Abstract

câncer pediátrico é um grupo relativamente rara e heterogênea de hematológicas e não-hematológicas malignas que requerem vários procedimentos para a sua triagem diagnóstica e classificação. Até agora, a citometria de fluxo (FC) não tem sido aplicado de forma sistemática para o diagnóstico de trabalho de acompanhamento de tais tumores malignos, particularmente para tumores sólidos. Aqui nós avaliamos um painel FC de marcadores para a triagem diagnóstica de câncer pediátrico e posterior classificação de tumores sólidos pediátricos. A estratégia proposta visa o diagnóstico diferencial entre tumoral

vs

. amostras reativas e hematológica

vs

. doenças malignas não hematológicas, ea subclassificação de tumores sólidos. No total, 52 amostras de 40 pacientes suspeitos de células tumorais contendo foram analisados ​​por meio de FC em paralelo com os procedimentos de diagnóstico convencionais. A taxa global de concordância entre as duas abordagens era de 96% (50/52) de amostras de diagnóstico, com uma concordância de 100% para todas as amostras reactivas /inflamatórias e não infiltrada, bem como para aqueles que corresponde a tumores sólidos (n = 35), com apenas dois casos de falsos negativos diagnosticados com linfoma de Hodgkin e linfoma anaplásico, respectivamente. Além disso, uma clara discriminação entre as amostras infiltradas por hematopoiéticas

vs.

Células tumorais não hematopoiéticas foi sistematicamente atingido. subtipos distintos de tumores sólidos apresentaram diferentes perfis de expressão de proteína, permitindo o diagnóstico diferencial de neuroblastoma (CD56

oi /GD2

+ /CD81

oi), tumor neuroectodérmico primitivo (CD271

oi /CD99

+), Wilms tumores ( 1 população de células), rabdomiossarcoma (

nuMYOD1

+ /

numyogenin

+), carcinomas (CD45

– /EpCAM

+) , tumores de células germinativas (CD56

+ /CD45

– /NG2

+ /CD10

+) e, eventualmente, também hemangiopericitomas (CD45

– /CD34

+). Em resumo, os nossos resultados mostram que multiparâmetros FC fornece dados complementares rápidas e úteis para histopatologia de rotina para a triagem diagnóstica e classificação de câncer pediátrico

Citation:. Ferreira-Facio CS, Milito C, Botafogo V, Fontana M, Thiago LS, Oliveira E, et al. (2013) Contribuição de multiparâmetros imunofenotipagem por a triagem diagnóstica e Classificação de Oncologia Pediátrica. PLoS ONE 8 (3): e55534. doi: 10.1371 /journal.pone.0055534

editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Canadá |

Recebido: 20 de setembro de 2012; Aceito: 27 de dezembro de 2012; Publicação: 05 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ferreira-Facio et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi parcialmente suportado pelos seguintes subsídios: OE foi parcialmente apoiado pela concessão do CNPq- Conselho Nacional de Pesquisa do Brasil (Brasília, Brasil). MF foi parcialmente financiado por uma concessão do FAPERJ- Research Fundação de Apoio do Rio de Janeiro, (Rio de Janeiro, Brasil) e agora ela é parcialmente suportado por uma bolsa da CAPES /Ministério da Educação (Brasília, Brasil). VB foi parcialmente apoiado pela FAPERJ- Research Fundação de Apoio do Rio de Janeiro, (Rio de Janeiro, Brasil). ESC foi parcialmente apoiado pela concessão do CNPq- Conselho Nacional de Pesquisa do Brasil (Brasília, Brasil) e FAPERJ- Research apoio da fundação do Rio de Janeiro, (Rio de Janeiro, Brasil). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Sem financiamento externo adicional recebida para este estudo

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Mais de 200.000 pacientes pediátricos ( 15.. anos de idade) são diagnosticadas com câncer a cada ano [1]. Apesar de o câncer é a principal causa de morte relacionada com a doença em crianças na maioria dos países [2], os resultados individuais dependem em grande parte do tumor rápido diagnóstico, classificação e estadiamento, para a seleção de uma terapia apropriada e taxas de cura maximizadas [3]. Uma vez que uma proporção significativa de tumores pediátricos falta evidência morfológica de diferenciação e de origem histológica, uma bateria de marcadores imunocitoquímica e hibridação in situ, ultraestrutural e procedimentos de diagnóstico molecular, são normalmente necessários para a classificação de diagnóstico da doença [3] – [7].

