Abstract

Purpose

PP2A é uma fosfatase de serina /treonina fundamental para os processos fisiológicos, incluindo a apoptose . peptídeos penetradores de células são moléculas que podem translocar em células sem causar dano membrana. Nosso objetivo foi desenvolver peptídeos de fusão de penetração de células especificamente concebidos para interromper a caspase-9 /interação PP2A e avaliar o seu potencial terapêutico

in vitro

e

in vivo

.

experimental design by

Geramos um peptídeo contendo uma sequência penetrante associada ao motivo interação entre caspase-9 humana e PP2A (DPT-C9h), a fim de orientar a sua associação. Utilizando linhas de células tumorais, células humanas primárias e primárias xenoenxertos de cancro da mama humano (BC), investigou-se a capacidade de DPT-C9h para provocar a apoptose in vitro e a inibição do crescimento do tumor (TGI)

In vivo

. DPT-C9h intraperitonealmente foi administrada em doses de 1 a 25 mg /kg /dia durante 5 semanas. foi calculada em relação tumor Volume (RTV).

Resultados

Nós demonstramos que DPT-C9h visar especificamente caspase-9 /interação PP2A

in vitro

e

in vivo

e induziu apoptose caspase-9-dependente em linhas celulares de cancro. DPT-C9h também induzida significativa TGI em modelos de xenoenxertos de BC. O péptido específico do rato DPT-C9 também induziu TGI em modelos de cancro da mama (PyMT) pulmão (modelo K-Ras) e. DPT-C9h tem um efeito específico sobre as células B transformadas isoladas a partir de pacientes com leucemia linfocítica crónica, sem qualquer efeito sobre as células saudáveis ​​primárias. Finalmente, foram observadas nem toxicidade, nem respostas imunogénicas.

Conclusão

Usando os péptidos de penetração de células bloqueando as interacções de caspase-9 /PP2A, nós demonstramos que DPT-C9h teve um efeito terapêutico forte

in vitro

e

in vivo

no mouse modelos de progressão do tumor

Citation:. Arrouss I, Nemati F, Roncal F, Wislez M, Dorgham K, Vallerand D, et ai. (2013) direcionamento específico de Caspase-9 /Interação PP2A como terapia potencial New Anti-Câncer. PLoS ONE 8 (4): e60816. doi: 10.1371 /journal.pone.0060816

editor: Ming Tan, University of South Alabama, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de outubro de 2012; Aceito: 03 de março de 2013; Publicação: 23 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Arrouss et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores agradecer ao Inserm e Institut Curie para o financiamento. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a apoptose é uma morte celular programada geneticamente e sua desregulamentação está associada, entre outras patologias, com câncer. Vários fosfatases tornaram-se recentemente alvos atraentes para o tratamento de uma variedade de doenças, incluindo cancros [1], [2], [3], [4]. No entanto, os únicos fármacos clínicos segmentação uma fosfatase são a ciclosporina immunosuppresssive A e FK506, que inibem a serina /treonina fosfatase 2B (calcineurina) e activação de NFAT [5], [6], [7], [8], [9]. Mas o uso a longo prazo destas drogas pode levar a efeitos colaterais indesejáveis ​​[10].

O Ser /Thr fosfatases PP1 e PP2A ter sido implicado tanto na indução da morte celular através de 1) a desfosforilação de Bad [11 ] e caspase-9 [12] 2) a estimulação do citocromo

C

libertação [13], e 3) a desfosforilação da proteína do retinoblastoma [14], [15]. No entanto, estes fosfatases controlar principalmente o nível de fosforilação de Bcl-2 e caspase-9, que determina as suas propriedades funcionais [16], [17], [18]. Por outro lado, a inibição da PP1 [19], a PP2A [20], ou PP2C [21] provoca a morte celular, indicando também uma potencial função anti-apoptótica destas fosfatases, e que aponta para uma interacção complexa de acções de fosfatase. Temos demonstrado anteriormente uma interação entre caspase-9 e PP1α. Neste complexo, PP1α activada induz a caspase-9 desfosforilação, e, como consequência, a sua activação conduz a apoptose [12]. Foi detectada neste complexo, para além PP1αactivity, outra actividade enzimática sensível ao ácido ocadaico compatível com uma actividade de PP2A, o que sugere uma possível interacção entre caspase-9 e PP2A que pode estar envolvido na regulação da morte celular.

peptídeos penetradores de células (CPP) são moléculas que podem translocar em células sem causar dano membrana, levando a sua utilização proposta como vectores para a entrega terapêutica de carga [22]. Estes péptidos podem atravessar a membrana e atingir o citoplasma e /ou núcleo [23]. Usando CPP, temos também relatado anteriormente evidência experimental como prova de princípio para a tecnologia fosfatase droga (DPT), [24], [25].

