Abstract

A hipoxia, ephrin-A1 e óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) têm provado desempenham papéis críticos na angiogénese tumoral. No entanto, como ephrin-A1 é regulado por hipóxia e se ephrin-A1 coopera com eNOS na modulação da angiogênese continuam por resolver em detalhes. Aqui demonstramos que tanto ephrin-A1 em células de carcinoma de células escamosas (SCC-9) e, especialmente, solúvel ephrin-A1 nos sobrenadantes foram regulados positivamente sob condição hipóxica. Uma produção de óxido nítrico aumentada (NO) em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) foi observada na angiogénese induzida por efrina-A1, que foi invertida após a co-cultura com eNOS inibidor específico, N-nitro-L-arginina cloridrato de éster metílico de (L -NOME). A análise Western blot confirmou que ambas a fosforilação da Akt

Ser473 e eNOS

Ser1177 foram regulados positivamente em células HUVEC efrina-A1-estimuladas, com o total de expressão de eNOS inalterada. O inibidor específico de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K), LY294002, significativamente regulada negativamente a expressão induzida por A1 efrina de Akt fosforilada

Ser473, bem como a fosforilação da eNOS

Ser1177. Estes resultados revelaram um possível novo mecanismo pelo qual ephrin-A1 é regulada no microambiente do tumor e promove a angiogênese através de um cross-talk coordenada com PI3K /Akt activação dependente de eNOS que podem dizer respeito ao desenvolvimento vascular normal e neovascularização do tumor.

citação: Canção Y, Zhao XP, Song K, Shang ZJ (2013) Ephrin-A1 é sobre-regulada por hipóxia em células cancerosas e promove a angiogênese de HUVECs através de um coordenado Cross-Talk com eNOS. PLoS ONE 8 (9): e74464. doi: 10.1371 /journal.pone.0074464

editor: Jung Weon Lee, da Universidade Nacional de Seul, República da Coreia

Recebido: 18 Janeiro, 2013; Aceito: 03 de agosto de 2013; Publicação: 09 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Song et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (No. 81172570 e No. 30.872.893). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Uma variedade de factores pró-angiogénicos e anti-angiogénicos participar no controlo da angiogénese, que desempenha um papel essencial no crescimento tumoral e metástase [1] – [3]. Efrina-A1 e o seu receptor primário, o EphA2, não são apenas expressos em vários tumores malignos, mas também desempenham um papel vital na neovascularização normal de angiogénese tumoral e [4]. A sobre-expressão de efrina-A1 em células tumorais pode promover o processo angiogénico, enquanto derrubar de efrina-A1 em células tumorais contribui significativamente para a redução da migração de células endoteliais induzida por tumor in vitro e in vivo densidade microvascular [5]. Nosso estudo anterior mostrou que sobre-expressos EphA2 pode contribuir para a angiogênese tumoral e têm valor prognóstico em carcinoma língua [6]. Há evidência experimental suficiente sugerindo que a activação do EphA2 em células endoteliais (ECs) é necessário para efrina-A1 para exercer os seus efeitos angiogénicos in vitro e in vivo [7]. No entanto, os factores de regulação e mecanismos pelos quais efrina-A1 /EphA2 promovem a angiogénese tumoral não foram bem esclarecida.

Tem sido relatado que vários factores de crescimento e citoquinas podem induzir a expressão de ligandos efrina, tais como necrose tumoral fator-α (TNF-α), interleucina-1β (IL-1β), et ai [8]. A hipoxia é uma das características mais comuns e importantes no microambiente tumoral, e contribui para a indução de vários factores angiogénicos [9]. Recentemente, HIF-1α, um factor de transcrição indutível por hipoxia, tem sido encontrado para sobre-regular receptores Eph e efrinas em pele de rato [10]. Nos cancros da cabeça e pescoço, o aumento da expressão ephrin-A1 foi associado com pO

2 em microambiente do tumor [11]. Embora efrina-A1 desempenha um papel crítico na angiogénese tumoral e parece estar envolvido em resposta a hipoxia, a maioria dos estudos anteriores têm-se centrado principalmente na efrina-A1 como uma proteína ligada à membrana. Para nosso conhecimento, há relativamente pouca evidência direta se a hipóxia pode induzir as células cancerosas para produzir ephrin-A1, especialmente a forma solúvel, ou não.