durante várias décadas, citometria de fluxo multiparâmetro (MFC) imunofenotipagem tem provado ser essencial para o rápido diagnóstico, classificação e monitorização da terapêutica da maioria das neoplasias hematológicas, incluindo leucemias e linfomas pediátricos. Por outro lado, continua a ser uma ferramenta de pesquisa para tumores sólidos pediátricos [8] – [15]. Tal uso limitado de MFC no diagnóstico de tumores sólidos pediátricos, provavelmente, refere-se a necessidade de suspensões de células individuais e a disponibilidade de painéis relativamente restrito de marcadores de confiança e validados, entre outros factores [16] – [18]. Assim, a utilização de citometria de fluxo em tumores sólidos pediátricos foi quase restrita à avaliação do conteúdo de ADN de células de tumor em ambos os espécimes embebidos em parafina e de tecido congelado, em combinação ou não com coloração simultânea para um ou alguns poucos marcadores fenotípicos [19] – [24]. Por conseguinte, embora estudos imunofenotípicas são rotineiramente aplicada na maioria dos linfomas pediátricos para o diagnóstico diferencial entre B- e precursores de células T linfomas linfoblástica e linfoma de Burkitt 25-28, poucos estudos têm sido relatados até agora, em que MFC é sistematicamente aplicada ao estudo das características fenotípicas de tumores sólidos pediátricos [29] – [31]. Além disso, os poucos estudos relatados têm-se centrado principalmente na análise descritiva dos padrões de coloração para um ou alguns marcadores, geralmente em um único subtipo de diagnóstico da doença.

Apesar de todos os estudos anteriores, preliminares têm mostrado que tumores neuroendócrinos exibir um CD45

– /CD56

+ fenótipo [32] – [35]; por sua vez, as células de tumor de neuroblastoma co-expressar GD2 [35], enquanto tumores neuroectodérmicos primitivas (PNET) co-expressar CD57 e CD99, assim como CD56 [31], [34], [36] – [38], e as células tumorais rabdomiossarcoma são miogenina

+ [31], [39] – [41]. Apesar disso, a especificidade destes fenótipos entre os diferentes subtipos de tumores sólidos pediátricos continua a ser estabelecida, e nenhum estudo foi relatado até agora, em que um amplo painel de marcadores destinados a triagem de diagnóstico, diagnóstico diferencial e classificação de tipos distintos de tumores pediátricos, foi proposto e avaliado.

Aqui nós avaliamos um novo painel abrangente MFC de marcadores para a triagem diagnóstica do câncer pediátrico e correcta atribuição de tumores sólidos pediátricos a entidades de doenças específicas.

materiais e Métodos

pacientes e amostras

Um total de 52 amostras de 40 pacientes suspeitos de câncer pediátrico -21 sexo masculino (52,5%) e 19 mulheres (47,5%) – foram coletadas entre novembro de 2009 e dezembro de 2011, em três centros distintos: Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira /Universidade Federal do Rio de Janeiro (IPPMG /UFRJ) e Servidores Hospital do Estado (HSE), ambos do Rio de Janeiro (Brasil) e Hospital de Clínicas /Universidade Federal do Paraná (HC /UFPR) em Curitiba (Brasil). A idade mediana paciente era de 5 anos (variação: 1-14 anos). A maioria das amostras (48/52; 92,3%) foram analisados ​​no momento do diagnóstico

Em todos os casos, o diagnóstico final e classificação foi estabelecida com base morfológica e as análises imuno-histoquímica realizada em um laboratório de referência, seguindo a Organização Mundial da Saúde (OMS. ) critérios [42] – [44] Trinta e um pacientes (78%) tinha câncer, 17 dos quais (55%) apresentaram doença metastática; os restantes 9 crianças (23%) tinham doenças inflamatórias /reativos. De acordo com o diagnóstico histopatológico /imuno-histoquímica, 11 pacientes (12 amostras) tinha neuroblastoma, 3 (4 amostras) tinha rabdomiossarcoma, 2 (2 amostras) um tumor neuroectodérmico primitivo (PNET), 8 (9 amostras) tinha linfoma, 2 (2 amostras) Wilms tumores, 2 (3 amostras) tumores de células germinativas, e um paciente teve uma carcinoma adrenal, um carcinoma da nasofaringe, e um um hemangiopericitoma; as outras 17 amostras correspondeu a 9 amostras reactivas e 8 amostras de pacientes com doenças neoplásicas as quais não mostraram nenhuma infiltração tumoral. A origem específica dos espécimes está detalhado na Tabela S1.