Sobre estas bases, decidimos analisar se a modulação da PP2A e caspase-9 interacção pode ter um impacto sobre a indução de deathing de células de tumor sem afectar as células saudáveis, e demonstrou DPT-C9h e DPT-C9 correspondente aos locais de ligação entre o ser humano e do rato de caspase-9 e PP2A, respectivamente, têm um anti específica -tumour efeito.

Materiais e Métodos

células e cultura

Daudi Humano, linhas de células Jurkat e HeLa foram cultivadas em RPMI suplementado com 10% de FCS. LKR10 e LKR13 foram previamente descritos [26] e foram cultivadas em meio RPMI suplementado com FCS a 10%. de cancro humano da mama (BC), melanoma uveal (UM), o cancro do pulmão de não-pequenas células, e células de cancro de pulmão de células pequenas linhas foram isoladas a partir de xenoenxertos de cancro humano primárias [27], [28], [29]. As três linhas de células da UM foram diretamente obtidos de pacientes “. linhas de células BC foram cultivadas em meio DMEM ou RPMI suplementado com 10% a 20% de FCS, excepto para HBCx-15, que foi suplementado com 10% de soro de cavalo. linhas celulares de cancro do pulmão e da UM foram cultivadas em RPMI suplementado com 10% ou 20% de FCS, respectivamente. As linhas celulares foram aC E UM isolado directamente a partir do tumor correspondente. As linhas de células Daudi, HeLa e Jurkat foram obtidos a partir da coleção do Departamento.

imunoprecipitação e western blot

A imunoprecipitação e western blot foram realizadas como descrito anteriormente [12]. Os anticorpos anti-caspase-9, e anti-PP2A foram adquiridos a partir de Santa Cruz, sinalização celular, Sigma ou Abcam. O anti-Tim 23 e anti cit c foram obtidos da Transduction Laboratories.

A síntese peptídica e a sequência

Os péptidos foram sintetizados como descrito anteriormente [30].

A detecção de apoptose por coloração Anexina

a apoptose foi detectada por coloração com anexina V-FITC de acordo com o protocolo do fabricante (BD Bioscience).

a caspase-9

actividade

a actividade da caspase-9 foi detectada utilizando o kit de caspase-9 Glo (Promega) e seguindo o protocolo do fabricante.

ensaio de imunossorvente ligado a enzima no soro (soro ELISA)

teste ELISA foi feito como descrito anteriormente [31], [ ,,,0],32].

membrana Miochondrial potencial ensaio

Para a detecção de alterações no potencial de membrana mitocondrial, foi utilizado o celular Medidor JC-10 kit de ensaio seguindo as recomendações da fabrica.

análise do ciclo celular

Um total de 1 × 10

6 as células foram fixadas em etanol a 70% durante 1 h a 4 ° C. As células foram centrifugadas e lavadas com tampão de coloração (DPBS /2% de FCS). Após lavagem, as células foram tratadas com 50 ul de ARNase (1 mg /ml) e incubou-se durante 30 min a 37 ° C. As células foram coradas com iodeto de 5 ug de propodim durante 30 min à temperatura ambiente. conteúdo de DNA celular foi analisada por FACS.

O isolamento da fração de mitocôndrias

Um total de 40 × 10

6 células foram lavadas com refrigerados PBS. sedimento celular foi ressuspenso em 5 volumes de tampão A arrefecido com gelo (20 mM de Hepes-KOH, pH 7,5, KCl 10 mM, MgCl 1,5 mM

2, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, DTT 1 mM, PMSF 0,1 mM , 250 mM de sacarose) suplementado com inibidores de protease. As células foram rompidas num homogeneizador Dounce, os núcleos foram centrifugadas (1000 x g, 10 min, 4 ° C), e o sobrenadante foi ainda centrifugado (10000 xg, 10 min, 4 ° C), sedimento mitocondrial foi ressuspenso em tampão A e armazenado a -80 ° C.