Os mecanismos subjacentes a angiogênese induzida por ephrin não foram totalmente compreendidos. Até agora, apenas algumas vias de sinalização, tais como MAP /ERK e PI3K [12], [13], foram encontrados para ser afetado por ephrin-A1. Além disso, a promoção, bem como a inibição da mesma via de sinalização por efrina-A1 foi observada em diferentes células ou tipos de cancro. é bem conhecido que eNOS e desempenham um papel crucial na migração de células endoteliais e angiogénese [14]. provas suficientes mostrou que eNOS é expressa predominantemente no tumor células endoteliais vasculares, e sua produção NO atua como molécula efectora direta em vários angiogênese do tumor angiogênico induzidas fatores-[15], [16]. Portanto, não é surpresa para supor que eNOS /NO também pode mediar a angiogênese do tumor induzida ephrin-A1. Infelizmente, nenhuma informação direta está disponível no cross-link entre ephrin-A1 e eNOS durante a modulação da angiogénese em células endoteliais até agora.

O presente estudo investigou os mecanismos subjacentes ephrin-A1 modulação da angiogénese através da análise do efeito de hipoxia na expressão efrina-A1 e a secreção em células tumorais e a possível associação de efrina-A1 com eNOS /nO na angiogénese tumoral. Os nossos dados confirmaram que tanto a expressão efrina-A1 e a secreção de efrina-A1 solúvel em células tumorais foram aumentadas sob estimulação hipóxia. A angiogénese induzida por efrina-A1 foi acompanhada com eNOS fosforilação e a produção de NO, que foi bloqueada por L-NAME. Estudos posteriores mostraram que a activação da via de sinal de PI3K /Akt é necessário para a diafonia entre efrina-A1 e eNOS na promoo da angiogese. Nossos resultados sugerem que a sobre-regulada ephrin-A1 no tumor microambiente hipóxico possam promover a angiogénese via PI3K /Akt /eNOS.

Materiais e Métodos

Materiais

ephrin humana recombinante -A1-Fc quimera recombinante humana e IgG 1 Fc foram adquiridos a partir de R D systems (Minneapolis, MN, EUA). Os anticorpos contra o EphA2, eNOS e efrina-A1 foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, EUA), Akt e eNOS fosfo-(Ser1177) (P-eNOS

Ser1177) a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, CA, EUA), fosfo-Akt (Ser473) (P-Akt

Ser473) a partir Epitomics, Inc. (Burlingame, CA, EUA).

Cultura de células

SCC-9 A linha celular, que foi adquirido da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA), foi gentilmente fornecido pelo Professor Wen-Feng Zhang. As células foram cultivadas em DMEM /F12 (Hyclone, UT, EUA) suplementado com 10% de FBS (Gibco, Carlsbad, Califórnia, EUA). L-251 linha celular GBM foi adquirido a partir de China Center For Type Culture Collection (CCTCC, Wuhan, China), que foi cultivado em meio MEM (Hyclone, UT, EUA) suplementado com 10% de FBS (Gibco, Carlsbad, Califórnia, EUA). HUVECs primários foram gentilmente cedidas pelo Professor Yi-Fang Zhao e Dr. Hai-Xiao Zou [17] e cultivadas em meio basal CE-2 (EBM-2; Lonza, Walkersville, MD) suplementado com 2% de soro fetal de bovino (FBS) e com EGM-2 mistura de factor de crescimento (Lonza). HUVECs utilizados neste estudo foram restringidos na passagem 4 para a passagem 6. Todas as células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera contendo 5% de CO

2. Nossos estudos foram aprovados pelos Comitês de Ética na Escola e Hospital de Estomatologia (Universidade de Wuhan, número de referência 055/2011).

Cell Migration Assay

A migração celular foi analisada utilizando o ensaio de zero ferida . HUVEC confluente numa placa de 24 poços foram deixados em jejum durante a noite em 0,1% de BSA de EBM-2 até que uma ferida foi feita por meio de uma ponta de pipeta de 200 uL. Após lavagem três vezes com PBS para remover as células destacadas e os resíduos celulares, meio de crescimento livre de fator com Efrina-A1-Fc (1 ug /ml) sozinha ou em conjunto com L-NAME (100 pM) ou LY294002 (10 uM) foi adicionados a cada poço. Meio de Crescimento isento de fator com ou sem recombinante Fc de IgG1 (1 ug /ml) foi tomado como controlo. Imagens na mesma posição ao longo da ferida zero foram tiradas às 0 h, 24 h. A percentagem do fecho da ferida em cada ponto de tempo foi calculada pela seguinte fórmula: [1- (área ferida corrente /área da ferida inicial)] x 100