Declaração de Ética

O estudo foi aprovado pelo Comitê dos hospitais IPPMG e HSE Ética e amostras foram obtidas após consentimento informado foi dada pelo as crianças e seus pais ou responsáveis, de acordo com o protocolo Declaração de Helsinki. Pais /tutores desde que o seu consentimento informado por escrito para participar neste estudo e este consentimento informado por escrito foi aprovado pelos comitês de ética locais.

preparação de amostras de tecidos e fluidos corporais

As amostras de tecido livre de gordura e tecido necrosado (peso médio: 144 mg; intervalo: 3 a 3.600 mg) foram coletadas na unidade cirúrgica. Eles foram avaliados diretamente por um patologista experiente, e divididos em dois blocos contíguos. Um bloco foi fixado em formalina, embebido em parafina e processado para histopatologia de rotina, enquanto o outro foi colocado em solução salina fria (4 ° C) de fosfato tamponada (PBS, pH = 7,4) para futuras análises por citometria de fluxo. A amostra foi depois ponderadas, colocado numa placa de Petri com PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA; Calbiochem, La Jolla, CA), triturada em pedaços pequenos (2-4 mm) com uma lâmina de bisturi e mecanicamente desagregados com duas estéril agulhas; Depois, filtrou-se através de uma seringa estéril FILCON (100 um de tamanho de poro) para eliminar aglomerados de células e de detritos, centrifugadas (10 min a 540 g) e ressuspensas em PBS contendo 1% de BSA numa concentração final de 10

6 células /mL. Depois disso, a amostra foi imediatamente corado para imunofenotipagem MFC. A medula óssea (BM) e outras amostras de fluidos corporais foram coradas directamente ou após um passo de centrifugação (por exemplo, urina), como descrito abaixo.

Multi Citometria de Fluxo Estudos imunofenotípica

Cada amostra foi corada com as seguintes combinações de anticorpos monoclonais conjugados com fluorocromo (MAbs) – isotiocianato de fluoresceína (FITC) /ficoeritrina (PE) /PE-cyanin7 (PECy7) /proteína peridinina clorofila-Cy5.5 (PerCP-Cy5.5) /aloficocianina (APC) /APC-Hilite7 (APC-H7) /Blue Pacific (PACB) /laranja do Pacífico (Paço) – dedicada à identificação simultânea de células tumorais e B- normais /reativa e linfócitos T, monócitos e neutrófilos: i) citoplasmática (Cy) MPO /

