Abstract

A linha de células FET, derivada de um carcinoma do cólon cedo palco, é não-tumorigénica em ratinhos nus atímicos. células FET engenharia que expressam TGF-α (FETα) visor constitutivamente EGFR sinalização /ErbB ativa. Estas células prontamente formado tumores de xenoenxerto em ratinhos nus atímicos. Importante, as células FETα retiveram a sua resposta à inibição do crescimento de TGF-mediada por beta, e, tal como as células FET parentais, a expressão de um receptor negativo dominante tipo TGF-beta II (DNRII) em células FETα (FETα /DNRII) anulou a capacidade de resposta a TGF inibição do crescimento e apoptose beta-induzida sob condições de estresse

in vitro

e aumento do potencial metastático em um modelo ortotópico

in vivo

, o que indica actividade supressora de metástases da sinalização TGF-beta neste modelo. angiogênese do câncer é amplamente considerado como um atributo essencial para a formação e progressão tumoral. Aqui, mostramos que a sinalização de TGF-beta inibe a expressão de crescimento endotelial vascular, factor de A (VEGFA) e que a perda de autócrina do TGF-beta em células /DNRII FETα resultou num aumento da expressão de VEGFA. Regulação da expressão VEGFA por TGF-beta não está ao nível da transcrição, mas ao nível pós-transcricional. Os nossos resultados indicam que o TGF-beta diminui a estabilidade da proteína VEGFA através de ubiquitinação e degradação num PKA- e Smad3-dependente e independente de Smad2-via. Imuno-histoquímica (IHC) As análises dos tumores ortotópicos foi significativamente menor, a sinalização TGF-beta, o aumento da CD31 e coloração VEGFA em tumores de células FETα /DNRII, em comparação com as de células de controlo do vector. Estes resultados indicam que a inibição da sinalização de TGF-beta e aumenta a expressão VEGFA angiogénese, que poderiam potencialmente contribuir para a metástase aumentada dessas células in

in vivo

. estudos de IHC realizados em amostras de adenocarcinoma de cólon humano mostrou que a sinalização TGF-beta é inversamente correlacionada com a expressão VEGFA, indicando que a supressão TGF-beta-mediada de expressão VEGFA existe em pacientes com câncer de cólon

Citation:. Geng L, Chaudhuri a, Talmon G, Wisecarver JL, Wang J (2013) Angiogenesis TGF-Beta Suprime VEGFA-Mediated no cancro do cólon metástase. PLoS ONE 8 (3): e59918. doi: 10.1371 /journal.pone.0059918

editor: Lu-Zhe Sun, da Universidade do Texas Health Science Center, Estados Unidos da América

Recebido: 14 Dezembro, 2012; Aceito: 20 de fevereiro de 2013; Publicação: 25 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Geng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede P20RR018759 e R01CA140988-01 (https://projectreporter.nih.gov/project_info_description.cfm?aid=8215881 icde=14708223 ddparam= ddvalue= ddsub= cr=1 csb=default cs=ASC) para JW. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

factor de crescimento transformante beta (TGF-beta) compreende um grupo de polipeptidos multifuncionais que regulam diversos processos celulares, incluindo a proliferação celular, apoptose, diferenciação, migração, tumorigenecity e metástase, através da ligação a receptores de TGF-beta. Muitos estudos indicam que a sinalização TGF-beta actua como seja um promotor de tumor ou um supressor de tumor. A função do promotor do tumor de TGF-beta tem sido associada com a sua capacidade para induzir uma epitelial para mesenquimal (EMT), que confere resistência aos efeitos apoptóticos de TGF-beta [1] – [3]. No entanto, nós e outros demonstraram experimentalmente que a TGF-beta medeia a actividade supressora do tumor numa variedade de cancros, incluindo cancro do cólon, e que a perda de sinalização de TGF-beta leva a aquisição e progressão da malignidade [4] – [11]. Os nossos estudos recentes demonstram que a sinalização de TGF-beta suprime a metástase em um subconjunto de células do cancro do cólon num modelo ortotópico

In vivo

[12]. Portanto, para identificar o mecanismo (s) pelo qual a TGF-beta provoca a sua função supressora de metástase é crucial para a nossa compreensão da progressão tumoral e para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas eficazes.

