostras de tecido de trinta casos de câncer colorretal e combinando mucosa normal. Os pacientes foram recrutados no Hospital do Câncer, da Academia Chinesa de Ciências Médicas, Beijing, China. Todos os pacientes receberam nenhum tratamento anti-câncer antes da cirurgia e formulários de consentimento informado assinados para coleta de amostras. Todos os procedimentos envolvendo amostras humanas foram aprovados pelo Institutional Review Board da Academia Chinesa de Ciências Médicas Instituto do Câncer. CRC tecidos e tecidos normais emparelhadas foram submersas em RNAlater ™ (Ambion) durante 24 h e, em seguida, armazenada a -70 ° C até à sua utilização.

marcação BrdU Ensaio

ensaio de proliferação celular foi feito com BrdU kit de ensaio de rotulagem (Roche) de acordo com o procedimento do fabricante. Resumidamente, as células foram incubadas com 10 uM de 5-bromo-2′-desoxiuridina (BrdU) durante 24 h. Após a fixação, as células foram incubadas com anticorpo anti-BrdU durante 1 h. A análise colorimétrica foi feito com um leitor de microplacas iMark ™ (BioRad), após a adição da solução de substrato de cerca de 20 min. Os dados foram calculados de acordo com as instruções do fabricante e como o valor da absorvância a 450 nm, após a subtracção dos valores em branco para o grupo. Os experimentos para o número de células foram realizados em paralelo. Os resultados do ensaio de marcação com BrdU foram normalizados com o número de células.

Formação de Colónias

Para o ensaio de formação de colónia, as células foram semeadas a baixa densidade (500 células /prato) e deixou-se crescer até visível colónias apareceram. As células foram então coradas com Giemsa, e as colónias foram contadas.

Análise MTT

3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) os ensaios foram realizados para medir o número relativo de células viáveis. Nos pontos de tempo indicados, o meio foi substituído com meio fresco suplementado com MTT (0,5 mg /mL) (Sigma-Aldrich). A absorvância foi medida usando leitor de microplacas iMark ™ (BioRad) a um comprimento de onda de 490 nm. As experiências foram repetidas pelo menos três vezes.

Western Blot

extractos de proteína a partir de células de cultura foram preparados por suspensão de células em tampão de lise (0,01% de EDTA, 0,1% de Triton X-100, e 10% mistura de inibidores de proteinase). As concentrações de proteína foram quantificados utilizando um kit de ensaio de proteína (Bio-Rad). Resumidamente, 50 mg de lisados ​​foram separadas em 12% SDS-PAGE e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno. As membranas foram sondadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários contra humanos Ciclina D1 (1:1,000; Cell Signaling Technology), PAR

2 (N-19, 1:1000; Santa Cruz Biotechnology) ou β-catenina (celular Signaling Technology), seguido por incubação com anticorpos secundários conjugados com peroxidase (Cell Signaling Technology) na diluição 1:10,000 durante 1 h. O sinal foi visualizado com ECL (Millipore).

Isolamento de ARN, a RT e a PCR

O ARN total, isolado a partir de células A549, células HT29, ou amostras de doentes, utilizando reagente TRIzol (Invitrogen), foi tratados com DNase I e de transcrição reversa usando um kit de transcrição (Invitrogen) para obter cDNA total, como modelos para detecção de mRNA ou transcritos com kit de transcrição TaKaRa ™ microRNA para obter cDNA como modelos para detecção de microRNA.

Todos os primers utilizado para a PCR quantitativa foram adquiridos de GeneCopoeia (Fulen Gen Co. Ltd., Guangzhou, China). Quantitative PCR em tempo real foram normalizadas para GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato), ou expressão de mRNA para U6 e miARN respectivamente

Os iniciadores para PCR normal tripsinogénio, KLK14 e PAR

2 foram os seguintes:. Trysinogen sentido, 5′-TACCTTTGTTGCAGCTGCTG-3 ‘, e anti-sentido, 5′-CACCACCCACTGTTCGCTG-3′; KLK14 sentido, 5′-CACTGCGGCCGCCCGATC; e anti-sentido, 5’-GGCAGGGCGCAGCGCTCC-3 ‘; PAR

2 sentido, 5′-TGAAGATTGCCTATCACATAC-3 ‘e anti-sentido, 5′-TGCATTATTTTCTGATTAAGAGCC-3’. Actina foi usado como um controlo interno.

luciferase Reporter Assay

transfecção transiente foi realizada com um luciferase E2F-driven como repórter para a atividade transcricional. O agente de transfecção de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) foi incubada com DNA no meio isento de soro durante 30 min antes de serem adicionados às células. As células foram incubadas com o complexo de transfecção durante 2 h. Os lisados ​​celulares para a actividade da luciferase foram colhidas 24 h após a transfecção, e as células foram tratadas com PAR

2-AP durante 3 h antes da colheita. Os ensaios de luciferase foram realizadas com um kit de ensaio de luciferase Dual (Promega) e os dados foram normalizados para pTK-RL.