CyCD79a /CD19 /CD34 /CD7 /membrana de superfície (Sm) CD3 /

CyCD3 /CD45 [45]; ii) membrana de imunoglobulina de CD8-superfície (

SmIg) λ /CD56-sIgκ /- /CD19 + CD4 + /CD3 /- /CD20 /CD45 (painel de orientação na Tabela S2). Sempre que as células tumorais suspeitos foram detectados seguindo a estratégia gating ilustrado na figura 1, ainda mais caracterização fenotípica de tais células tumorais suspeitos foi realizada com os painéis de caracterização distintos, dependendo da natureza das células: não-hematopoiéticas vs B vs T vs outras células hematopoiéticas (Tabela S2). A coloração das células a partir de tecidos sólidos ou BM, sangue periférico (PB) e outros fluidos corporais foi realizada como previamente descrito em detalhe [46], [47]. Resumidamente, as amostras (50 ul por tubo) foram incubadas durante 15 min à temperatura ambiente, no escuro, na presença de 3-20 ul de cada um dos anticorpos monoclonais acima mencionados (MAB), de acordo com as recomendações dos fabricantes. Depois, 2 ml de solução de lise FACS (Becton Dickinson) diluído 1:10 (v /v) foi adicionado em água destilada, e as amostras foram incubadas durante mais 10 min sob as mesmas condições que as acima mencionadas, a fim de lisar non células vermelhas do -nucleated. Em seguida, as células foram centrifugadas (5 minutos a 540 g) e a pelete celular foi lavada duas vezes com 4 ml de PBS. Finalmente, as células foram ressuspensas em 0,5 ml de PBS. Para a avaliação da citoplasmática (Cy) ou antigénios nucleares (NU), as células foram fixadas, imediatamente depois de terem sido incubadas com o mAb dirigidos contra marcadores de membrana da superfície celular (ver acima); em seguida, eles foram permeabilizadas e coradas com MAb dirigidos contra os antigénios citoplasmáticos e /ou nucleares, utilizando o Fix kit reagente Perm (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA), seguindo rigorosamente as recomendações do fabricante. Para o MAb não conjugado, após a incubação com os MAbs específicos, um passo de lavagem seguido por um segundo passo de incubação com um reagente IgG anti-ratinho conjugado com FITC (Cytognos SL, Salamanca, Espanha), foi realizada (15 min) no escuro. A fim de confirmar a especificidade dos rotulamentos, um controlo negativo, com uma amostra não marcada foi sistematicamente executado em paralelo. As células coradas foram adquiridos em baixa velocidade em um fluxo FACSCanto II citômetro -Becton /Dickinson Biosciences (BD), San José, CA, EUA, – ​​utilizando o software FACSDiVa (BD). Todos, exceto duas amostras, foram processadas nas primeiras 4 h após a cirurgia. Para análise dos dados, foi utilizado o programa de software INFINICYT ™ (Cytognos SL). expressão do antigénio foi utilizado para identificar os diferentes tipos de células presentes na amostra e de cada população de células identificadas foi classificada como sendo negativo (-), dim positivo (+ Lo), positivo intermediário (+) e fortemente positiva (+ oi) usando arbitrária relação linear intensidade de fluorescência média (MFI) valores de 10

0-10

2, 10

2-10

3, 10

3-10

4, 10

4, respectivamente, de acordo com os valores de MFI vs observados níveis de linha de base autofluorescência encontrados no tubo de controlo; expressão do antígeno para um determinado marcador foi descrito como sendo heterogénea, quando foram detectados níveis de expressão variáveis ​​para esse marcador dentro de uma população de células.

No painel A, um exemplo que ilustra a estratégia de propagação e combinações gráfico de pontos bivariadas usado para a identificação de células tumorais CD45-, CD45- células estromais residual (por exemplo, células endoteliais e mesenquimais) e infiltrado de células hematopoiéticas (por exemplo, neutrófilos, células B e T) é mostrado. Por sua vez, nos painéis B a J o perfil imunofenotípicas de células tumorais CD45- a partir de um neuroblastoma (painéis B e H), um PNET (painéis C e I) e um rhabdomyossarcoma (painéis D e J) do tumor são mostradas em conjunto com imagens representativas dos perfis histophathological e imuno-histoquímico dos mesmos tumores corados com hematoxilina eosina mais cromogranin (células de neuroblastoma no painel E), CD99 (células PNET no painel F) e miogenina

(nu) (células rhabdomyossarcoma no painel G).

Exclusão de tumor não-viáveis células foi baseada em sua frente inferior (FSC) e lateralmente (SSC) características de dispersão de luz; a viabilidade celular média de amostras de tecido foi de 75%. Em 19/33 (57,5%) de amostras de tecidos sólidos, paralelo coloração com iodeto de propídio (PI, Sigma, St Louis, MO, EUA) foi realizada para avaliar a viabilidade celular, 90% das células mortas coradas com PI correspondente sistematicamente a eventos que foram excluídos como as células não viáveis ​​no /gate SSC FSC

histológicos e análises de imuno-histoquímica

análise histológica foi realizada em hematoxilina /eosina (H e). secções de tecido manchadas ( 3 uM). Em todas as amostras onde a infiltração do tumor foi suspeitas e /ou detectados, cortes de tecidos também foram coradas por imunohistoquímica convencional para o CD99, nuclear

(nu) MYOD1,

(nu) miogenina, sinaptofisina, cromogranina, NSE, LCA, CD20, CD19, CD10 e Ki67 marcadores. lâminas coradas foram avaliadas independentemente por dois patologistas experientes. Para BM, PB e amostras de urina, foi realizada análise citológica convencional.