o isolamento de populações de células

o sangue fresco de doadores saudáveis ​​foi coletado pelo Etablissement Francais du Sang. amostras de leucemia linfocítica crónica (CLL) foram obtidos do Serviço de Hematologia do Hospital Pitié Salpêtrière. As células mononucleares do sangue periférico (CMSP) isoladas a partir de doentes ou dadores saudáveis ​​foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com FCS 10%, aminoácidos não essenciais a 1%, 1% de HEPES, 1% de piruvato de sódio e 1% de glutamina. As células B foram isolados utilizando o kit de isolamento negativo Dynal (Invitrogene). A pureza das células isoladas atingiu até 98%. linfócitos humanos isolados foram coradas com eventos de apoptose primeiros anti-hCD19-AP e foram determinados utilizando anexina-V-FITC.

In vivo

modelos de xenoenxertos de tumores humanos primários

obtiveram-se os xenotransplantes primários cancro da mama humano (BC) como descrito anteriormente [27], [28] mouse tumores de câncer de mama foram obtidos utilizando o transgênico

Polyoma Médio-T

modelo de rato PyMT [33]. Espontaneamente crescendo tumores mamários que ocorrem em ratinhos transgénicos foram xenoenxerto em

camundongos

nu imunodeficientes a permitir avaliações farmacológicas, e mantidos a partir de

ratinho nu para

nu rato passagens em série.

mouse de adenocarcinoma pulmonar primária mutado para

K-ras

O K-ras

camundongos LA1 foram fornecidos pelos modelos NCI mouse de cancros humanos Consortium (MMHCC) (NCI mouse Repository /NIH, Rockville, MD). Eles carregam uma latentes

K-ras

alelo com duas cópias do exão 1: Um deles foi o do tipo selvagem e outro mutante G12D (Tyler Jacks). O alelo latente é estocasticamente activada nas células através de recombinação homóloga, o que resulta na supressão da cópia de tipo selvagem de exão 1 e a expressão de uma forma oncogénica do gene da

K-ras

. adenocarcinomas do pulmão multifocais desenvolvem espontaneamente em 100% destes ratinhos.

ensaios terapêuticos

Para os ensaios terapêuticos experimentais subcutâneos em transplantado (xeno-enxertos de tumores humanos primários e tumores PyMT), de 5 a 8 semanas de idade nu Swiss /ratos fêmeas nu recebeu um enxerto subcutâneo de fragmentos do tumor com um volume de aproximadamente 15 milímetros

3 como descrito anteriormente [29].

Para ensaios experimentais terapêuticos em K ras-

camundongos LA1 , ratos velhos de 16 semanas foram aleatorizados entre o controlo (n = 17) ou grupo de tratamento (n = 16) durante 4 semanas. Os ratos foram pesados ​​uma vez por semana. No final do tratamento, autópsia foi realizado para os grupos de placebo, ou de tratamento e os tumores de pulmão foram contadas. Os resultados são expressos como o número de tumores /rato, média ± SEM.

Volume de

do tumor foi calculado pela medição de dois diâmetros perpendiculares com um calibre. Cada volume do tumor (V) foi calculada de acordo com as seguintes fórmulas: V = axb

2/2, onde a e b são os maiores e os menores diâmetros tumorais perpendiculares. o volume relativo do tumor (RTV) foi calculada a partir da seguinte fórmula: = RTV (Vx /V1), onde Vx representa o volume de tumor no dia X e V1 é o volume do tumor no início do tratamento (dia 1) foram obtidas curvas .Growth representando graficamente o volume médio do RTV no eixo Y contra o tempo (eixo X, expresso em dias após o início do tratamento), a actividade anti-tumor foi avaliada de acordo com o crescimento do tumor de inibição (TGI), calculado de acordo com as seguintes fórmulas: por cento GI = 100 -. (RTVt /RTVC) x 100, onde a forma é RTVt RTV de ratinhos tratados e RTVC é o RTV médio dos controlos, tanto a um dado ponto de tempo, quando o efeito anti-tumor foi a mais adequada

DTP peptídeos C9h e DPT-C9 diluídos em água /glucose (1 a 25 mg /kg) foram dadas por via intraperitoneal route 5 a 7 dias por semana, de acordo com os modelos e os esquemas terapêuticos.

ensaios de bioluminescência

linha celular HBCx-12A foi estabelecida a partir do xenoenxerto HBCx-12A e mantidas em meio RPMI, suplementado com 20% de soro de vitela fetal e penicilina /estreptomicina. As células foram transduzidas com o lentiviral sobrenadante contendo luciferase [19] e DS-vermelho e um total de 1,9 × 10