Tumorigênese em ratinhos nus

Para os estudos in vivo, 10

6 As células foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus e o crescimento tumoral foi seguido durante 3 semanas. Todos os cuidados com os animais foi de acordo com as diretrizes institucionais. O tamanho do tumor (

V

) foi calculado duas vezes por semana a partir da segunda semana, usando a fórmula,

V

(mm

3) = 0,52 x (largura)

2 × (comprimento).

Análise estatística

Os dados são apresentados como médias ± SEM. Comparação de 2 grupos foi feita utilizando ANOVA com ou um teste post hoc de Tukey ou de um teste post hoc de Dunnett. Comparação de 2 grupos foi feita pelo teste t de Student para dados não emparelhados. Um valor associado de

p .

0,05 foi considerado significativo

Resultados

Knockdown de PAR

2 Bloqueado proliferação celular em células HT29

neste estudo, nós testamos PAR

2 níveis de mRNA em diferentes células cancerígenas do cólon incluindo HT29, HCT116, Caco-2 e células RKO. Consistente com relatórios anteriores [18], todas as células testadas mostraram expressão positiva de PAR

2 (Figura 1A). A expressão endógena de PAR

2-activação proteinases tripsinogênio e KLK14 também foi investigada por RT-PCR. KLK14 ARNm estava presente em todas as células de cancro do cólon humanos analisados, enquanto que a expressão tripsinogénio foi observada apenas em células Caco-2 e HT29 linhas celulares (Figura 1A). Desde HT29 células apresentam elevada expressão de ambos tripsinogênio e KLK14, selecionamos esta linha de células derivadas de carcinoma do cólon para estudo posterior.

A. expressão do mRNA do PAR

2, tripsinogênio, KLK14 foi medida com PCR regular em linhas celulares de cancro do cólon. células cancerosas do cólon B. foram pré-tratadas com os inibidores de tripsina (T9128 e T6522) ou serina-proteases (cocktail inibidor de proteinase, PIC) e proliferação celular foi medida pelo ensaio de MTT. expressão C. O mRNA do PAR

2 em células transfectantes estáveis ​​(PAR

2-1 e PAR

2-2) foi medida por PCR em tempo real. HT29 RS representa as células de controlo transf ectadas de forma estável com o ARN de controlo scrambled. nível de proteína de PAR

2 foi medida por Western Blot e como inserção. O efeito de PAR

2 knockdown sobre a proliferação celular foi medida por (D) e do ensaio de MTT (E) formação de colónias em células HT29. F. As células (10

6) foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus, os volumes dos tumores foram medidos como indicado, e os pesos dos tumores foram determinados na altura do sacrifício. *

P

0,05, **

P

0.01 Todos os dados são apresentados como média ± SEM. N = 3-6. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos 3 vezes de forma independente.

Para determinar se o PAR

2-proteinase autócrina é crucial para a proliferação celular, foram utilizados dois métodos para quebrar o ciclo autócrino. Em primeiro lugar, diferentes inibidores foram utilizados para bloquear a actividade de proteinase. Dois inibidores de tripsina (T6522 e T9128) e um cocktail de inibidores de proteinase (PIC) foram aplicados para bloquear conhecido e desconhecido proteínase serina que podem activar PAR

2, e todos eles bloqueou significativamente a proliferação de células HT29, conforme medido pelo ensaio de MTT (brometo de A Figura 1B). Em segundo lugar, PAR

2 foi batido de forma estável para baixo em células HT29 (Figura 1C). A análise de MTT e a formação de colónias indicado, respectivamente, que knockdown de PAR

2 bloqueou a proliferação das células (Figura 1D) e capacidade de formação de colónias (Figura 1E) in vitro. Mais importante ainda, knockdown de PAR

2 em células HT29 reduziu significativamente o crescimento do tumor em ratinhos nus (Figura 1F). Estes dados indicaram que a activação autócrina de PAR

2 pelos seus proteinase activação promover a proliferação de células de cancro do cólon in vitro e in vivo.