A angiogénese é um determinante importante da progressão do tumor. Os tumores sólidos não podem crescer para além de um certo tamanho sem suprimento vascular suficiente para proporcionar suficiente oxigénio e nutrientes. A via de VEGF /VEGFR é um mediador chave da angiogénese [13] e VEGFA actua como um potente factor angiogénico tumoral [14]. VEGFA estimula o crescimento de novos vasos sanguíneos, que fornecem tumores com oxigénio e nutrientes necessários [14], [15]. Expressão de VEGFA tem sido mostrado para ser regulada a transcrição e tradução níveis [16] – [19]. Regulação da expressão VEGFA pela sinalização TGF-beta não tem sido muito bem estudada. Tem sido relatado que o TGF-beta induz a secreção de VEGF em células citotrofoblasto humanos [20]. Pelo contrário, um outro grupo mostrou que oligonucleótidos anti-TGF-beta aumenta a expressão VEGFA em queratinócitos humanos e de fibroblastos da pele

in vitro

[21]. Portanto, o TGF-beta pode regular diferencialmente VEGFA expressão dependente de contexto celular.

A linha de células de carcinoma do cólon FET, o qual foi isolado a partir de uma fase precoce do cancro bem diferenciado, retém a actividade de TGF-beta autócrino. Estas células formam um pequeno nódulo tumor no local da inoculação em pequenos ratos nús atímicos, que não crescem progressivamente e, em seguida, regressa ao longo de 3-5 semanas [5], [22]. A capacidade destas células de carcinoma do cólon derivado para gerar um crescimento tumoral progressivo

In vivo

sugere que, em relação às linhas de células de modelo mais progrediu, células FET reter muitos controlos normais de crescimento, incluindo a resposta inibidora de TGF-beta. Portanto, as células FET foram modificadas para expressar TGF-α (FETα), que activa a sinalização do EGFR constitutivamente /ErbB. Estas células (FETα) facilmente formado tumores de xenoenxerto em ratinhos nus [22]. No entanto, as células FETα mantido a sua resposta à inibição do crescimento TGF-beta-mediada e raramente metástase

in vivo

. A expressão de um receptor negativo dominante tipo II TGF-beta (DNRII) em células FETα, designado FETα /DNRII, anulou a capacidade de resposta à inibição do crescimento de TGF-beta induzida por apoptose e sob condições de tensão

In vitro

e aumentou significativamente metastático potencial em um modelo ortotópico

in vivo

[12]. Assim, parece que a perda de resposta a TGF-beta supressor de tumor é permissivo para o desenvolvimento de metástases por células FETα, o que fornece evidência em apoio da função supressora de metástases de sinalização de TGF-beta neste modelo celular. O estudo actual utiliza o FETα /vector e células do sistema modelo FETα /DNRII para testar a hipótese de que a sinalização de TGF-beta medeia a angiogénese através da regulação da expressão VEGFA, o que poderia contribuir para a função supressora de metástases de TGF-beta. Neste estudo, que relatam que em células de cancro do cólon, o TGF-beta inibe a expressão VEGFA ao nível pós-transcricional, provavelmente por diminuição da estabilidade da proteína VEGFA através de ubiquitinação e degradação. Este regulamento é Smad3-dependente e Smad2-independente. Os nossos dados também indicam que TGF-beta mediada por sub-regulação da expressão VEGFA é através de uma via mediada por PKA. Além disso, demonstra-se que a perda de autócrina do TGF-beta em células FETα /DNRII resulta no aumento da expressão de VEGFA, em comparação com as células de controlo, tanto

In vitro

e

in viv

O, sugerindo que um aspecto da actividade de TGF-beta autócrino no seu contexto metástase supressor reprime a angiogénese. Finalmente, estudos de IHC de secções de adenocarcinomas do cólon humano revelam que a sinalização de TGF-beta é inversamente correlacionada com a expressão VEGFA, indicando que a ligação entre a perda de actividade de TGF-beta e a expressão aumentada VEGFA também existe em pacientes com cancro do cólon.

Materiais e Métodos

Todos os experimentos envolvendo animais foram aprovados pela Universidade de Nebraska Medical Center cuidados Institucional animal e Uso Committee (IACUC #: 07-043-08-FC).