Formação in vitro tubo de ensaio

Sub. HUVECs -confluent foram ressuspensas em factores de crescimento livre de EBM-2 contendo efrina-A1-Fc (1 ug /ml) sozinha ou em conjunto com L-NAME (100 pM) ou LY294002 (10 uM), e semearam-se sobre a pré-solidificado BD de matrigel (BD Bioscience) na placa de 96 poços (3 x 10

4 células /cavidade). As placas foram então incubadas a 37 ° C, 5% de CO

2 durante 6 h. As imagens foram colhidas de cada grupo. Todos os pontos de ramificação das estruturas de tubo em cada poço foram contadas para quantificar o grau de formação do tubo. Meio de Crescimento isento de fator com ou sem recombinante Fc de IgG1 (1 ug /ml) foi tomado como controlo. A percentagem de formação de tubos foi calculado tendo o grupo de controlo IgG 1 Fc recombinante, como a formação do tubo 100%. As experiências foram repetidas pelo menos três vezes, sob condições semelhantes.

nenhuma concentração de detecção do ensaio

A concentração total de NO no meio de cultura foi detectada através da medição da concentração de nitratos e nitritos pelo método da reacção de Griess modificada. Total de óxido nítrico Assay Kit (Beyotime, China) foi usado. As densidades ópticas a 540 nm de comprimento de onda foram registados utilizando um leitor de micro-placa (Thermo MutliscanMK3; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e as concentrações de NO foram calculados de acordo com a curva padrão

Bloco de Ensaio.

ensaio do bloco foi realizado para avaliar a função da eNOS na ephrin-A1-induzida HUVECs angiogênese e efeito ephrin-A1 na P-eNOS

Ser1177 através de via PI3K-Akt. L-NAME (100 pM) ou LY294002 (50 uM) foi adicionado no meio de cultura para bloquear ou eNOS PI3K. HUVECs dos grupos de controlo foram cultivadas em meio isento de factor de crescimento com ou sem recombinante Fc de IgG1 (1 ug /ml).

imunofluorescência

HUVEC crescendo em lamelas foram incubadas em 2% FBS EBM-2 contendo 1 mg /ml de efrina-A1-Fc para 0 h, 8 h e 24 h. As lamelas foram lavadas com PBS e fixadas em paraformaldeído a 4% frio durante 10 min. A seguir ao tratamento com 5% de BSA-PBS a 37 ° C durante 30 min, as células foram incubadas com anticorpo primário de coelho contra polyclone eNOS (diluição 1:600) ou o EphA2 (diluição 1:400) a 4 ° C durante a noite. As células foram então lavadas três vezes com PBS durante 15 minutos e expostos a Alexa Fluor anti-IgG de coelho de cabra conjugado 488 (diluição 1:300) durante 1 h a 37 ° C. Os núcleos foram coradas durante 2 min com Hoechst (diluição 1:10000) (Sigma, EUA), seguido por mais três lavagens em PBS, durante 15 min. Todas as lamelas foram cobertos com lâminas e montado no microscópio de fluorescência (Leica DM4000B, Alemanha) para a detecção. Os controlos negativos foram tratadas do mesmo procedimento, mas omitindo o anticorpo primário.

Ensaio de Proliferação Celular

HUVEC em placas de 96 poços (1 × 10

3 em 100 ul /poço) foram exposto a efrina-A1-Fc (1 ug /ml) durante 0 h, 24 h e 48 h. A taxa de proliferação celular foi medida utilizando uma contagem celular Kit-8 (Dojindo, Tóquio, Japão) pela adição de 10 ul de WST-8 em cada poço nos tempos indicados. A absorvância a comprimento de onda de 450 nm foi registada usando um leitor de microplacas (Thermo MutliscanMK3; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA).

Polymerase Chain Reaction

O ARN total foi extraído a partir de grupos de estudo . O ADNc foi sintetizado com o Kit ™ Premium RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Fermentas, Glen Burnie, MD, EUA). PCR em tempo real foi realizado utilizando o kit Maxima ™ SYBR Verde qPCR Master Mix (Fermentas, Glen Burnie, MD, EUA) e espectrofluorimétrico térmica iCycler1 (Bio-Rad, Hercules, CA). Para eNOS, sequências de iniciadores são 5′-GTGGCTGTCTGCATGGACCT-3 ‘(directo) e 5′-CCACGATGGTGACTTTGGCT-3’ (inverso), tamanho do produto 121 pb. Humano da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) foi feita como um controlo interno. O nível de expressão de mRNA em cada grupo foi calculada pela ΔΔCt comparativa.