Métodos Estatísticos

A fim de estabelecer a significância estatística das diferenças observadas entre os grupos, foi utilizado o teste Mann-Whitney U ( variáveis ​​contínuas; programa de software SPSS, versão 18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). O número de verdadeiros positivos (TP; amostras com a presença de uma população de células tumorais, como detectado por ambas as técnicas de diagnóstico convencionais e citometria de fluxo), verdadeiro-negativos (TN; amostras sem população de células tumorais como medido por abordagens convencionais e citometria de fluxo) , falso-positivos (FP; amostras com a presença de uma população de células tumorais por citometria de fluxo não detectada por métodos de referência) e de casos falsos negativos (FN; amostras com células tumorais não detectáveis ​​por citometria de fluxo, mas positiva pelas abordagens de referência), eram calculado. Sensibilidade e especificidade foram definidas como TP /TP + FN e TN /TN + FP, respectivamente, enquanto que o positivo (VPP) e valor preditivo negativo (VPN) foram calculados como TP /TP + FP e TN /TN + FN, respectivamente.

Resultados

diagnóstico diferencial entre Reactive /Non-infiltrada e Tumor /amostras infiltrados

com base no painel de triagem (painel 1 na Tabela S2), 9/52 amostras (17 %) correspondiam a amostras reactivas; outros 8 (15%) amostras obtidas de pacientes com câncer para fins de estadiamento da doença ou de monitoramento, também foram negativos para malignidade. Todas as outras amostras (n = 35; 68%) mostrou a infiltração por células tumorais. A taxa global de concordância entre MFC e histopatológico convencional, imuno-histoquímica e /ou procedimentos de diagnóstico citológico foi de 96% (50/52 amostras). Em detalhe, uma concordância de 100% foi obtido para as 17 amostras reactivas /inflamatórias e não infiltrada, ao passo que uma taxa de concordância de 94% (33/35 amostras) foi conseguida pelo MFC para amostras infiltrados por tumor. As duas amostras de tumores que foram classificados pela MFC correspondeu a amostras infiltrados por Hodgkin células de linfoma e de um linfoma anaplásico, respectivamente. Todas as amostras de infiltrados por tumores sólidos e B- ou linfomas de células T foram correctamente identificadas (Tabela 1). Portanto, uma eficiência global de 96% (100% de especificidade e sensibilidade de 94%) foi obtido (100% de PPV e NPV de 90%). A composição celular de ambas as amostras não infiltrada reactivos /inflamatórias e outras é mostrado na Tabela S3, enquanto a distribuição de células do estroma (inflamatória, células endoteliais e fibroblastos /mesenquimais) em 14/26 amostras que continham tumores sólidos não-hematopoiéticas é mostrado na Tabela S4.

Identificação do linfoma

Versus

não hematopoiéticas células tumorais

Um total de 35 amostras (de 31 pacientes) continham células tumorais com base na painel de triagem (painel 1 na Tabela S2) e os painéis (painéis de caracterização 2 a 5 da Tabela S2). A partir deles, 9 correspondeu a células hematopoiéticas malignas e 26 a tumores sólidos não-hematopoiéticas. Nos dois casos de linfoma falso-negativos, uma rica linfócito infiltrado policlonal foi observada pelo MFC, sem uma população de células tumorais claramente definida. Por sua vez, todos os casos de linfoma de células B (5/5) podiam ser facilmente distinguidos dos tumores sólidos pediátricos com um painel de rastreio (Tabela S2) pela expressão de marcadores de células B (CD19

+, cyCD79a

+ , CD22

+) em associação com CD45

+ lo ou CD45

+, enquanto que estes marcadores eram sistematicamente ausente em todos os 26 tumores sólidos pediátricos. Com o painel de caracterização de células B (painel 3 na Tabela S2) três amostras de linfoma de células B mostrou membrana da superfície

restrição de cadeia leve (Sm) Ig (2 casos

SmIgλ

+ e um

SmIgκ

+), juntamente com um Tdt

+, CD20

+ oi, CD38

+ oi, CD10

+ oi, cyBcl2

– imunofenotipagem que é altamente característico de Burkitt linfoma infância, excepto para a expressão de TdT. Os outros dois tumores de células B apresentado com uma CD45