Linhas Celulares e reagentes

As células FETα /DNRII foram obtidos por transfecção de um receptor negativo dominante tipo II TGF-beta em células FETα, enquanto que as células de controlo FETα /vector foram geradas por transfecção de um plasmídeo de controlo. FETα /vector, FETα /DNRII, HCT116, RKO, C, CBS, GEO e células de carcinoma do FET cólon parentais [9] foram cultivadas a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO

2 em 5A de McCoy isento de soro médio (Sigma) suplementado com 5 ng /ml de factor de crescimento epidérmico, 20 ug /ml de insulina, e 4 ug /ml de transferrina, tal como descrito anteriormente [23]. Recombinante de TGF-beta 1 humana foi adquirida de R D Systems. Ciclo-heximida, e MG132 PYR41 foram adquiridos a Amresco, Sigma e CALBIOCHEM respectivamente.

Análise Western Blot

As células foram lisadas em tampão de lise NP40 (Tris-HCl a 50, pH 7,4, 150 mM de NaCl , 0,5% de NP-40, NaF 50 mM, navo 1 mM de

3, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, ditiotreitol 1 mM, 25 ug /ml de aprotinina, 25 ug /mL de inibidor de tripsina e 25 ug /ml de leupeptina) a 4 ° C e utilizado para análises de western blot, como descrito anteriormente [24], [25]. Em breve, a proteína total a partir de lisados ​​de células (30 a 60 ug) foi separada por SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose. As proteínas foram detectadas usando um sistema de quimioluminescência aumentada (Amersham Biosciences). Os anticorpos para as análises Western blot de VEGFA, Smad2 /3, pSMAD2 /3, de PKA e actina foram obtidos da Santa Cruz Biotechnology Inc, Abcam, Chemicon, Cell Signaling Technology e da Sigma, respectivamente.

Isolamento de ARN e RT- PCR

o ARN celular total a partir de células FET foram isolados utilizando Trizol reagente de isolamento de ARN total (Invitrogen), de acordo com as instruções do fabricante. Para RT-PCR, 2? G de ARN foi transcrito reverso com M-MLV de transcriptase reversa (Promega), utilizando um iniciador aleatório. Dois microlitros do produto de ADNc foi utilizada para amplificar VEGFA humano. As sequências dos iniciadores para VEGFA foram 5′-CGGATCAAACCTCACCAAGGCC-3 ‘(directo) e 5′-CTTTCTCCGCTCTGAGCAAGGC-3’ (inverso). Condições de amplificação foram os seguintes: um ciclo a 94 ° C durante 2 minutos seguido de 30 ciclos a 94 ° C durante 30 segundos, 60 ° C durante 30 segundos e 72 ° C durante 30 segundos. O gene da actina foi utilizada como um controlo interno.

Imunofluorescência Coloração

O FETα /vector e células /DNRII FETα foram cultivadas a 70-80% confluentes em lamelas de vidro. Eles foram lavadas com PBS e fixadas em metanol arrefecido em gelo durante 5 minutos. As células fixadas foram permeabilizadas com 0,1% de Tween 20 em PBS e bloqueadas durante a ligação não especifica com soro de cabra normal a 10% em PBS durante 30 minutos a 4 ° C. As células foram então incubadas com anticorpo anti-VEGFA primário (diluição 1:50, Santa Cruz Biotechnology) durante a noite a 4 ° C, seguido de incubação em horas a for1 escuro à temperatura ambiente com o anticorpo secundário conjugado com Dylight488-anti-IgG de coelho (1:400 diluição, Jackson ImmunoResearch Laboratories). As células coradas foram montados em hardset Vectashield médio com DAPI (Vector Labs) de montagem e fotografada usando um microscópio fluorescente.

Amostras de Tecido

formalina parafina fixado incorporados (FFPE) blocos de tecido dos tumores primários ratinhos portadores FETα /vector e células FETα /DNRII foram descritos anteriormente [2]. blocos FFPE de cólon humano normal removidos para outros fins que malignidade e aquelas contendo adenocarcinomas do cólon invasoras razões foram obtidos a partir de arquivos do Departamento de Patologia e Microbiologia da Universidade de Nebraska Medical Center (UNMC). As idades de todos os pacientes tinham entre 55 e 85 anos, com material proveniente de ambos os homens e mulheres. Os pacientes com câncer não receberam terapia anticâncer antes da remoção cirúrgica do tumor.