6 células que expressam Ds-RED-Luc foram implantadas subcutaneamente no

camundongos

nus. tumor crescimento foi de medição com paquímetro e por imagem óptica.

imagem de bioluminescência foi realizada com o sistema IVIS imaging (IVIS100, Caliper Life Sciences, EUA). murganhos anestesiados foram injectados i.p. com luciferina a 150 mg /kg. o tempo de aquisição de imagem foi de 1 s a 1 min, dependendo do sinal de bioluminescência. A análise foi realizada utilizando V. software Imagem Viver 2,50 (Caliper Life Sciences).

Os testes estatísticos

Para

in vivo

análises «experiências, a significância estatística das diferenças observadas entre o indivíduo RTVs correspondente ao grupo de camundongos tratados eo grupo controle, em que 9-10 ratinhos por grupo foram incluídos, foram calculados pelo teste t de Student emparelhado [29]. Para K-ras

modelo de camundongos L1, usamos o teste de Mann Whithney

Peptídeos sequência

DPT-Sh1:. VKKKKIKREIKI

C9: YIETLDGILEQWARSEDL

C9h: YVETLDDIFEQWAHSEDL

DPT-C9h: VKKKKIKREIKI YVETLDDIFEQWAHSEDL

DPC-C9: VKKKKIKREIKI YIETLDGILEQWARSEDL

DPT-C9h Mut: VKKKKIKREIKI YVETLDDIFEQAAHSEDL

Todo o peptídeos foram solubilizados em água estéril.

a caixa de protocolo e animal experimental foram de acordo com as diretrizes institucionais, tal como proposto pela Comissão de Ética francês (Acordo B75-05-18, França). Sem o consentimento era necessário para este estudo. Todos cirurgia foi realizada sob anestesia geral zylazine /cetamina e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento

.

Todos os pacientes tinham dado previamente o seu consentimento informado para a pesquisa experimental sobre o tecido tumoral residual disponível após histopatológico e citogenética analisa. As amostras de CLL são restos tumorais e os pacientes deram o seu consentimento informado. Esta pesquisa não foi realizada fora do nosso país. As comissões de ética aprovar este procedimento.

Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito.

Resultados

DPT blocos de peptídeos -C9h a caspase-9 /interação PP2Ac em linhas celulares de cancro da mama

Temos previamente determinado o sítio de ligação do ser humano e do rato caspase-9 a PP2A (patente PCT-EP2010 /054134, web site: espacenet .com ou worlwide.espacenet.com, para a sequência peptídica, ver Materiais e Métodos) e associado este motivo interação a um traslado permeável de células [24], [25]. A fim de direccionar a /PP2Ac interacção de caspase-9, decidimos utilizar o péptido contendo a sequência patenteado penetrante publicado anteriormente associada ao local de interacção de rato (DPT-C9) ou humano (DPT-C9h) caspase-9. Como controlos, foram geradas a lançadeira DPT-SH1 sozinho, os péptidos C9 e C9h, que não continha o vaivém e o péptido DPT-C9h Mut, com uma mutação no caspase-9 /sequência de ligação da PP2A e que não se liga a PP2A (dados não apresentados).

foram primeiro interessado na confirmação de que o alvo específico do péptido DPT-C9h foi o complexo de caspase-9 /PP2A. Para esse fim, analisamos se o peptídeo humano DPT-C9h wasable para atingir o

in vivo

e

in vitro

caspase-9 interacção /PP2A. Para

In vivo

competição, os lisados ​​de células não tratadas HBCx-12A ou DPT-C9h-tratadas de controlo foram imunoprecipitados com anticorpo anti-caspase-9 anticorpo e a presença do complexo /PP2A caspase-9 foi analisada por? Western blot? . A Figura 1A mostra que a quantidade de complexo detectado em células-C9h tratados com DPT foi fortemente reduzida em comparação com células de controlo não-tratados. Para o

In vitro

ensaio de competição, os lisados ​​de células HBCx-8 foram imunoprecipitados com um anticorpo anti-caspase-9 e a interacção com PP2A competido com o péptido DPT-C9h (Fig 1A). PP2Ac foi detectado no controle caspase-9 imunoprecipitados, enquanto era quase indetectável após a competição com 1,5 mM de péptido DPT-C9h. Em ambos, (

in vitro

e

in vivo

competições), complexo de caspase-9 /PP2A não foi alterada pela shuttle DPT-Sh1 (Figura 1B). Isto sugere fortemente que o peptídeo DPT-C9h visa especificamente a interacção entre a caspase-9 humana e PP2Ac.