A hipoxia Experiência

SCC-9 células foram expostas a condições de hipoxia (1% O

2) ou condições de normóxia ( 21% O

2) para 0 h, 6 h, 12 h, 24 h e 48 h. As células foram colhidas e lisadas em tampão de amostra de SDS para o ensaio de mancha de Western. Os sobrenadantes foram recolhidos e centrifugados a 3000 × g durante 10 min para remover os detritos. Uma quantidade igual de sobrenadante foi carregado para detectar a forma solúvel de efrina-A1 por análise de Western blot [18].

arredondamento celular Ensaio

Os sobrenadantes (24 h) acima foram tomados como meio condicionado (CM) e concentrou-se 6 × antes de experimento arredondamento celular utilizando 10 kDa MWCO Amicon Ultra dispositivos centrífugos de filtro (Millipore). As células U-251 foram tratadas com GBM CM ou 1 ug /ml de recombinante humano efrina-A1-Fc. microscópio invertido foi usado para observar a célula de arredondamento em 15 min, 30 min e 2 h após o tratamento.

Análise Western Blot

HUVEC em 90% de confluência foram tratadas com Efrina-A1-Fc ( 1 ug /ml) em 2% de FBS EBM-2 para os tempos indicados. A proteína foi colhida em tampão de lise contendo mistura de inibidores de protease e cocktail de inibidores de fosfatase (Roche, Alemanha). Igual quantidade de proteína (30 ug) foi carregado e separados em 8% SDS-PAGE. E, em seguida, as proteínas foram transferidas para membrana de difluoreto de polivinilideno (Millipore Co., Billerica, MA, EUA) a 200 mA durante 2 h (100 mA, 1 h para efrina-A1) a 4 ° C, bloqueados em TBS contendo 5% de BSA (w /v) e 0,1% de Tween-20 durante 1 h, e incubados com anticorpos primários apropriados a 4 ° C durante a noite. A diluição dos anticorpos foi como se segue: efrina-A1 (1:500), eNOS (1:600), P-eNOS

Ser1177 (1:1000), Akt (1:1000), P-Akt

Ser473 (1:1000) e β-actina (1:2000). Após cinco lavagens de 5 min, os blocos foram incubados com anticorpo de rábano conjugada com peróxido secundário (diluição 1:10,000) (Jackson Immunoresearch Laboratories) durante 1 h à temperatura ambiente. Por fim, as bandas foram examinados usando ECL mais reagentes de detecção de mancha Western (Beyotime, China). A análise por Western blot foi repetido pelo menos três vezes, sob condições semelhantes.

Análise estatística

Todos os dados foram apresentados como média ± SEM. one-way análise de variância (ANOVA) foi utilizado para comparar a diferença entre os grupos experimentais.

P

valores inferiores a 0,05 foram considerados significativamente diferentes.

Resultados

Avançado Angiogenesis in vitro

receptor EphA2 Ephrin-A1 expressa positivamente em nossos HUVECs cultivadas (Figura S1A-C). A não pré-agrupado recombinante humana efrina-A1-Fc foi utilizado para determinar os efeitos da efrina-A1 sobre a proliferação, migração e formação do tubo em HUVEC. Os nossos resultados mostraram que efrina-A1-Fc pode aumentar de forma significativa a migração HUVEC (Figura S2A, B) e a formação do tubo em matrigel (Figura S3A-D), sem afectar a proliferação das células (Figura S4). Estes resultados foram consistentes com os relatórios anteriores [19], confirmando ephrin-A1 modulação da angiogênese.