O estudo foi realizado com a aprovação do comitê de ética (Institutional Review Board) de UNMC. Tecido usado para o estudo foi obtida a partir de material em excesso que permanece no bloco de parafina após a emissão do diagnóstico patológico. O formulário de consentimento cirurgia usado em UNMC inclui uma disposição que permite o uso de excesso de material para fins de pesquisa. Cada formulário é arquivado no Departamento de Patologia e Microbiologia e foi revisto antes da experimentação. Portanto, o comitê de ética dispensou a necessidade de consentimento adicional por escrito dos participantes.

imuno-histoquímica (IHQ) Coloração

Quatro cortes de tecidos grossos mícron foram cortadas e desparafinados em histoclear durante 15 minutos e depois reidratadas a utilização de 100%, 95% e 70% de álcool graduado durante 5 minutos, respectivamente. recuperação antigênica para pSMAD2 foi realizada utilizando Novocastra, epitopo de recuperação Soluções em pH 6.0 (Leica). A incubação com o anticorpo primário anti-pSMAD2 (1:200 diluição, Millipore) seguida por Novolink Polímero (Leica) foi utilizado para detectar a fosforilação de Smad2. recuperação de antigénios para VEGFA e CD31 foi realizada utilizando um tampão de Tris-EDTA a pH 9,0. Para detectar VEGFA e expressão de CD31, anticorpo anti-VEGFA (diluição 1:50, Santa Cruz) e anticorpo anti-CD31 (diluição 1:100, Abcam) foram incubadas durante a noite a 4 ° C, seguido por incubação com um conjugado HRP de cabra anticorpo secundário anti-coelho (diluição 1:300, Jackson Laboratories) para VEGFA e com um polímero marcado com HRP anti-coelho (DAKO) para CD31. Para neutralizar a peroxidase endógena, Dako dupla endógena Enzima Block (DAKO) foi usada para VEGFA e CD31, enquanto Novocastra Peroxidase Block (Leica) foi usada para pSMAD2. As lâminas foram então desenvolvidos utilizando o kit de cromogénio DAB (Dako) seguido de contra-coloração com hematoxilina. As lâminas foram montadas com Permount (Fisher Scientific) e submetidos a exames microscópicos. densidade de coloração foi medido e quantificado com ImagePro mais 7,0 Software usando 20 × ou 40 × imagens.

Resultados

sinalização TGF-beta inibe a expressão VEGFA em células de cancro do cólon

Exame de expressão VEGFA num painel de células cancerígenas do cólon indicou que linhas de células com o tipo selvagem a TGF-beta RII (CBS, GEO e FET [7]) expressaram níveis mais baixos de VEGFA do que aqueles com mutante de TGF-beta RII (RKO, C, HCT116 [7]) (Fig. 1A, painel esquerdo), o que sugere uma relação inversa entre a sinalização de TGF-beta e expressão VEGFA. Re-expressão do tipo selvagem RII TGF-beta em HCT116, uma das linhas celulares com a TGF-beta mutante RII, levou a uma redução da expressão VEGFA (Fig. 1A, painel da direita). Para determinar directamente se a TGF-beta regula a expressão de sinalização negativamente VEGFA, células FET foram tratados com 4 ng /ml de TGF-beta. Como mostrado na Figura 1B, exógena de TGF-beta reduzida expressão VEGFA de uma maneira dependente do tempo, com uma redução significativa após 24 horas de tratamento a TGF-beta. SB525334, um potente inibidor do receptor de tipo I (RI) quinase TGF-beta, foi utilizada para confirmar o efeito de TGF-beta. O tratamento de células com SB525334 FET reverteu o efeito inibidor de TGF-beta na expressão do VEGFA (Fig. 1C). Para confirmar ainda mais o efeito supressor de TGF-beta na expressão VEGFA, um dominante negativo TGF-beta RII (DNRII) foi introduzido em células FETα para ab-rogar endógena sinalização de TGF-beta, que foi demonstrado por uma redução de Smad2 e fosforilação Smad3 (pSMAD2 pSmad3; A Fig. 1D, painel esquerdo). Por conseguinte, a expressão VEGFA foi significativamente aumentada em células DNRII, em comparação com as células de controlo do vector (Fig. 1D, painel esquerdo). imunofluorescência de VEGFA confirmou higer expressão de VEGFA em células FETα /DNRII do que em FETα células /vetor (Fig. 1D, painel da direita).