+ eis CD19

+, CD20

-, CD22

+, CD10

-, CD38

+, CD58

+, CD81

+, CD9

+

SmIg

-,

CyIgμ

– fenótipo compatível com linfoma precursor de células B aguda linfoblástica (BCP-ALL), tanto por MFC e histopatologia. Por sua vez, 2 amostras de linfoma de células T pode ser facilmente distinguido de ambos tumores sólidos pediátricos e linfomas de células-B com o painel de triagem (painel 1 na Tabela S2) com base na sua CD45

+ Lo,

SmCD3

+ lo e

CyCD3

+ fenótipo; Além disso, essas células também mostraram uma CD4

+, CD8

-, CD1a

+, CD99

+, CD2

+, CD5

+, CD27

+, CD71

+ e CD81

+ perfil fenotípico, faltando CD7

-, CD117

– e os marcadores de células B uma vez que os painéis de triagem e caracterização apropriadas (painéis 1 e 4 na Tabela S2, respectivamente) foram usava. Todos os 26 tumores sólidos não hematopoiéticas analisadas foram negativas para todos B e de células T antígenos específicos investigados com o painel de triagem (painel 1 na Tabela S2), e eles eram CD45

-. Vinte e dois destes casos posteriores (84%) expressaram CD56

+, juntamente com padrões variáveis ​​de expressão de outros marcadores associados a diferentes tecidos não hematopoiéticos que foram incluídos no painel de caracterização para tumores sólidos (painel 2 Tabela S2) como descrito abaixo

imunofenotípica Caracterização de células tumorais não hematopoiéticas

Quase metade dos tumores não-hematopoiéticas correspondeu neuroblastoma. (12/26; 46%). Eles mostraram uma população uniforme do CD45

-, CD56

+, CD9

+, CD81

oi, GD2

+ células tumorais com expressão heterogênea de CD57

– /+ e CD58

+ /++; CD90 foi positiva em todos, menos um tumor, ao passo que foi parcialmente CD271 expresso em apenas um tumor (Tabela 2). Curiosamente, o único tumor ganglioneuroblastoma analisadas mostrou duas populações claramente diferentes de células de tumor: 39% tinha um imunofenotipagem idêntica à dos outros neuroblastomas, enquanto que as células restantes (61%) apresentaram maior dispersão de luz (FSC e SSC) e uma maior expressão de CD56, CD81 e CD57. Nenhum dos outros marcadores testados (por exemplo, CD99, CD38, CD19, CD20,

CyCD79a, CD34,

numyogenin,

nuMYOD1) foi expressa por células de neuroblastoma. A partir de todos os tumores, neuroblastoma foi a única GD2

+ neoplasia oi, ao mesmo tempo que também mostraram níveis mais elevados CD56 por célula (Tabela 2 e Figuras 1 e 2). Embora os tumores PNET mostraram um fenótipo que se assemelhava a de neuroblastoma (CD45

-, CD56

oi, CD90

+, CD9

+, CD81

+

nuMYOD1

– ,

numyogenin

– na ausência de B, T e marcadores associados mielóides), que foram negativos para o GD2, excepto para um com baixa expressão numa população pequena de tumor de 48%, e mostraram expressão forte de CD99

oi e CD271

oi (Tabela 2; Figuras 1 e 2)

Painel a:. mapa de calor resumindo a intensidade e padrão de expressão de diferentes marcadores em subtipos de diagnóstico distintos de tumores sólidos pediátricos com base na intensidade de fluorescência média por nível /célula. Painel B: Comparação da expressão de intensidade fluorescente média de marcadores individuais por /célula em diferentes subtipos da OMS de tumores sólidos pediátricos. Caixas de estender de 25 a 75º percentis, as linhas no meio representam valores medianos, enquanto linhas horizontais correspondem aos intervalos de confiança de 95%.