A)

In vivo

competição de caspase-9 /PP2Ainteraction. A linha celular de cancro da mama HBCx-12A foi cultivada durante 24 h na presença ou ausência (controlo) de DPT-C9h (100 uM); As células foram lisadas e os extractos citoplasmáticos imunoprecipitados com anticorpo anti-caspase-9 e imunomarcados com anti-PP2Ac e anti-caspase-9 anticorpos.

In vitro

competição do /interação PP2A caspase-9. Os lisados ​​de células citoplasmáticos HBCx-12A foram imunoprecipitados com anticorpo anti-caspase-9; a caspase-9 /PP2Ac interacção foi competiu

In vitro

com 1,5 mM de péptido DPT-C9h durante 30 min à temperatura ambiente; imunoprecipitados foram lavadas e coradas imunologicamente com anti-PP2Ac e anti-caspase-9, esta última como controlo interno da carga de proteína. B) A linha de células HBCx-12A foi cultivada na presença ou na ausência (controle) do shuttle DPT-Sh1 (100 M) durante 24 h e o

in vitro

e

in vivo

competição de caspase-9 interacção /PP2A foi analisada como descrito acima.

os peptídeos penetrantes DPT-C9 e DPT-C9h induzir a espécie-específico apoptose

foi analisada a capacidade do dois péptidos que penetram os péptidos de controlo negativo C9, C9h e DPT-SH1 DPT-C9h e DPT-C9, bem como para induzir apoptose. Como mostrado na Figura 2A, DPT-C9h apoptose induzida, tal como detectado por coloração com anexina-V em linhas de células humanas de Daudi, Jurkat e HeLa sobre 20 h de tratamento, ao passo que os péptidos C9 e C9h sem de transporte e o transporte para o sozinho, não fez induzir a apoptose em linhas celulares humanas. Da mesma forma, o péptido de DPT-C9h não têm qualquer efeito apoptótico em linhas celulares de cancro de pulmão de rato LKR10 e LKR13, enquanto que o péptido de DPT-C9, específico para o rato de caspase-9, induzida apoptose em ambas as linhas celulares após 24 horas de tratamento ( Fig 2B). Além disso, não observamos qualquer efeito apoptótica após tratamento de linhas celulares com o serviço de transporte (Fig 2B). O nível basal de apoptose em células de controlo não-tratado é também mostrada. Estes resultados suportam fortemente a especificidade das espécies de ambos os peptídeos DPT-C9 e DPT-C9h.

) linhas de células Daudi, Jurkat e HeLa A foram cultivadas na presença de DPT-C9h, DPT-Sh1, C9h, ou péptidos C9 durante 20 h a 100 uM e a apoptose foi estimada por coloração com anexina-V. B) As linhas celulares de cancro de pulmão do rato LKR10 LKR13 e foram cultivadas na presença de DPT-C9h, DPT-C9, ou DPT-Sh1 a 100 uM. Após 24 h de incubação, a apoptose foi estimada por coloração com anexina. O nível basal de apoptose de células não tratadas de controlo é mostrado. Os valores de P são também mostradas (* 0,05; ** 0,001; *** 0,0001). linhas celulares c) da mama, melanoma uveal e cancro do pulmão isoladas a partir xenografs humanas primárias foram cultivadas na presença ou ausência de péptido DPT-C9h (100 uM) durante 24 h e a apoptose foi estimada por anexina V-FITC. nível basal de apoptose sem adição de péptidos é mostrado (cor cinza) valores de p são mostrados. D). As linhas celulares do cancro da mama derivadas de xenoenxertos humanos, primários foram incubados com C9h em meio de cultura a 150 uM e a indução de apoptose foi estimada em momentos diferentes. E) linhas celulares de cancro da mama isolados a partir de xenoenxertos humanos primários BCx-3 e BCX-12 foram cultivadas na presença ou ausência (controlo) do péptido DPT-C9h durante 24 h e a apoptose foi estimada.

