Abstract

Fundo

características únicas de microambientes tumorais podem ser usados ​​como alvos de terapia do cancro. O translocador nuclear do receptor de hidrocarboneto de arilo (ARNT) é um mediador importante da progressão do tumor. No entanto, o papel funcional da ARNT no cancro tratados com quimioterápicos droga permanece incerto.

Metodologia /Principais Achados

Aqui, descobrimos que knockdown de ARNT em células cancerosas reduziu a taxa de proliferação e transformação capacidade dessas células. Além disso, a apoptose celular induzida por cisplatina foi melhorada em células ARNT-deficiente. Expressão de ARNT também diminuída na presença de cisplatina através de via de degradação do proteossoma. No entanto, o nível de ARNT foi mantida em células resistentes a fármacos tratados com cisplatina, o que impediu a apoptose de células de. Curiosamente, espécies reativas de oxigênio (ROS) aumentou dramaticamente quando ARNT foi derrubado em células cancerosas, aumentando a apoptose induzida por cisplatina. ROS promoveu a morte das células foi inibido em células tratadas com o sequestrante de ROS, N-acetil-cisteína (NAC).

Conclusões /Significado

Estes resultados sugerem que a actividade anti-cancro de cisplatina é atribuível aos a indução da produção de ROS por degradação ARNT. Segmentação ARNT podia ser uma estratégia potencial para eliminar a resistência a drogas em células de cancro

citação:. Shieh J-M, Shen C-J, Chang W-C, Cheng H-C, Chan Y-Y, Huang W-C, et ai. (2014) Um aumento de espécies reativas de oxigênio pela desregulamentação dos ARNT Melhora cancro morte celular quimioterápico droga-induzida. PLoS ONE 9 (6): e99242. doi: 10.1371 /journal.pone.0099242

editor: Yu-Jia Chang, Taipei Medicina da Universidade, Taiwan

Recebido: 17 de fevereiro de 2014; Aceito: 13 de maio de 2014; Publicação: 12 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Shieh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela subvenção NSC 102-2628-B-006-011-MY3 do Conselho Nacional de Ciência da República da China. Esta pesquisa foi apoiada em parte pela sede da University Avanço na Universidade Nacional Cheng Kung. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o translocador nuclear do receptor de hidrocarboneto de arilo (ARNT), também conhecido como factor indutível por hipoxia (HIF) -1β, é um factor de transcrição que pertence à hélice-volta-hélice Per-ARNT-Sim (bHLH -Pas família), tal como uma proteína endotelial PAS domínio 1 (EPAS1), HIF-1α, e receptor de hidrocarboneto de arilo (AHR) [1] – [3]. O ARNT forma um heterodímero com o HIF-1α em resposta à variação de níveis de oxigénio microambientes, e ainda promove a sobrevivência celular e angiogénese [4] – [6]. Além disso, a ruptura de ARNT em células estaminais embrionárias de ratinho provoca hipoglicemia, uma deficiência de angiogénese e a ausência de resposta a hipoxia [7]. Além disso, ARNT é um mediador em condições de normóxia quando as células enfrentam factores prejudiciais no microambiente, tais como a 2,3,7,8-tetra-clorodibenzo [b, e] [1], [4] -dioxin (TCDD) ou anti drogas -Câncer [8], [9]. O ARNT dimeriza com o receptor de hidrocarboneto de arilo (AHR) e regula a actividade de transcrição Sp1, após supra-regulação do promotor do citocromo P450 polipéptido da subfamília 1 (CYP1A1) para resistir às tensões xenobióticos, por exemplo, TCDD, [3]. Quando a regulação ARNT em células, que pode ser estabilizada através de interagir com a proteína BRCA1 TCDD durante o stress [10]. Por outro lado, a caspase-3 activa cliva o Arnt durante a apoptose para reduzir os sinais de sobrevivência celular [11]. Perda de HIF-1α e ARNT, também conduz a uma resposta aumentada para radioterapia, uma redução no crescimento do tumor, e diminuição da angiogénese em tumores transplantados em ratinhos imunodeficientes [12]. Em nossos estudos anteriores, verificou-se que ARNT interagiu com c-Jun para formar c-Jun /ARNT e c-Jun /ARNT /Sp1 complexos que promovam expressões da ciclooxigenase (COX-2), 12 (S) -lipoxygenase e p21

WAF1 /CIP1

, em fator de crescimento epidérmico (EGF) tenha sido tratada com células de câncer cervical em uma condição normóxica [1], [13]. Estes estudos indicaram que ARNT interage com HIF-1α em resposta a condições hipóxicas e também se liga com factores de transcrição específicos que possuem a capacidade de provocar a sinalização da tumorigénese em condições normóxicas.