Com base nos mesmos painéis de triagem e caracterização (painéis 1 e 2 na Tabela S2, respectivamente), os quatro rabdomiossarcoma (RMS) mostrou uma específica

nuMYOD1

oi,

numyogenin

fenótipo oi. Além disso, casos de RMS foram também CD45

-, CD56

+ eis CD90

+ e CD57

-; duas expressa CD81

+, CD9

+ e CD58

+ e um foi parcialmente positiva para CD99 (40% das células tumorais), um padrão fenotípica que era específico para este subtipo de tumor (Tabela 2 e Figuras 1 e 2)

Os 8 amostras de tumores restantes corresponderam a 5 subtipos distintos de tumores (tumor de Wilms, 2 casos;. tumor de células germinativas, 3; carcinoma adrenal, carcinoma nasofaríngeo e hemangiopericytoma, um caso cada). expressão EpCAM forte era restrita aos dois carcinomas, enquanto as células hemangiopericitoma eram a única exibindo CD34

+ expressão oi; ambos os grupos de tumores sistematicamente faltava CD45, B- e marcadores de células T (Tabela 2 e Figuras 1 e 2). Por sua vez, todos os tumores de células germinativas apresentado com uma CD45 distinta

-, CD56

+, CD10

+, CD38

-, CD19

-, CD22

-, NG2

+ fenótipo, excepto para CD10 e NG2 que foram negativos em 1/3 casos (Tabela 2 e Figura 2). Por outro lado, os dois tumores de Wilms mostrou duas populações de células tumorais claramente distintas (coexistentes) com um CD56 comum

+ e CD58

+, CD45

-, CD99

-, GD2

-,

nuMYOD1

-,

numyogenin

-, CD10

– e NG2

– fenótipo, mas reactividade distinta (negativo em relação expressão positiva) para o CD90, EpCAM e CD57 (Tabela 2; Figuras 1 e 2).

No geral, estes resultados mostram que os subtipos de tumores pediátricos distintas foram associadas com fenótipos únicos e específicos.

NuMYOD1 e

expressão numyogenin era restrito a RMS (Figura 1J; Figura 2), CD99 foi expresso em níveis mais elevados significativas no PNET e uma subpopulação de (embrionárias) RMS (Figura 1I; Figura 2), enquanto forte reatividade para GD2 foi específico para o neuroblastoma (Figura 1H; Figura 2), e uma CD34

oi CD45

– fenótipo foi restrita ao caso hemangiopericytoma estudados (Figura 2). Outros marcadores menos específicos, tais como CD56, CD9, CD57, CD81, CD99 também contribuiu para alguns diagnósticos diferenciais, por exemplo, a distinção entre neuroblastoma e RMS (CD56, CD57, CD81) e entre PNET e ambas RMS (CD9) e neuroblastoma (CD99, CD56, CD81 e CD57) (Figura 1I-J; Figura 2)

Discussão.

câncer pediátrico decorre, principalmente a partir de precursores linfóides precoces e embrionárias mesenquimais e neuroectodérmicos precursores, que podem mostrar padrões morfológicos e histopatológicos semelhantes [3], [5] – [7]. Consequentemente, o diagnóstico da maioria dos tumores pediátricos frequentemente requer posterior caracterização das células neoplásicas, por exemplo, sobre motivos imunofenotípicos /imunocitoquímicos. Por sua vez, o diagnóstico rápido de tais casos é crucial, uma vez que influencia diretamente o processo de tomada de decisões tratamento e evolução do paciente [2], [3]. Portanto, a disponibilidade de técnicas rápidas para precisamente rastrear a linhagem de células tumorais e estabelecer os diagnósticos diferenciais relevantes, são na sua maioria bem-vindo.

Até agora, foram relatados poucos estudos que avaliam a utilidade de imunofenotipagem MFC para a triagem diagnóstica e subclassificação de tumores sólidos pediátricos [11] – [13], [27] – [28], [31], [35] – [39], [41], [48] – [51] Notável, um relativamente baixo (59%) taxa de concordância entre imunofenotipagem de-agulha fina espécimes aspirados por citometria de fluxo e análises citológicas convencionais tem sido relatada, devido a celularidade amostra de baixa [36]. Curiosamente, aqui obtivemos células viáveis ​​suficientes em todas as amostras analisadas, utilizando procedimentos de desagregação mecânica de amostras recém-obtidas e processadas, apoiando a noção de que a desagregação mecânica mantém a expressão de antigénio juntamente com uma viabilidade celular aceitável [16] – [18], [52 ].

de notar que nenhuma das amostras classificadas como reativas /inflamatória por critérios citológicos /histopatológicas foi diagnosticada como câncer pelo MFC. Por sua vez, todas as amostras de tumor, mas duas amostras de linfoma bastante incomum, foram identificados como contendo tumor pelo MFC. Os dois casos de falsos negativos observados pode dever-se à ausência de marcadores específicos para células de linfoma anaplásico (por exemplo, CD30) em nosso painel de triagem (painel 1 na Tabela S2) de Reed-Stenberg e e a uma frequência relativamente baixa e /ou a viabilidade destas células em suspensões de células individuais. prospectivo inclusão de marcadores adicionais (por exemplo, CD30) no painel de rastreio para a identificação destas células podem potencialmente superar esta limitação [53], [54].