Ephrin-A1 indução de angiogênese é mediada pela eNOS Activation e NO

Produção

Apesar de eNOS /NO têm foi considerada como um efector crucial na angiogénese tumoral, não há estudos anteriores têm abordado se eNOS /nO medeiam a angiogénese induzida por efrina-A1. NÃO ensaio de detecção mostrou um aumento dramático da produção de NO no sobrenadante de células HUVEC cultivadas depois da incubação com 1 ug /ml de Efrina-A1-Fc durante 24 h (Figura 1). Houve diferença estatística significativa na produção de NO entre o grupo controle (10,4 ± 3,4 mM) e grupo-A1-Fc-estimulação ephrin (42,1 ± 4,1 mM). Quando a produção de NO foi inibida com L-NAME (100 pM), taxa de fechamento da ferida foi suprimida dramaticamente (Figura 2A) (Figura S2A, B), e menos intacta estruturas de tubo e pontos de ramificação foram observados em células HUVEC efrina-A1-estimulada (Figura 2B) (Figura S3A-D), que mostra uma diminuição significativa na migração das células e formação do tubo (Figura 2C, 2D). Estes resultados sugerem que a eNOS /NO pode desempenhar um papel chave no processo angiogénico induzido efrina-A1.

Os dados mostraram um aumento significativamente a produção de NO no grupo EA1-Fc. (*,

P Art 0,05, n = 3)

A:. Ensaio de migração celular mostraram que L-NAME e LY294002 inibiu a migração ephrin-A1-estimulada de HUVECs ( 200 ×). B: Ensaio de formação de tubo mostrou que a L-NAME e LY294002, inibiu a formação de tubo de efrina-A1-estimulada de células HUVEC (200 ×). Pontas de seta apresentou o HUVECs que se estendia insuficientemente. C: Quantificação da A. D: Quantificação do B. (*,

P Art 0,05, n = 3)

Para um estudo mais aprofundado, eNOS expressão e fosforilação de estado eram. examinados em efrina-A1-estimuladas células HUVEC. Como mostrado na Figura 3A, 3B, 3C, não há alterações significativas eNOS expressão foram detectados por imunofluorescência, PCR em tempo real e análise de Western blot. No entanto, a estimulação efrina-A1-Fc causou um aumento dependente do tempo na rápida fosforilação da eNOS no local Ser1177 (Figura 3D) (Figura S5). P-eNOS

Ser1177 começaram a elevar significativamente em cerca de 10 min e alcançado para o efeito máximo em 30 min e diminuiu em seguida (Figura 3E). Estes dados sugerem que a P-eNOS

activação Ser1177 mas não aumentam de eNOS expressão é o principal responsável pela elevada produção de NO na angiogênese induzida ephrin-A1.

Imunofluorescência (A), PCR em tempo real ( B) e análise Western blot (C) demonstraram que efrina-A1-Fc tinha qualquer efeito na expressão de eNOS de HUVEC (#,

P

0,05, n = 3). D: As transferências de Western que demonstram que a P-eNOS

Ser1177 e P-Akt

Ser473 foram sobre-reguladas sob estimulação efrina-A1-Fc de um modo dependente do tempo. E: análise Quantidade de P-eNOS

Ser1177. F: Análise Quantidade de P-Akt

Ser473. (*,

P Art 0,05, n = 4).

PI3K /Akt é necessária para induzida ephrin-A1 P-eNOS

Ser1177 em HUVECs

como se mostra na Figura 3D, 3F, efrina-A1-dependente P-eNOS

Ser1177 foi também acompanhado por uma fosforilação rápida semelhante e a activação de Akt

Ser473, sugerindo Akt pode actuar como um importante modulador a montante que contribui para a P-eNOS

Ser1177 no presente processo. Enquanto a PI3K foi tomado como um controlador directa de Akt [20] – [22], LY294002 (50 uM) foi aplicado no nosso estudo para confirmar o seu efeito sobre a fosforilação de Akt e eNOS. Os nossos resultados mostraram que não só P-Akt

Ser473 mas também P-eNOS

Ser1177 foi atenuada por tratamento com LY294002 (Figura 4A-C) (Figura S6), descobriu que a PI3K é fundamental para a fosforilação de Akt por ephrin- A1 e por sua vez fosforila eNOS no local Ser1177. Além disso, a fim de determinar se a activação da via PI3K /Akt estava envolvido em funções celulares induzidas efrina-A1, LY294002 foi adicionado no meio de cultura e os seus efeitos sobre células endoteliais foram avaliadas por ensaio de zero ferida e ensaio de formao de tubo. Como mostrado na Figura 2A, 2B, após a exposição ao LY294002, a taxa de fechamento da ferida foi significativamente diminuída em comparação com o grupo EA1-Fc (Figura 2C); HUVECs em matrigel esticado insuficientemente, menos pontos de ramo foram gravadas e menos estruturas de tubos intactos foram observados no grupo EA1-Fc + LY294002 (Fig. 2D). Estes resultados sugerem que a fosforilação da Akt desempenha um papel crítico na efrina-A1 HUVEC induzida funções angiogénicos. Tomados em conjunto, podemos tirar uma conclusão que ephrin-A1 provoca a ativação da eNOS pela via de sinal PI3K /Akt-dependente em suas funções pró-angiogénicos