Cisplatina é um importante fármaco quimioterapêutico usado com diversos tipos de cancros, especialmente do testículo, do ovário, cervical, esofágico, gástrico, da próstata, e cancros do pulmão de células não pequenas [14]. Depois de influxo para uma célula, a cisplatina é hidrolisado e torna-se a sua forma activa. Reticulação de cadeias de ADN ocorre por cisplatina activa ligação ao DNA em posição 7 da guanina que provoca a morte de células de cancro [15], [16]. Além de causar apoptose através da indução de libertação de citocromo c em resposta ao stress do ADN, a cisplatina também induz a apoptose de células causada por espécies de oxigénio reactivas (ROS) através de uma p38a MAP quinase mediada por p53 (MAPK) em HCT1116 células de cancro do cólon [ ,,,0],17]. ROS são constantemente gerados e eliminados durante o funcionamento fisiológico e biológico normal [18]. Durante o stress oxidante, tais como hipóxia ou estimulação xenobióticos, ROS pode ser eliminado por proteínas que limpam, tais como superóxido dismutase (SODs) e glutationa peroxidase. As células cancerosas apresentam uma maior tolerância de ROS do que as células normais. Um baixo nível de ROS facilita células cancerosas de condução genes associados a crescimento celular, mas um aumento da produção de ROS também faz com que as células a sofrer apoptose [19]. No entanto, as células cancerosas se adaptar a danos causados ​​por cisplatina por upregulating transportadores de efluxo, tal como o transportador de cassete de ligação a ATP (ABC). multirresistência 1 (MDR1) é membro de efluxo de drogas transportadores ABC que bombeiam drogas anti-câncer fora da membrana [20]. Além disso, a sobre-expressão de MDR1 permite que as células de carcinoma KB humanas para resistir eficazmente a colchicina, vinblastina, e doxorubicina [21]. drogas anti-câncer causar células cancerosas para adquirir resistência através da superexpressão de genes resistentes aos medicamentos. Portanto, compreender o mecanismo molecular envolvido na regulação da aquisição de resistência em células de câncer seria benéfico para a terapia eficaz.

Em nosso estudo anterior, verificou-se que ARNT interagiu com SP1 para regular a expressão MDR1 e células protegidas de cisplatina apoptose induzida por [9]. O efluxo ARNT-regulada de drogas também foi observado em células cancerosas upregulated-MDR1. Estes resultados revelam que ARNT é um dos reguladores para manter as células cancerígenas sobrevivência sob tratamento com cisplatina. Para prosseguir o papel potencial de ARNT na manutenção da sobrevivência de células, o efeito do nível de ARNT na eficiência quimioterapêutico foi estudada em vários tipos de cancro. Neste estudo, verificou-se que a desregulamentação dos ARNT não só reduziu a viabilidade celular, mas promoveu a morte celular induzida pela cisplatina através do aumento da produção de ROS. Estes resultados indicaram que ARNT poderia regular simultaneamente expressão MDR1 e reduzir o nível de ROS para proteger células cancerosas da apoptose induzida por drogas.

Resultados

O ARNT regula a proliferação de células cancerígenas

para esclarecer que ARNT é essencial para o crescimento de células de tumor, sob condições de normóxia, a proliferação celular foi determinada por um ensaio de incorporação de BrdU, sob uma condição ARNT-knockdown. Como mostrado na Fig. 1A, a taxa de proliferação celular foi significativamente reduzido em células siARNT. Os resultados de pulso-rotulagem de BrdU (20 min) e de sincronização de bloco de células de timidina mostrou que siARNT reduziu a síntese de ADN (Fig. 1B) e as células mantidas na progressão da fase S do ciclo celular (Fig. S1), respectivamente. Estes resultados sugeriram que ARNT regula a proliferação celular, possivelmente por meio do controle da progressão da fase S em normoxia.