(A) Análise de Western blot de expressão VEGFA em diferentes linhas celulares de cancro do cólon e as células re-HCT116 que expressam TGF-beta RII. (B e C) células FET foram crescidas a 50% confluentes e tratou-se com 4 ng /ml de TGF-beta 1 para os períodos de tempo indicados (B) ou com 4 ng /ml de TGF-beta 1, na presença ou ausência de 200 nM SB525334 durante 48 horas (C). As análises de Western blot foram realizadas com um anticorpo anti-VEGFA para detectar a expressão VEGFA. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (D) Western blot (painel esquerdo) e imuno-coloração (painel direito) analisa de expressão VEGFA em FETα /vector e células /DNRII FETα. Fosforilação de Smad2 e Smad3 (pSMAD2 pSmad3) foi mostrado para indicar a ativação de Smad (painel esquerdo)

TGF-beta inibe a expressão VEGFA ao nível pós-transcricional

Para. determinar como a TGF-beta suprime a expressão VEGFA, a expressão de ARNm de VEGFA foi determinada em células de FET tratados com TGF-beta para diferentes períodos de tempo. Os resultados de RT-PCR demonstraram que os níveis de mRNA VEGFA permaneceram inalterados após tratamento de TGF-beta para até 48 horas (Fig. 2A, painel superior). Quantificação de repetidas experiências confirmaram as observações (Fig. 2A, painel inferior). Estes resultados indicam que o TGF-beta regula a expressão VEGFA ao nível pós-transcricional. Um dos possíveis mecanismos de regulação pós-transcricional é de que a estabilidade da proteína. Para determinar se a sinalização de TGF-beta regula a estabilidade da proteína de VEGFA, ciclo-heximida (CHX) foi adicionado às células FET para inibir a síntese de proteínas, enquanto que foram tratados com TGF-beta. Sob estas condições, os níveis de VEGFA diminuição mais rápida dos níveis de TGF-beta tratado com amostras do que em amostras de controlo (Fig. 2B, painel superior). Quantificação e normalização da intensidade das bandas VEGFA com a das bandas de actina correspondentes revelava claramente que o tratamento de TGF-beta reduzida a meia-vida da proteína VEGFA (Fig. 2B, painel inferior), indicando que a TGF-beta regula a estabilidade da proteína VEGFA . Para dissecar ainda mais o mecanismo subjacente, um inibidor de proteassoma, MG132, ou inibidor E1 da ubiquitina, PYR41, foi utilizado para tratar células FET em conjunto com o TGF-beta. Tal como mostrado na Figura 2C, tanto MG132 ou PYR41 impedido supressão de FTC-beta-mediada de expressão VEGFA. Estes resultados sugerem que a sinalização de TGF-beta diminui a estabilidade da proteína VEGFA através de ubiquitinação e degradação. FET células

(A) foram crescidas a 50% confluentes e tratou-se com 4 ng /ml de TGF-beta 1 para os períodos de tempo indicados. RT-PCR foi realizada como descrito em

Materiais e Métodos

(painel superior). A intensidade de cada banda de ARNm VEGFA foi quantificado e normalizado com que a banda de actina correspondente. Os valores são médias ± E.P. de experiências em triplicado (painel inferior). (B) análise por Western blot da expressão VEGFA foi realizada nos pontos de tempo indicados nas células FET tratados com 100 ug /ml de ciclo-heximida (CHX), isoladamente ou CHX e TGF-beta em conjunto (painel superior). A intensidade de cada banda VEGFA foi quantificado e normalizado com que a banda de actina correspondente (painel inferior). (C) análise de transferência de Western de expressão em células VEGFA FET tratados com TGF-beta sozinho, TGF-beta com MG132 (10 uM) ou TGF-beta com PYR41 (15 uM). (D) A expressão de Smad2 e Smad3 em células FET com controle do vetor vazio (CTR), Smad2 shRNA (Sh-S2) ou Smad3 shRNA (Sh-S3) foi mostrado no painel da esquerda. A fosforilação de Smad2 e Smad3 e expressão em células de VEGFA acima tratados com 4 ng /ml de TGF-beta foi mostrado no painel da direita. (E) A expressão de PKACatα em células FET com controle de vetor vazio (CTR) ou PKACatα shRNA (Sh-PKA) foi mostrado no painel da esquerda. VEGFA expressão em células acima tratados com 4 ng /ml de TGF-beta, por 48 horas, foi mostrado no painel da direita.