A:. Western blot representativos para P-eNOS

Ser1177 e P-Akt

Ser473 de células HUVEC que foram deixados em jejum em 0,1% de BSA de EBM-2 durante a noite e estimuladas com efrina-A1-Fc (1 ug /ml) durante 30 min sozinho ou em conjunto pré-tratados com LY294002. B: Análise Quantidade de P-Akt

Ser473. C: análise Quantidade de P-eNOS

Ser1177. (*,

P Art 0,05, n = 4) (#,

P Art 0,05, n = 4)

hipóxia-regulada. ephrin-A1 Expressão e Solúvel ephrin-A1 secreção em células cancerosas

As células cancerosas foram cultivadas sob condições de hipoxia e normoxia. As células e os sobrenadantes foram colhidos para análise de efrina-A1 por Western blot. Em comparação com células cultivadas em condições de normóxia, SCC-9 células expostas à hipoxia foram detectado um aumento marcado na expressão de efrina-A1 de um modo dependente do tempo, com o efeito máximo que aparece às 24 h (Figura 5A) (Figura S7A, B). Mais importante ainda, as proteínas efrina-A1 também foi detectada de forma positiva e aumentou significativamente nos sobrenadantes a partir de grupos de hipoxia, o nível do qual foi muito mais elevado em comparação com os grupos de normoxia (Figura 5b) (Figura S7C, D), o que sugere que as células de cancro pode também secretam forma solúvel de ephrin-A1 no tumor microambiente hipóxico. Curiosamente, tal como mostrado na Figura 5A, tanto grupo normóxia e hipóxia teve tendência semelhante expressão efrina-A1 em células SCC-9. O Efrina-A1 começou a aumentar em cerca de 6 h, chegou ao seu ponto máximo em 12 h a 24 h e, em seguida, diminuiu mais tarde. Um possível mecanismo de feedback negativo pode ter sido envolvido neste processo especial. endocitose do receptor induzida por Efrina foi estudada em vários sistemas biológicos. Após a interacção do ligando ef rina-A1 e do receptor EphA2, os complexos ligando-receptor pode ser internalizado bidireccionalmente em células tumorais [23], [24]. Esta internalização complexos ligando-receptor pode ainda actuar como uma motivação feedback negativo no controle da expressão ephrin-A1. Por isso, é possível que o aumento da activação do EphA2 por tanto ligada à membrana e solúvel efrina-A1 em células SCC-9 resultou na diminuição da regulação da efrina-A1. Quanto à razão pela qual ephrin-A1 é aumentado dramaticamente entre os pontos de tempo de 6 horas e 12 h, mesmo em grupo normoxia, ele ainda precisa de uma investigação mais aprofundada

A:. Western blot demonstrando que a hipóxia membrana elevada vinculado expressão ephrin-A1 em células SCC-9. B: Western blot demonstrando que a hipóxia-regulada solúvel ephrin-A1 em sobrenadantes de células SCC-9. SCC-9 densidade celular a 70-80% de confluência foi tomado como 0 h quando se meio de cultura fresco foi adicionado. C: arredondamento celular ensaio demonstrando que solúvel efrina-A1 em CM poderia activar o EphA2 em células U-251 GBM. Efrina-A1 (S), solúvel efrina-A1; N, normoxia condicionado grupo médio; H, hipóxia condicionado grupo médio.

celular arredondamento é uma resposta característica funcional ephrin-A1 [18], [25]. células U-251 GBM naturalmente sobre-expresso EphA2 e ter nível muito baixo de ephrin-A1 [26]. A capacidade de solúvel efrina-A1 em CM para induzir o arredondamento celular de células U-251 GBM foi investigada. Como mostrado na Figura 5C (Figura S8), o tratamento de células U-251 GBM com qualquer CM ou efrina-A1-Fc resultou numa alteração drástica na morfologia das células, reflectindo a célula arredondamento tão cedo quanto 15 minutos, chegando ao efeito espiada em 30 min e de diminuição por 2 h após a CM e efrina-A1-Fc tratamento. Embora as mudanças morfológicas das células U-251 foram observados sob estimulação CM, experiências funcionais adicionais ainda são necessários para demonstrar se ephrin-A1 pode induzir fosforilação EphA2 ou mesmo angiogénese tumoral.