Usando as linhas de células da mama humano, melanoma uveal, pulmão de não pequenas células e cancro do pulmão de pequenas células obtidas a partir de modelos de xenoenxerto humanos primários, testou-se o efeito apoptótico de ambos os péptidos DPT-C9h e C9h. A apoptose também foi analisada em linhas celulares de cancro da mama comerciais. Em todas as linhas celulares analisadas, DPT-C9h apoptose induzida, variando de 20 a 75% sobre 24 h de cultivo (Figura 2C), enquanto foi observado nenhum efeito após o tratamento C9h de linhas celulares de cancro da mama (Figura 2D). A apoptose das células não tratadas de controlo variou de 3 a 8%. adição suplementar de DPT-C9h péptido 27h após o tratamento inicial aumentou significativamente o nível de apoptose (dados não apresentados). A Figura 2E mostra duas parcelas apoptose histogramme representativos de duas linhas de células isoladas a partir do xenoenxerto do cancro da mama humano modelos HBCx-12A HBCx-3 e tratados 24 h com ou sem (controlo) péptido DPT-C9h. Tomados em conjunto, estes resultados mostram uma forte

in vitro

efeito anti-tumoral do peptídeo DPT-C9h em várias linhas de células humanas.

A inibição da atividade blocos caspase efeito apoptótica de DPT-C9h

Dado que a caspase-9 iniciadora é um mediador importante da apoptose, foi analisada a capacidade de DPT-C9h para activar caspase-9 na linha celular de cancro da mama humano HBCx5. As células foram incubadas com o péptido e a actividade da caspase-9 foi estimada em momentos diferentes. Temos observado um aumento de caspase-9 atividade no DPT-C9h linha de células tratadas (Fig 3A). Foram obtidos resultados semelhantes utilizando linhagens de células de melanoma uveal e cancro do pulmão de não pequenas células (dados não apresentados). Além disso, utilizando o inibidor de caspase Z-VAD, observou-se uma diminuição da caspase-9 atividade.

) HBCx-3 células

A foram cultivadas por 3 ou 6 h com meio (controle), 100 M de DTP C9h ou 10 uM do inibidor de caspases Z-VAD (pré incubação de 1 h) e 100 uM de DPT-C9h. A caspase-9 foi estimada a actividade utilizando um substrato luminogenic. Os resultados são representados em relação às células de controlo não tratadas como unidades arbitrárias. Os valores de P são mostrados. B) HBCx-3 células foram cultivadas durante 24 h com meio (controlo), DPT-Sh1 (100 uM), DPT-C9h (100 uM) ou Z-VAD (10 uM, pré incubação de 1 h) e DPT-C9h ( 100 uM). A apoptose foi estimado através da ligação de anexina V-FITC. células C) HBCx-3 foram tratadas durante diferentes períodos de tempo com DPT-C9h (100 uM) e, em seguida, incubadas durante 30 min a 37 ° C protegido da luz com a sonda de fluorescência de JC-10. fluorescência verde e vermelho foram medidos. Os dados estão representados em relação às células não tratadas de controlo. Os valores de P são mostrados. D) HBCx-12A e células HBCx-3 linhas foram tratadas durante 24 h com 100 | iM de DPT-C9 h. fração mitocondrial foi separado a partir de lisados ​​de células inteiras e imunologicamente para citocromo

c

. A WB também foi hibridizada com o marcador mitocondrial Tim23 como controle interno de carga de proteína. E) células HBCx-3 foram não tratados (controlo) ou tratados com 10 ou 25? M de DPT-C9h durante 24 ou 48 horas e o ciclo celular foi analisada por FACS.

Para determinar se activado de caspase-9 está envolvido no processo apoptótico de DPT-C9h, analisamos o efeito do inibidor de caspases Z-VAD na apoptose de células detectadas através da ligação de anexina V-FITC. Como mostrado na Fig 3B, o inibidor de caspase reduz marcadamente a apoptose induzida pelo péptido. O tratamento das células com o ônibus ou o inibidor só não induz a apoptose (Fig 3B).