sinalização de TGF-beta é mediada predominantemente através da activação de Smad. No entanto, a sinalização de TGF-beta Smad-independente também tem sido relatada em diferentes tipos de células [23], [24]. Para determinar se a inibição de TGF-beta-mediada de expressão VEGFA é Smad-dependente ou independente de, Smad2 e Smad3 foram derrubados individualmente em células FET por shRNAs específico para Smad2 ou Smad3. Expressão de Smad2 ou Smad3 foi reduzido de forma eficiente e, especificamente, em células de Smad3 Smad2 ou knockdown (Fig. 2D, painel esquerdo). Como resultado, os aumentos em pSMAD2 pSmad3 ou após tratamento de TGF-beta foram abolidos em Smad2 ou Smad3 células knockdown, respectivamente (Fig. 2D, painel da direita). A análise por Western blot indicou que a inibição da expressão da proteína VEGFA por TGF-beta foi parcialmente revertida em células Smad3 knockdown Considerando knockdown de Smad2 teve pouco efeito (Fig. 2D, painel da direita). Estes resultados indicam que o TGF-beta suprime a expressão de VEGFA de um modo dependente e Smad3-Smad2-independente. A reversão parcial de supressão de FTC-beta-mediada de expressão em células VEGFA Smad3 knockdown pode ser atribuída ao silenciamento de expressão incompleta na Smad3 dessas células ou a existência de um mecanismo de Smad3-independente.

Como mostrado anteriormente, o TGF -beta XIAP regula a regulação negativa através de uma via mediada por PKA [25]. A seguir, determinado se a PKA está envolvido na regulação da expressão VEGFA por TGF-beta. A expressão de PKA subunidade α catalítica (PKACatα) foi derrubado por um shRNA específica em células FET (Fig. 2E, painel esquerdo). Como resultado, a inibição de TGF-beta-mediada de expressão VEGFA foi quase completamente revogada nessas células (Fig. 2E, painel da direita). Tomados em conjunto com a observação de que a activação de PKA é Smad3-dependente [25], estes resultados indicam que o TGF-beta /Smad3 sinalização /PKA regula a regulação negativa da expressão VEGFA em células cancerígenas do cólon.

sinalização de TGF-beta inibe VEGFA e suprime a expressão de angiogénese tumoral in vivo

VEGFA é um regulador chave da formação de vasos sanguíneos e desempenha um papel importante na angiogénese, o que contribui para o desenvolvimento e progressão do tumor. Nós mostramos anteriormente que a sinalização de TGF-beta inibe a expressão VEGFA (Fig. 1B). Uma vez que TGF-beta actua como um supressor de metástases em células de cancro do cólon [12], nós examinamos se a supressão da expressão VEGFA por TGF-beta contribui para a função de supressão de metástases de TGF-beta. Usamos FETα /vector e modelo de célula FETα /DNRII descrito anteriormente [12] para resolver esta questão. expressão VEGFA foi muito maior no FETα células /DNRII do que em células /vetor FETα

in vitro

devido à revogação da TGF-beta sinalização (Fig. 1D). Como mostrado anteriormente, as células FETα /DNRII mostraram um aumento significativamente potencial metastático, em comparação com células /vector FETα num modelo ortotópico

In vivo

[12]. secções tumor primário preparados a partir de cada ratinho transplantado ortotopicamente com FETα /vector ou células /DNRII FETα foram examinadas para a sinalização de TGF-beta. Desde FETα células expressam tanto Smad2 e Smad3 (dados não mostrados), a fosforilação de Smad2 foi usado como um indicador para o TGF-beta activo /Smad2 /3 sinalização. IHC análises utilizando um anticorpo anti-fosfo-Smad2 (anti-pSMAD2) mostraram que a fosforilação de Smad2 nuclear foi significativamente reduzida nos tumores primários de células FETα /DNRII quando comparadas com aquelas de células /vector FETα (Fig. 3A, painel esquerdo). Quantificação da densidade de coloração nuclear pSMAD2 em múltiplas amostras indicou que a sinalização de TGF-beta foi inibida nos tumores de células /DNRII FETα por cerca de 40% (Figura 3A, painel da direita, *