A ciclina D1-E2F via mediada PAR

2 mediada por proliferação celular

Para determinar os mecanismos moleculares subjacentes ao efeito de PAR

2 activação na proliferação, utilizou-se a linha celular de pulmão humano derivadas de carcinoma epitelial A549, que expressa PAR

2, mas não a proteinase de activação. O ensaio de marcação com BrdU demonstrou que a PAR

2-peptídeo activador selectivo (PAR

2-AP), mas não o péptido de sequência inversa (RP), induziu um aumento significativo na síntese de ADN (Figura 2A). Além disso, PAR

2 aumentou significativamente a activação de ciclina D1, tanto o ARNm e os níveis de proteína (Figura 2B e C). Estes resultados sugerem que PAR

2 de ativação promove ciclo celular na G1 S checkpoint /.

As células A549 foram tratadas com PAR

2 peptídeo ativando (PAR

2-AP, 50 mM) ou reverter péptido (PAR

2-RP) durante 24 h. A. síntese de DNA foi medida por marcação com BrdU assay.B. Os níveis de ciclina D1 e ARNm de Ciclina E foram detectados com a PCR após o tratamento com ou sem PAR

2-AP. nível de proteína C. A ciclina D1 foi determinada por Western blot. D. células A549 foram tratadas com PAR

2-AP (50 uM) 24 h após a transfecção transiente com E2F-luciferase (1 ug /poço). Os dados foram normalizados com TK-RL e mostrados como a percentagem do grupo de controlo. células de E. HT29 foram tratados com o PIC (cocktail inibidor de proteinase) ou T9128 (inibidor de tripsina). a síntese de ADN foi medida por ensaio de marcação com BrdU. F. Proteína (à esquerda) e os níveis de mRNA (direita) de ciclina D1 em PAR

2 células knockout foram medidos. *

p Art 0,05, ***

p Art 0,001 Todos os dados são apresentados como média ± SEM. N = 3-6. Todas as experiências foram repetidas pelo menos 3 vezes de forma independente.

De uma maneira geral, a activação do complexo ciclina /CDK podem causar a hiperfosforilação de pRb que leva a activação de transcrição E2F e ligar os genes alvo a jusante, tais como ciclina E. O ensaio de repórter de luciferase mostraram que a activação de PAR

2-AP de PAR

2 elevada actividade de transcrição E2F (Figura 2D), juntamente com uma elevação concomitante de expressão da ciclina E ARNm (Figura 2B). Estes resultados indicam que a activação de PAR

2 promoveu a proliferação celular por meio de sinalização E2F Ciclina D1 /.

Além disso, testou-se a Ciclina D1 desempenha um papel na PAR

2 auto-activação nas células HT29. O tratamento com o PIC ou inibidor de tripsina aboliu significativamente a sintese de ADN em células HT29 (Figura 2E). O nível de expressão de ciclina D1 em células

2 knockdown PAR também foi regulada negativamente em ambos os níveis de mRNA e proteína (Figura 2F). Estes achados sugerem que ciclina D1 mediada proliferação de células

2 induzida PAR.

PAR

2 Regula ciclina D1 Expressão em níveis: transcricional e pós-transcricional

Para entender o mecanismo pelo que PAR

activação 2 regula ciclina D1 expressão, usamos células A549 que não têm autócrina. Primeiro, as células A549 foram pré-tratadas com actinomicina D para inibir a transcrição. A inibição da transcrição completamente bloqueada PAR

2-induzida Ciclina D1 ao nível do ARNm (Figura 3A), mas não ao nível da proteína (Figura 3B). Por outro lado, knockdown de β-catenina, o que é um factor de transcrição essencial para a indução da ciclina D1, também bloqueou completamente a expressão de ciclina D1 mRNA (Figura 3C). Estas descobertas sugerem que β-catenina mediava a PAR upregulation

2-induzida de Ciclina D1 ao nível da transcrição. No entanto, knockdown de β-catenina apenas modestamente reduzida ciclina D1 ao nível da proteína (Figura 3D), indicando que ciclina D1 foi também regulada pelo PAR

2 ao nível pós-transcricional.