células HeLa (A) foram transfectadas com 30 nM de oligonucleótidos e oligonucleótidos ARNT siRNA de encriptação (SC) por lipofecção. ensaio de incorporação de BrdU foi realizada como descrito em Materiais e Métodos. As barras de erro indicam a média + SD (n = 3). A significância estatística (*** P 0,001; ** P 0,01) entre o controlo e as células tratadas com oligonucleatides siARNT foi analisada por

t

teste de Student. células (B) HeLa foram transfectadas com 30 nM de oligonucleótidos e oligonucleótidos ARNT siRNA de encriptação (SC) por lipofecção e marcadas com BrdU 20 nM durante 20 min ou 24 h. As células foram fixadas e coradas com anticorpos anti-BrdU seguido de rato anti-FITC e DAPI. A percentagem de células cancerosas com uma coloração nuclear e de BrdU positiva foi calculada por contagem das células imunopositivas em quatro escolhido aleatoriamente. As barras de erro indicam a média + SD (n = 4). A significância estatística (*** P 0,001; ** P 0,01) entre as células tratadas com oligonucleatides controlo e siARNT foi analisada por

t

Student

Knockdown de inibe Arnt. transformação de células

com base nas conclusões de que Arnt expressão aumenta a proliferação de células de cancro, o efeito de ARNT na proliferação de células foi ainda confirmada utilizando um ensaio de formação de colónias. Como mostrado na Fig. 2A, embora o tamanho não foi consistente com as células parentais, números de colónia diminuição mais evidente em células ARNT-deficiente. Também foi observada a taxa de proliferação reduzida de células deficientes em Arnt (Fig. S2). Curiosamente, verificou-se que o crescimento das células foi inibido shARNT sob condições de cultura 3D-(Fig. 2B), mas não em condições 2D-cultura (Fig. 2a). Estes resultados indicaram que a depleção de ARNT reduzida a capacidade de transformação celular por células cancerosas.

(A) Sob uma condição normóxica, células parentais A375 (P), células shLacZ (Z), e as células ARNT-silenciados ( shARNT # 1 e # 2) foram incubadas em meio de cultura fresco em condições normóxicas. Após 7 dias, as células foram fixadas e coradas com corante de Giemsa. A experiência foi realizada por ensaio de formação de colónias. (B) A depleção de ARNT inibe a transformação celular em células cancerosas. As células foram semeadas em placas de a camada superior de meio de agar. Após incubação durante 3 semanas com meio suplementado, as células foram fixadas e coradas com Giemsa. A experiência foi realizada por ensaio de agar mole. Foram obtidos resultados semelhantes em três experiências independentes.

ARNT-knockdown leva as células resistentes a fármacos a ser mais sensível a cisplatina

Entre os fármacos quimioterapêuticos, a cisplatina induz a morte de células através da formação de cisplatina adutos de DNA que levam a danos no ADN e prejudica a progressão da fase S. A possibilidade de que ARNT controla a proliferação celular através da regulação da progressão da fase S nos levou a examinar se produziu qualquer efeito sobre a morte celular induzida pela cisplatina. Para esclarecer a importância da ARNT na regulação da resistência a cisplatina, foi utilizado um par de células, HONE-1 e (HONE-1 células resistentes à cisplatina) Hone-1-C15. Arnt linhas celulares estáveis ​​knockdown foram geradas por transfecção de forma estável de afiar-1 e de afiar-1-C15 linhas de células com o vector shARNT (Fig. S3). Como mostrado na Fig. 3, a apoptose induzida por cisplatina foi mais significativo nas células shARNT do que nas células parentais de afiar-1. Além disso, a cisplatina causou menos a morte celular em células-C15 Hone-1 do que nas células de afiar-1, mesmo com um tratamento de alta concentração. No entanto, as células de afiar-1-C15 perderam a sua capacidade de resistência numa condição ARNT-knockdown (Fig. 3). Sob o tratamento com cisplatina, a ARNT também foi degradado em células parentais de afiar-1, mas não em células de afiar-1-C15 resistentes (Fig. 4). A cisplatina promovido mais a activação de caspase-3 em células de afiar-1 mas não nas células-C15 Hone-1, mesmo quando uma maior concentração de cisplatina foi aplicado a pedra de afiar-1-C15 células (Fig. 4). No entanto, ambas as células-C15 HONE-1 HONE-1 e tornou-se mais sensível a cisplatina quando ARNT era deficiente (Fig. 4). Estes resultados confirmaram que a expressão de ARNT é um importante fator regulador resistência aos medicamentos por células cancerosas.