A cascata de sinalização solúvel induzido por hipoxia envolvido em angiogênese induzida ephrin-A1 é caracterizada esquematicamente na Figura 6.

Discussão

O presente estudo revelou um mecanismo pelo qual ephrin-A1 modula a angiogênese e um fator determinante para ephrin-A1-se -regulamento. angiogénese induzida por Efrina-A1 envolve um aumento da produção de NO que se siga a uma activação de PI3K /Akt-dependente de P-eNOS

Ser1177 em células endoteliais. A hipoxia poderia induzir activamente realce de ambos ligada à membrana e solúvel efrina-A1 em células tumorais. Estes resultados proporcionam a primeira evidência de que a PI3K /Akt /eNOS cascata de sinalização pode representar uma via comum para a angiogénese efrina-A1-dependente hypoxia-inducible no desenvolvimento vascular e a progressão do tumor.

evidência Acumulando confirmou que a angiogénese eficaz requer bioactivo nO sintetizado pela eNOS, que é predominantemente expressa em células endoteliais vasculares. Tem sido relatado que o NO é um mediador importante da angiogénese induzida por VEGF que podem ser bloqueados por L-NAME [27]. Da mesma forma, as estatinas podem sobre-regular a expressão de eNOS, promover a angiogénese e dependente de NO, reduzindo-caveolin uma abundância [28]. Pela primeira vez, verificou-se que a produção de NO também é essencial para a angiogénese em resposta ao pró-angiogénico molécula efrina-A1. migração celular induzida por Efrina-A1-Fc e montagem capilar foram atenuados quando ECs foram tratados com L-NAME. Curiosamente, o nosso estudo adicional mostrou que elevou a síntese em ECs induzida ephrin-A1 foi atribuído principalmente à fosforilação eNOS no resíduo Ser1177 mas não aumento da expressão de eNOS. É bem sabido que a fosforilação é um dos mecanismos regulatórios pós-transição mais importantes subjacentes activação da eNOS [20], [29]. Como prova de nossa descoberta, também são observados vários tipos de estímulos que promovem a ativação da eNOS para causar a fosforilação em diferentes locais, tais como Thr495, Ser633 e Ser1177 [30]. Nossos resultados fornecem a primeira evidência de que ephrin-A1 tem um cross-talk coordenada com eNOS /NO na promoção da angiogênese.

Embora a correlação do aumento da atividade da eNOS com angiogênese ephrin-A1-estimulada foi encontrado no presente estudo, a via de sinalização envolvida na melhoria induzida ephrin-A1 da actividade eNOS ainda precisa de mais investigação. Tem sido relatado que o stress induzido cisalhamento produção de NO parece ser controlada pela fosforilação dependente de Akt da eNOS em ECs cultivadas [31]. Além disso, a proteína quinase Akt foi mostrado funcionar como um factor de sobrevivência CE e para promover a formação do tubo in vitro [32]. Estudos anteriores também sugeriram que a via PI3K /Akt mediar a angiogénese induzida por vários estímulos angiogénicos, tais como VEGF [33], forscolina [34], microgravidade [35], e assim por diante. Para investigar o envolvimento funcional da via PI3K /Akt em efrina-A1-eNOS conversa cruzada, o efeito do LY294002 em eventos de sinalização induzidos por efrina-A1 foi determinada. Após estimulação com Efrina-A1-Fc durante 30 min, a fosforilação tanto da Akt e eNOS foi elevada de forma significativa. Esta elevação deveu-se a fosforilação de Akt

Ser473 e eNOS

Ser1177, como demonstrado por análise de Western blot. A exposição ao LY294002 impedido expressão induzida por efrina-A1 da P-Akt

Ser473 e P-eNOS

Ser1177 aparentemente, indicando que a via PI3K /Akt sinal dependente participaram no controlo da activação efrina-A1-mediada de eNOS.