As células A549 foram pré-tratados com actinomicina D (2 ug /ml) 30 min antes do desafio com PAR

2-AP (50 uM) durante 24 h. os níveis de (A) de ARNm e de proteína (B) da ciclina D1 foi detectada por PCR em tempo real e Western Blot. siRNA alvejando beta-catenina foi transfectado em células A549 24 h antes do tratamento com PAR

2-AP. (C) ARNm e (D), os níveis de proteína de ciclina D1 foi detectada por PCR em tempo real e Western Blot, respectivamente.

tem sido relatado que a fosforilação da ciclina D1 está envolvida na sua degradação. No entanto, não houve mudança significativa na fosfo-ciclina D1 após PAR

2 de ativação (dados não mostrados).

MiRNAs Mediate PAR

2 induzida pela ciclina D1 Expressão

além de modificação de proteínas, microRNAs (miRNAs) estão emergindo como importantes reguladores da expressão gênica por clivagem mRNA alvo ou inibindo a sua tradução. Na verdade, várias microARNs tinha sido demonstrado para regular a expressão de ciclina D1 directamente [21]. Para determinar se miRNAs foram regulados pelo PAR

2, foram detectados os níveis de miR-15a, miR-16 e miR-34a no PAR

2 células knockdown e PAR

2 células ativadas. PCR em tempo real mostraram que o nível de miR-34a, mas não miR-15a e miR-16, foi drasticamente elevada em PAR

2 knockdown células HT29 (PAR

2-1 e PAR

2/2 ) em comparação com células de controlo mexidos ARN (RS) (Figura 4A). Além disso, PAR

2 activação diminuíram significativamente a expressão de miR-34a em células A549 (Figura 4B). Para testar se o miR-34a pode ser regulada por proteinases derivados de HT29, que privar células HT29 durante 3 h, 24 h e 48 h para acumular o PAR

2-activar proteases (tripsina e KLK14) em meio. PCR quantitativa mostrou que o nível de expressão de miR-34a foi regulada negativamente com o tempo (Figura 4C). Inibidor de miR-34a o que reduziu o nível de miR-34a (Figura 4D, painel superior) restaurou parcialmente a infra-regulação da ciclina D1 em células PAR

2 knockdown (Figura 4D, painel inferior). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que miR-34a mediada upregulation

2 induzida PAR de ciclina D1.

(A) RNA total de HT29, HT29 RS (mexidos RNA controle) e dois clones diferentes de estável células transfectantes com PAR

2 knockdown (PAR

2-1 e PAR

2-2) foram coletados. Os níveis de miARN alvejados foram medidos com PCR em tempo real. (B) As células A549 foram tratadas com PAR

2-AP durante 24 h. (C) Células HT29 foram incubadas com DMEM /F-12, meio sem FBS durante horário diferente, tal como indicado. (D) Transfecção de inibidor de miR-34a ou ARN de controlo (C-ARN) com Lipofectamin2000 em HT-29-RS ou HT-29-PAR-2. Três dias mais tarde as células foram recolhidas para o ensaio. Os níveis de miARN foram medidos com PCR em tempo real e normalizado com U6. *

P

0,05, **

P

0.01 Todos os dados são apresentados como média ± SEM. N = 3-6.

TGF-β Mediated PAR

2 relacionadas com a Expressão miRNA-34a

A próxima pergunta é como PAR

2 activação regula a expressão de miR-34a. O tratamento com o meio condicionado a partir de HT29, células de controlo (Ht-29-RS) reduziu significativamente o nível de expressão de miR-34a, que foi regulada positivamente por knockdown de PAR

2 em células HT29 (HT-29-PAR-2) (Figura 5A). Uma vez que o TGF-β tem sido relatado para reduzir a expressão de miR-34a recentemente (39), o papel de TGF-β na expressão relacionada miR34a PAR-2-foi testado. Em primeiro lugar, verificou-se que o TGF-β (5 ng /ml) foi capaz de diminuir a expressão de miR-34a tanto em PAR

células HT29 2-deficiente (HT-29-PAR2) (Figura 5B) e em células A549 (Figura 5C). Mais importante ainda, a depleção de TGF-β a partir do meio condicionado de HT-29-RS por anticorpo anti-TGF-p aboliu efeito inibitório de forma condicional na expressão de miR-34a (Figura 5D). Todos estes indicam fortemente que o TGF-β mediada a regulação de miR-34a induzida pelo par

2 activação.