Em pacientes pediátricos, MFC tem sido aplicada principalmente ao estudo de amostras PB e BM de pacientes suspeitos de sofrer de leucemia aguda. Apesar disso, os primeiros estudos em pacientes de neuroblastoma já mostrou infiltração BM de CD45

– /CD56

+ células tumorais, na ausência de proteínas que denotam o compromisso hematopoiéticas [29], [33]. Devido à frequência relativamente elevada de envolvimento metastático BM no neuroblastoma, este é de longe o tumor pediátrica não-hematopoiéticas principalmente estudada por MFC. Com efeito, o fenótipo de células de neuroblastoma foi avaliada em recorrente (3- ou 4-cor) única ou multicolor combinações de anticorpos tanto em BM e amostras de tecido de tumor [35], [48] – [51], [55]. No entanto, a maioria desses estudos foram destinadas a avaliar o mínimo de níveis de doença residual no BM de pacientes de neuroblastoma, sem explorar a utilidade de imunofenotipagem para o rastreio de diagnóstico e diagnóstico diferencial de neuroblastoma

vs.

Outros tumores pediátricos, como foi feito aqui

de todos os marcadores avaliados até agora em tumores sólidos pediátricos, CD56 (MACN) tem sido mais pesquisada [31] – [34].. Curiosamente, CD56 é expresso pela maioria dos tumores sólidos pediátricos [37] – [39], [51], como também encontrados em nossos casos. No entanto, a quantidade de expressão do CD56, em grande medida variou entre diferentes subtipos de tumor. Neuroblastoma e PNET foram aqueles tumores que apresentam os mais altos níveis CD56, suportando o utilitário de CD56 tanto para discriminar não-hematopoiéticas contra neoplasmas hematopoiéticos [31], [34], e para o diagnóstico diferencial entre subtipos distintos de CD45

– não hematopoiéticas tumores sólidos pediátricos. Da mesma forma, vários estudos avaliaram a utilidade de CD81 e CD9 (juntamente com CD45

– e CD56

+), para a discriminação entre células de neuroblastoma e células hematopoiéticas BM, para fins de teste [13], [48] – [49], [55], sem que se prolonga tal análise para outros subtipos de tumores sólidos pediátricos. Entre nossos casos, CD81 e CD9 mostrou um padrão variável e heterogêneo de expressão com utilidade limitada como marcadores individuais, no diagnóstico diferencial entre neuroblastoma e outros tumores pediátricos. No entanto, uma vez combinadas com outras moléculas, CD81 contribuiu para a discriminação de neuroblastoma e PNET. Apesar disso, GD2 e CD271 foram os dois marcadores mais úteis para diferenciar entre neuroblastoma (GD2

+ oi CD271

– /lo) e PNET (GD2

– /lo CD271

+ oi). No geral, estes resultados suportam a noção de que a CD271

expressão oi identificado em PNET pode estar associada com a origem em células estaminais mesenquimais destes tumores [56]. Interessantemente, no único paciente neuroblastoma que mostrou CD271

– /+ Lo células tumorais, a expressão CD271 foi restrito ao tumor primário, enquanto negativo em células metastáticas BM; este poderia ser devido a um diferente grau de maturação de células de tumor em ambos os locais, ausência de CD271 sendo associado a um comportamento mais agressivo do tumor e imaturo [57] – [58]. De nota, CD99 foi também altamente expresso no PNET, enquanto tipicamente negativa nos outros tumores, sugerindo que, além de CD271, CD99 pode também contribuir para o diagnóstico de PNET.

Poucos estudos imunofenot�icas MFC de RMS têm foi relatado até agora. Em linha com as nossas observações tais estudos mostraram que o RMS células geralmente exibem um CD45

-, CD56

+, CD90

+

numyogenin

+ fenótipo com expressão variável de CD57, desmina, vimentina e CD99 [31], [36], [39], [41].