P

. 0,001) . Para determinar se a sinalização TGF-beta suprime a expressão VEGFA

in vivo

, examinamos a expressão VEGFA nos tumores primários, utilizando análises IHC. Os resultados mostraram que a expressão VEGFA foi muito maior nos tumores de células FETα /DNRII do que os das células de controlo (Fig. 3B, painel esquerdo). Quantificação da densidade de coloração VEGFA em múltiplas amostras indicaram que a expressão VEGFA foi aumentada em mais de duas vezes nestes tumores (Fig 3B, painel da direita, *

P

. 0,001), confirmando o papel de supressor TGF-beta na expressão VEGFA

in vivo

. Para determinar se a expressão VEGFA tem quaisquer consequências biológicas

in vivo

, nós próxima analisados ​​formação de microvasos dentro dos tumores utilizando um anticorpo anti-CD31. CD31 é um marcador de células endoteliais dos vasos sanguíneos. Nos tumores de células FETα /DNRII, densidade de microvasos foi mais do que três vezes mais elevada do que a observada nas amostras de controlo (Figura 3C, *

P

. 0,001). Estes resultados indicam que a inibição da sinalização de TGF-beta leva à expressão VEGFA elevada, o que contribui para o aumento da angiogénese. Tomados em conjunto com os resultados de aumento do potencial metastático de células /DNRII FETα no modelo ortotópico, os nossos estudos sugerem que a sinalização de TGF-beta suprime a progressão tumoral e angiogénese VEGFA-mediada.

Imagens representativas da coloração IHC de fosfo- Smad2 (a), VEGFA (B) e CD31 (C) em que os tumores primários do FETα /vector e células FETα /DNRII (painéis da esquerda). densidade de coloração foi medido e quantificado com ImagePro mais 7,0 Software usando 20 × ou 40 × imagens (painéis da direita). Quatro animais foram analisados ​​para cada tipo de células. Quinze a vinte campos histologicamente semelhantes foram selecionados aleatoriamente a partir de cada slide para análise da densidade de coloração. Os dados são apresentados como a média ± SE.

valores P

foram calculados utilizando Estudante de

t

-teste. *

P

. 0,001

A expressão de VEGFA correlaciona inversamente com TGF-beta sinalização em adenocarcinoma câncer de cólon humano

O acima

in vitro

e

in vivo

resultados demonstram que a TGF-beta regula negativamente a expressão VEGFA em linhas celulares de cancro do cólon humanos. A seguir, examinar se havia alguma correlação entre TGF-beta sinalização e expressão VEGFA em adenocarcinomas do cólon humano. Secções preparados a partir de 10 de cólon normal e 24 pacientes com câncer de cólon individuais foram examinados para ativos de sinalização TGF-beta e expressão VEGFA. Uma vez que Smad2 e Smad3 raramente são mutado no cancro do cólon [26], Smad2 fosforilação foi utilizado neste estudo para indicar a TGF-beta activo /sinalização Smad2 /3. de cólon humano normal apresentou coloração nuclear forte e distinto para a fosforilação de Smad2 e fraca coloração para VEGFA nas células epiteliais das criptas ao passo que as células epiteliais malignas nos casos de adenocarcinoma apresentada no mais fraca e difusa coloração para Smad2 fosforilação e coloração forte para VEGFA por análises de IHC ( A Fig. 4A). A Figura 4B mostra a quantificação da densidade de coloração de fosforilação Smad2 nuclear e expressão VEGFA de amostras de pacientes individuais. Em geral, as células epiteliais do cólon normais exibir maior fosforilação Smad2 nuclear e menor expressão VEGFA de adenocarcinomas, suportando a ideia de que a expressão de VEGFA inversamente correlacionada com TGF-beta sinalização em adenocarcinoma do cólon humano.

Secções preparados a partir de 10 de cólon normal e 24 amostras de pacientes com cancro do cólon individuais foram coradas utilizando anticorpos anti-fosfo-Smad2 e anti-VEGFA. (A) Imagens representativas de IHC coloração de fosfo-Smad2 e VEGFA em amostras de cólon e câncer de cólon normais. (B) densidade de coloração foi medido e quantificado com ImagePro mais 7.0 Software usando 40 × imagens em cada amostra. amostras de cólon normal são representados por quadrados e amostras de cancro do cólon por triângulos. As barras representam os valores médios de cada grupo de amostras.