(A) HT-29-RS ou PAR HT-29-2 As células foram tratadas com meio condicionado a partir de células HT-29-RS (cM-RS) durante 3 dias. células (B) HT-29-PAR-2 ​​foram tratadas com TGF-β (5 ng /ml) durante 12 horas. (C) As células A549 foram tratadas com TGF-β (5 ng /ml) durante 6 horas. (D) de forma condicional HT-29-RS (CM-RS) foi incubada com anticorpo anti-TGF β e proteína A /G agarose a 4 ° C durante 2 horas. Após centrifugação, o sobrenadante (CM-RS-anti-TGF β) foi utilizado para tratar células HT-29-PAR-2 ​​durante 3 dias. Após os diferentes tratamentos, como mencionado acima, as células foram recolhidas para o ensaio de miR-34a com PCR em tempo real. *

P

0,05, **

P

0.01 Todos os dados são apresentados como média ± SEM. N = 4-8.

Correlação do PAR

2, tripsinogênio, KLK14, ciclina D1 e miR-34a em amostras de câncer de cólon

Para obter insights sobre o papel biológico de PAR

2 de sinalização autócrina na carcinogênese colorretal humano, os níveis de PAR expressão

2 e suas proteinase ativando foram medidos em 30 emparelhado T3 humana de câncer colorretal amostras (CRC). Regular RT-PCR foi utilizado para detectar a expressão de ARNm de tripsinogénio e KLK14 em amostras de CRC e mostrou que quase todas as amostras expressam PAR

2-activação proteínase (Figura 6A). Setenta por cento (21/30) das amostras de CRC humanos mostraram expressão trypsinogen elevada em tecidos tumorais em comparação com os tecidos do cólon normais emparelhados, enquanto os tecidos normais mostrou quase nenhuma expressão trypsinogen. PCR em tempo real demonstraram que a PAR

2 foi amplamente expressa na mucosa normal e amostras de CRC primários. Tal como ilustrado na Figura 6B, PAR

2 foi encontrado para ser, em média, significativamente (

P

0,05) sobre-expresso em amostras de CRC com o grau mais elevado de desenvolvimento, enquanto que CyclinD1 e miR-34a não mostrou significante mudanças (Figura 6B). Curiosamente, os níveis mais elevados de PAR

2, ciclina D1 e menor nível de miR-34a foram significativamente correlacionados com metástases em linfonodos em amostras de CRC (Figura 6c). Tomados em conjunto, estes dados validados que o autócrina de PAR

2 e sua proteinase activação pode promover o desenvolvimento do tumor e invasão de câncer em amostras de CRC humanos.

(A) A expressão de tripsinogênio e KLK14 no CRC humana amostras de tumor (T) e tecido normal emparelhado (N) foi medida com PCR. Actina foi utilizado como um controlo interno. A expressão de ARNm de PAR

2, CCND1 e o nível de miR-34a em amostras de CRC humanos foram testados com PCR em tempo real. Eles foram comparados de acordo com (B) o grau ou (C) o estado de metástase ganglionar. Os dados são apresentados como a mudança dobra de amostra de tumor (T) para emparelhado tecido normal (N).

Discussão

Os microRNAs (miRNAs) são endogenamente expressa 17-25 nucleotídeos, não codificante RNAs e regulam a expressão do gene ao nível pós-transcricional. Desde o primeiro miARN, lin-4, foi descoberto em 1993 [22], [23], cerca de 1000 miARNs foram identificados em seres humanos [24] e pode ter como alvo mais de 30% de todos os genes e a maioria dos caminhos genéticos [25] , [26]. Na última década, têm surgido miARNs como reguladores críticos no cancro [27] e estão envolvidos no desenvolvimento de uma variedade de cancros, incluindo carcinoma colorrectal [28]. Crescentes evidências indicam que os miRNAs específicos estão correlacionados com o estágio da doença, metástases e sobrevivência no CRC. Até à data, há 118 miARNs todos os quais foram verificados e estão associados com o desenvolvimento de CRC [29]. Algumas das funções miRNAs como supressor de tumor, como let7a, miR-34 a /b /c, miR-126, miR-143, miR-145 e miR 200-família, enquanto alguns deles são pensados ​​para ser oncogénico, tais como o cluster miR-17-92, miR-21 e miR-135.

proliferação celular descontrolada é uma característica do câncer. Um número de miARNs foram identificados que regular o ciclo celular. Alguns dos miARNs promover a proliferação celular, tal como o miR-125b [30], sendo que alguns deles induzir a paragem do ciclo celular. Por exemplo, vamos-7 foi encontrado para ser um potente supressor de crescimento em células de cancro diferentes [31], [32]. Dois relacionada miARNs miR-143 e miR-145 foram encontrados para suprimir o crescimento, em parte, através de direccionamento ERK5 [33]. A trombina tem sido mostrado que estimula a proliferação de células através do aumento de miR-222 que pode inibir a expressão de p27 [34]. O presente estudo demonstrou que a serina proteinase activado PAR

2 e também foi capaz de afetar o nível de miRNAs, que funcionalmente mediada crescimento celular em células cancerosas (Figura 7).