a hipoxia é uma das características mais importantes no microambiente tumoral, e modula variedades de factores angiogénicos tais como factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) [36]. Efrina-A1 é também conhecido como um factor angiogénico, e desempenha um papel central na neovascularização em vários cancros [4]. Estudos anteriores mostraram que o gene efrina-A1 pode ser induzida pelo factor de necrose tumoral-α (TNF-α) em células endoteliais [37]. Recentemente, Uemura et al. identificada ephrin-A1 como um possível gene hipoxia-inducible candidato por análise de microarray de amostras de tecido de câncer colorretal metastático [38]. Além disso, a expressão de efrina-A1 e genes relacionados foram marcadamente reduzidos em knockdown HIF-2α (kd /KD) de células endoteliais, o que implica o papel de hipoxia na regulação efrina-A1 [39]. No presente estudo, fornecemos evidências diretas de que a exposição à hipoxia resultou na expressão elevada ephrin-A1 em células cancerosas por análise de Western blot. Efrina-A1 foi identificado pela primeira vez como uma proteína ancorada por GPI que requer ligação à membrana ou agrupamento /oligomerização para a sua activação do EphA2 [40]. Por conseguinte, os nossos resultados sugerem que a sobre-regulação de ligada à membrana efrina-A1 induzida por hipoxia podem promover a angiogénese do tumor através da interacção com o seu receptor EphA2 em células endoteliais no microambiente tumoral. Além disso, nós documentada neste estudo que a hipóxia-regulada uma forma solúvel de efrina-A1 libertando a partir de células cancerosas para o ambiente extracelular. De acordo com a nossa descoberta, efrina-A1 também foi detectado no soro de pacientes com carcinoma de fígado [41]. Recentemente, vários estudos têm demonstrado que monomérico solúvel efrina-A1 é um ligando para o EphA2 funcional, e que solúvel efrina-A1 libertado a partir de células HeLa e SK-BR3 é necessário para o crescimento e transformação das células [4]. Semelhante a esses estudos, observou-se alterações morfológicas de células U-251 sob estimulação CM. No entanto, mais estudos são necessários para confirmar se o induzido por hipoxia solúvel ephrin-A1 pode funcionalmente interagir com EphA2 para iniciar a angiogênese.

Em resumo, as constatações mais significativas e inovadoras apresentadas neste estudo incluem que: 1) ephrin -A1 coopera com eNOS na promoção da angiogénese em células HUVEC; que 2) a diafonia entre efrina-A1 e eNOS é mediado por via de /dependente de Akt-PI3K; e que 3) hipóxia-regula tanto proteínas efrina-A1 e segregada ligada à membrana em células de cancro. Como poucos estudos têm-se centrado sobre os eventos moleculares jusante ephrin-A1-acionados, os resultados aqui relatados identificar PI3K /dependente de Akt eNOS

Ser1177 fosforilação como um novo mecanismo subjacente ephrin-A1modulation da angiogênese (Figura 6).

Informações de Apoio

Figura S1.

Expressão do receptor EphA2 nas células HUVEC cultivadas. Imunofluorescência (A), RT-PCR (B) e análise Western blot (C) demonstrou a expressão do EphA2 em células HUVEC positivo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074464.s001

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Figura S2 . Ensaio de migração celular

mostrou que a L-NAME e LY294002 inibiram a migração de efrina-A1-estimulada de células HUVEC (200 ×). migração de células endoteliais foi medida em células HUVEC que foram fome em crescimento isento de factor de 0,1% de BSA de EBM-2 durante a noite e tratados com Efrina-A1-Fc (1 ug /ml) durante 24 h

doi:. 10.1371 /jornal. pone.0074464.s002

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Figura S3. ensaio de formação do tubo

mostrou que a L-NAME e LY294002, inibiu a formação de tubo de efrina-A1-estimulada de células HUVEC. A, B, C: Imagens representativas em 40 ×. D:. Imagens representativas em 200 ×

doi: 10.1371 /journal.pone.0074464.s003

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Figura S4. proliferação de células endoteliais

foi medida em células HUVEC tratados com Efrina-A1-Fc (1 ug /ml) durante 0 h, 24 h e 48 h. Não houve significância estatística entre o grupo EA1-Fc e Controle. EA1-Fc, efrina-A1-Fc. (#,

P Art 0,05, n = 3)

doi: 10.1371 /journal.pone.0074464.s004

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Figura S5..

Efeito da efrina-A1-Fc sobre a fosforilação da eNOS e Akt em células HUVEC. A, B, C: manchas de Western demonstrando que a P-eNOS

Ser1177 e P-Akt

Ser473 foram sobre-reguladas sob estimulação efrina-A1-Fc de um modo dependente do tempo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074464.s005

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Figura S6.