valores P

foram calculados utilizando Estudante de

t

-teste. *

P

. 0,001

Discussão

sinalização TGF-beta foi mostrado para suprimir a formação de tumores e metástases em um subconjunto de células cancerígenas do cólon através de muitos mecanismos diferentes, incluindo inibição da proliferação celular e na indução da apoptose [4], [12], [25], [27]. A capacidade das células malignas para suportar tensões ambientais, particularmente aqueles associados com a metástase, é considerado um factor chave no desenvolvimento e progressão do tumor [28]. Uma vez que restrições ambientais sobre o crescimento é muito comum em tumores sólidos, tais como carcinoma do cólon, um mecanismo que permite o aumento da angiogénese para proporcionar nutrientes e oxigénio suficiente, seria altamente vantajoso para as células malignas e melhorar a sua capacidade de sobrevivência aberrante. VEGFA é um factor angiogénico potente que desempenha um papel essencial no cancro. As células tumorais segredo VEGFA para induzir a vasculatura a desenvolver, permitindo uma oferta suficiente de oxigênio e nutrientes [14]. Portanto, VEGFA poderia ser um alvo potencial para a terapia do cancro. Temos demonstrado anteriormente que a fuga da apoptose TGF-beta-mediada em células de cancro do cólon contribui para sua maior capacidade de sobrevivência e maior potencial metastático

in vivo

[12]. Mostramos aqui que, além de induzir a apoptose, a sinalização de TGF-beta podem também inibir a expressão de VEGFA e, como consequência, a angiogénese em células de cancro do cólon in

in vivo e que

revogação de TGF-beta possibilita o aumento da expressão VEGFA e a angiogénese, o que poderia facilitar o crescimento do tumor e o desenvolvimento de metástases. Além disso, uma relação inversa entre TGF-beta sinalização e expressão VEGFA também é observada em amostras de cancro do cólon humano, indicando a relevância de nossos estudos de câncer humano. Por conseguinte, o efeito inibidor de TGF-beta na expressão VEGFA angiogénese e fornece uma outra base mecanicista importante e inovador para a TGF-beta do tumor e metástases função supressora.

Embora a expressão de VEGFA pode ser regulada ao nível transcricional pela HIF1α [19], a sua regulação por TGF-beta é ao nível pós-transcricional (Fig. 2A). Os nossos resultados indicam que o tratamento de TGF-beta reduzida a estabilidade da proteína VEGFA através de ubiquitinação e degradação (Fig 2B . 2C). Além disso, a redução de TGF-beta na expressão mediada VEGFA ocorre através de um PKA- e Smad3-dependente e independente de Smad2-via (figura 2D . 2E). Tem sido demonstrado que a activação de PKA por TGF-beta, mas não envolve Smad3 Smad2 e que a activação de PKA promove a degradação da proteína através de ubiquitinação [25]. Portanto, é possível que a TGF-beta medeia a degradação VEGFA através da via Smad3 /PKA. Este é um novo mecanismo pelo qual a expressão de VEGFA é regulada pela sinalização de TGF-beta. Mais estudos serão necessários para determinar o mecanismo subjacente.

alta freqüência da mutação Smad4 e inativação está intimamente associada ao aumento das metástases e mau prognóstico no câncer de cólon [29], [30]. Embora o TGF-beta sinalização actua como um supressor tumoral em um subconjunto de células do cancro do cólon (ou seja FET, GEO e CBS, etc) que expressam o tipo selvagem Smad4 [4], [10], [11], Smad4-independente a TGF-beta sinalização tenha sido mostrado para promover metástases do cancro do cólon [31]. Tem sido relatado que o TGF-beta induz a expressão de VEGF em células de cancro do cólon Smad4-nulos [32], o que sugere que a activação de Smad4-independente vias (ou seja, MEK-Erk e p38-MAPK, etc), está envolvida na expressão de TGF-beta-mediada a sobre-regulação da expressão de VEGF, que pode cooperar com outras vias pró-oncogénicas para promover metástases. Portanto, o efeito oposto de TGF-beta na expressão VEGFA poderia contribuir para o seu papel como supressor de tumor diferencial ou promotor de tumores em células contexto diferente.

Em resumo, identificámos um novo mecanismo pelo qual suprime a TGF-beta expressão VEGFA, angiogénese e metástase em um subconjunto de células do cancro do cólon. Este estudo é significativo, uma vez que tem sido demonstrado que a expressão de VEGFA é aumentada no cancro do cólon e está associado com a localização da doença, fase e sobrevivência específica da doença a longo prazo [33].