DPT-C9h induz a despolarização da membrana mitocondrial e citocromo

liberação c

sem afetar ciclo celular

a fim de caracterizar a apoptose induzida por DPT-C9h, investigamos o envolvimento da mitocôndria. Em um ensaio baseado em fluorescência, a exposição de células HBCx-5 ao péptido induziu uma acentuada diminuição do potencial de membrana mitocondrial (Fig 3C). Para confirmar o papel da mitocôndria na apoptose induzida por DPT-C9h, analisamos se o tratamento DPT-C9h induzida citocromo

c

release. Usando proteínas mitocondriais de controlo não tratadas ou células tratadas com peptídeos, foi observada a liberação de citocromo

c

da mitocôndria em DPT-C9h células tratadas enquanto que em não-tratados células controle, citocromo

c

é retida na fracção mitocondrial (Fig 3D). A proporção de citocromo

c

/Tim 23 é utilizado como controle interno para a normalização e quantificação da quantidade de liberado Cit

c.

Estes resultados confirmam a implicação mitocondrial na apoptose induzida por DPT-C9h .

por fim, analisamos se peptídeo DPT-C9h poderia interferir na sequência do ciclo celular. As células foram não tratados (controlo), ou tratados com doses diferentes de péptido para diferentes períodos de tempo e a distribuição do ciclo celular foi analisada (Fig 3E). Usando

In vitro

sub-apoptótica dose de péptido, que mostrou que DPT-C9h não induziu acumulação de células tumorais em qualquer fase do ciclo celular, qualquer que seja a concentração utilizada e do tempo analisados ​​(Figura 3E).

DPT-C9h tem efeito sobre as células tumorais, mas não em células saudáveis ​​

leucemia linfocítica crónica (LLC) é caracterizada pela acumulação de células B CD5 + monoclonal de órgãos hematopoiéticos, o que reflecte um defeito na apoptose. A fim de avaliar o efeito apoptótico de péptido DPT-C9h em células saudáveis ​​e de tumores primários de origem semelhante, utilizou-se células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de dadores saudáveis ​​e de pacientes com leucemia linfocítica crónica (LLC). As PBMC de dadores saudáveis ​​ou de pacientes de CLL foram tratadas durante 3 h com o péptido DPT-C9h, lavadas, ressuspensas em meio completo sem péptido durante 6 horas e, em seguida, analisadas por apoptose. Figura 4A mostra que DPT-C9h tem um efeito apoptótico em células B de pacientes com LLC, mas não em células B a partir de dadores saudáveis ​​em relação às células de controlo não tratadas. DPT-C9h não tem efeito sobre T, NK e monócitos a partir de dadores saudáveis ​​ou de pacientes de CLL. O serviço de transporte péptidos C9h DPT-Sh1 ou sozinho não teve qualquer efeito (dados não mostrados). Finalmente, foi observado um efeito pró-apoptótico semelhante de péptido DPT-C9h quando as células B foram isoladas a partir de medula óssea de pacientes com LLC (Fig 4B). Este resultado sugere fortemente que as células tumorais única B são afectadas pelo tratamento de DPT-C9h sem qualquer efeito sobre as células de dadores saudáveis, reforçando o efeito tumoral específico de DPT-C9h.

A) As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) a partir de dadores saudáveis ​​ou de pacientes com LLC foram cultivadas na presença de DPT-C9h (150 uM) durante 3 h, depois lavou-se, transferidos para completar 6H médio e a apoptose foi estimada mais tarde. A selecção de células B foi feita por anticorpo anti-CD19 antes da coloração de anexina V-FITC. As células não tratadas foram usadas como controle. B) As células isoladas a partir da medula óssea de doentes com CLL e dadores saudáveis ​​foram tratados como em A e analisado para a apoptose. Os valores de P são mostrados.

Falta de atividade imunogênica e

in vivo

toxicidade de peptídeos DPT-C9h e DPT-C9

Tendo em conta que o nosso interesse final é provar um efeito anti-tumoral de DPT-C9h em cancros humanos, decidimos analisar o

in vivo

actividade imunogénica do péptido.

ratinhos de células T

imunodeficientes nus foram tratados cinco dias por semana durante 6 semanas por injecções intraperitoneais de DPT-C9h. Os soros foram recolhidos em diferentes vezes e analisou-se a produção de anticorpos dirigidos contra DPT-C9h ou DPT-Sh1. Utilizando o teste ELISA, nós não detectar qualquer dos anticorpos contra DPT-C9h ou DPT-Sh1 todo o cinética analisadas em duas doses diferentes de peptídeo (Fig 5A). Do mesmo modo, a resposta de anticorpos foi também analisada utilizando ratinhos imunocompetentes, de novo mostrando a falta de produção de anticorpos contra nem DPT-C9h nem peptídeos DPT-SH1 (Fig 5B). Este resultado sugere fortemente que o peptídeo DPT-C9h �imunog�ica mesmo após prolongada

in vivo

administração em modelos imunocompetentes ou rato immunodefficient.