Como um regulador chave do G1 /S checkpoint, ciclina D1 pode ser alvo de vários miRNAs. MiR-15a e miR-16 são frequentemente excluídos ou regulada para baixo e estes eventos correlacionam-se inversamente com a expressão de ciclina D1 em cancro. Outros estudos mostraram que a ciclina D1 é directamente regulada pela miR-15a e miR-16 [35]. Além disso, a expressão da ciclina D1 pode ser regulada por miR-200b e Let-7b por segmentação Rho GTPase família 3 (RND3) [36], [37]. No presente estudo, foram detectados miR-15a e miR-16. No entanto, não houve alteração significativa nos seus níveis de expressão após PAR

2 activação em células A549 (Figura 3F) ou após PAR

2 knowdown em células HT29. Além disso, não houve nenhuma alteração significativa do miR-200b e Let-7b (dados não mostrados), nem houve qualquer alteração consistente na expressão do gene alvo, RND3, como determinado por transferência de western e ensaio de repórter de luciferase com 3 ‘UTR de RND3 (dados não mostrados). Está implícito que o miR-15a, miR-16 e miR-200b não são os mediadores de PAR upregulation

2-induzida de ciclina D1.

miR-34a pertence à família de miR-34, que também inclui miR-34b e miR-34c. Os baixos níveis de miR-34 têm sido frequentemente observada em vários tumores, incluindo CRC [38]. Inactivação de endógena miR-34a estimula a proliferação celular e inibe a apoptose dependente de p53 através de segmentação ciclina E2, quinases ciclina-dependentes 4/6 (CDK4 /6) [38]. Este estudo demonstrou, pela primeira vez, que o miR-34a mediada a autócrina de PAR

2 e a sua proteinase activação, que é necessária para manter a proliferação de células de cancro do cólon.

A activação de ERK e de transactivação de EGFR foram mostrados para ser envolvido no efeito proliferativo de PAR

2 [7], [9]. No entanto, no presente estudo, nem o inibidor de ERK (PD98059 e U0126), nem o inibidor da tirosina-cinase EGFR (AG1478) foram capazes de bloquear a proliferação das células ou a alterações na expressão de miR-34a em HT29 e células A549 (não dados mostrando). É implícito que a regulação de miR-34a não era dependente da via de ERK EGFR e depois PAR

2 activação em células cancerosas.

Recentemente, tem sido relatado que a elevada actividade de TGF-β suprimiu a expressão de microRNA-34a no tecido do fígado [39]. Além disso, o PAR

2 activação tem sido demonstrada para aumentar a produção de TGF-p em ratos [40]. Portanto, não se surpreende que TGF medeia a supressão de miR-34a induzida por PAR

2 ativação no estudo atual. Além disso, a ativação constitutiva do PAR

2 devido ao autócrina de PAR

2 e sua proteinase activação pode contribuir parcialmente para o baixo nível de miR-34a, que é comum em vários tipos de câncer, como câncer de cólon.

Dados os papéis emergentes da PAR

2 em câncer, PAR

2 tornou-se alvo atraente para a terapia do cancro. PAR

2 foi amplamente expressa no cancro e positivamente correlacionada com a progressão tumoral em CRC. Mais importante ainda, PAR

2 foi activada por proteinases não só a partir do microambiente do cancro, mas também, tal como o nosso estudo mostra, por proteinases produzidos pelas próprias células cancerosas. Além disso, considerando a regulação do miRNA por PAR

2 de ativação que temos agora descrito, um efeito mais amplo sobre a proliferação será esperado após segmentação PAR

2 de ativação em células cancerosas. Com a melhoria da PAR

2 antagonistas atualmente em desenvolvimento, PAR

2 vai ser um bom alvo para a terapia do câncer no futuro.

Reconhecimentos

Agradecemos ao professor Nathalie Rivard,