anticorpos A) de soro tomado de ratos nus tratados por diferentes períodos de tempo foram detectados por ELISA em duas concentrações diferentes de péptido DPT-C9h (10 e 50? M). anticorpos B) de soro de ratinhos de tipo selvagem tratados durante diferentes períodos de tempo foram testados por ELISA contra DPT-C9h e DPT-Sh1 (50 uM). C) DPT-C9h foi administrada por via intraperitoneal em ratinhos portadores de tumores HBCx-12A em 1, 5, ou 25 mg /kg uma vez por dia durante 5 semanas; a mediana do peso dos ratinhos para cada grupo experimental está representado em diferentes tempos. Um total de 10 ratinhos foram incluídos por grupo. Da mesma forma, DPT-C9h foi administrada por via intraperitoneal em ratos portadores de tumores HBCx-8 a 10 mg /kg duas vezes por dia durante 4 semanas. DPT-C9 foi administrado IP em ratinhos modelo modelo PyMT na dose de 5 mg /kg. O peso médio dos ratinhos para cada grupo experimental está representado em diferentes tempos. Dez ratos foram incluídos por grupo.

Antes de

in vivo

avaliação terapêutica, a toxicidade do DPT-C9h foi avaliada em camundongos com tumores HBCx-8 e HBCx-12A após vários horários de administração, isto é, injecções intraperitoneais em 1, 5, ou 25 mg /kg uma vez por dia, ou 10 mg /kg duas vezes por dia, durante 4 a 5 semanas. Seja qual for a dose, não observamos quaisquer efeitos secundários em todos os ratinhos tratados, assim como uma estabilidade do peso total dos ratinhos tratados (Figura 5C). Além disso, não se observou qualquer morte em todo o experimento. Finalmente, para confirmar a ausência de toxicidade do péptido específico do rato, avaliou-se a tolerância do péptido DPT-C9 administrada a 5 mg /kg uma vez por dia no transgénico

Polioma Médio-T

Ratos PyMT (Figura 5C) . Em todos os experimentos, não foram observados efeitos colaterais, incluindo perda de peso.

DPT-C9h e DPT-C9 induzir

in vivo

crescimento do tumor inibição em modelos de pulmão e câncer de mama

Para confirmar primeiro o

in vivo

indução da espécie-específica apoptose, foi avaliada a eficácia do peptídeo DPT-C9 na ras K-

modelo LA1 adenocarcinoma do mouse e, em transgênico

Polyoma Médio

Mice -T (PyMT). Administrada por via intraperitoneal na dose de 5 mg /kg durante 5 dias /7, durante 4 semanas, DTC-C9 induziu uma redução significativa da carga de tumor de pulmão, como o número de tumores por ratinho foi de 24,6 ± 2,8 (média ± SEM) no grupo placebo em comparação com 15,4 ± 1,9 no grupo tratado (p = 0,01) (Figura 6A). Figura 6B mostra a análise histológica do tecido pulmonar de ratos controle e representativos tratados com DPT-C9h. Além disso,

ratinhos nus portadores de tumores da mama de rato PyMT xenoenxertados foram tratados por via intraperitoneal com o péptido específico de DPT-C9-rato numa dose diária de 5 mg /kg. Apesar de um crescimento tumoral rápido muito espontaneamente, DPT-C9 induziu uma TGI significativo de 46% (p 0,03) (Figura 6C). O volume relativo do tumor (RTV) foram calculados como descrito em detalhe em Materiais e Métodos.

A) O péptido DPT-C9 foi administrado IP com 5 mg /kg uma vez por dia, 5 dias por semana durante 4 semanas nas o

LA1 modelo de rato de adenocarcinoma do K-Ras, mostrando uma redução significativa da carga de tumor de pulmão em comparação com a formulação de controlar ratinhos tratados com veículo (p = 0,01). B) A análise histológica de tumores pulmonares de controlo tratados apenas com o veículo e ratos tenha sido tratada com a formulação de DPT-C9. C) DPT-C9 foi administrado IP como para a K-Ras

modelo LA1 em ratinhos portadores de tumores mamários de rato PyMT xenoenxertados, com uma TGI significativa de 46% após 11 dias de tratamento, em comparação com ratinhos de controlo tratados com o veículo de formulação.