Hone-1 células shLacZ (Z), aprimorar-1 células ARNT com deficiência (shARNT), HONE-1-C15 shLacZ células (Z), e aprimorar-1-C15 células ARNT com deficiência (shARNT) foram tratados com ou sem cisplatina (20 mM cisplatina para HONE-1 células shLacZ e aprimorar-1 células ARNT com deficiência; 80 e 100 M cisplatina para HONE -1-C15 shLacZ células e células deficientes ARNT-1-C15-HONE) durante 24 h. As células apoptóticas foram examinados por coloração com anexina V-FITC /iodeto de propídio (PI), e citometria de fluxo foi usada para analisar a apoptose celular. A relação foi calculada por apoptose. * Apoptose tardia; # Apoptose precoce. Foram obtidos resultados semelhantes em três experiências independentes.

células de afiar-1 foram transfectadas com 50 nM ou 50 nM siARNT controlo negativo discrição RNAi (SC) durante 24 h e tratados com ou sem cisplatina (60 uM para afiar-1 células e 80 pM para afiar-1-C15 células) em meio de cultura fresco durante 24 h. A proteína total (incluindo células vivas e células mortas) foi extraída e analisada com transferência de Western e detectado com ARNT, caspase-3, e anticorpos alfa-tubulina. Foram obtidos resultados semelhantes em três experiências independentes.

fármacos quimioterapêuticos induzem degradação ARNT e apoptose celular

Para clarificar o mecanismo envolvido na downregulation de ARNT em células sensíveis tratadas com cisplatina, de expressão ARNT foi adicionalmente examinada em várias linhas celulares de cancro. Como mostrado na Fig. 5A, a cisplatina não produziu qualquer efeito sobre o nível de transcrição ARNT mensageiro (m) ARN. No entanto, a desregulação induzida por cisplatina ARNT inverteu-se em células tratadas com um inibidor de proteassoma (Fig. 5B). Estes resultados mostraram que a cisplatina desencadeada degradação ARNT através de vias dependentes do proteassoma em células sensíveis. Curiosamente, a desregulação induzida por cisplatina ARNT também pode ser invertida quando diferentes tipos de células cancerosas foram pré-tratadas com o sequestrante de ROS NAC (Fig. S4). Estes resultados revelaram que a produção de ROS, pelo menos, é uma das causas para eliminar ARNT em células de câncer tratados com cisplatina. Para examinar melhor se também é necessária a desregulação de ARNT para outros fármacos quimioterapêuticos, tais como o taxol e doxorrubicina para induzir a morte celular, as células resistentes à cisplatina HeLa e HeLa (HeLa R) foram tratados com estas drogas, e as expressões de ARNT e ADN fragmentado foram estudados . A doxorrubicina e taxol inibida expressão ARNT e aumento no DNA fragmentado em células HeLa (Fig 5C . 5D). No entanto, a expressão de ARNT não foi alterado em células HeLa R depois do tratamento com taxol ou doxorrubicina (Fig. 5C), e estes resultados foram consistentes com a falta de ADN fragmentado observada em células HeLa R (Fig. 5D). Além disso, as linhas celulares shARNT também foram mais sensíveis a cisplatina induzida por morte celular (Fig. 3). Estes resultados sugeriram que ARNT desempenha um papel central na contribuição para a resistência de células de cancro para diversas drogas quimioterapêuticas. Também descobrimos que o inibidor de caspase, zVAD, bloqueou a expressão de p53, e a activação de caspase-3 nas células tratadas com cisplatina (Fig. 5E). Curiosamente, a desregulação induzida pela cisplatina de ARNT foi restaurado em zVAD trataram células HeLa sensíveis (Fig. 5E). Além disso, a activação induzida por cisplatina de caspase-3, a depleção de ARNT, e um aumento da p53 foram revertidas em células pré-tratados com NAC (Fig. S4). Estes resultados indicaram que a activação induzida por cisplatina de caspase-3 mediada por a expressão de ARNT e p53. ZVAD bloqueado caspase-3 e resgatado ARNT expressão em células sensíveis tratados com cisplatina, o que sugere que a activação de caspase-3 é essencial para a morte celular induzida por cisplatina em células sensíveis.

células HeLa (A) foram tratados com cisplatina 24 h. O ARN total foi extraído por PCR de transcrição-reversa com ARNT e iniciadores GAPDH. células (B) HeLa foram tratadas com 10? M MG132 ou 1 uM lactacistina por 4 h, seguida de cisplatina durante 36 h. Expressão de ARNT e actina foram analisados ​​por análise de transferência de Western utilizando anti-ARNT e anticorpos anti-actina. células (C) e HeLa helar foram tratados com várias concentrações de taxol e de doxorrubicina durante 24 h. As manifestações de ARNT e actina foram detectadas por análise de transferência de Western utilizando anti-ARNT e anticorpos anti-actina. (D) Depois de 30 uM tratamento com cisplatina de células HeLa e células HeLa R, fragmentação de ADN apoptótico foi determinada como descrito em “Materiais e Métodos”. (E) As células foram transfectadas com 30 nM de oligonucleótidos e oligonucleótidos ARNT siRNA mexidos (SC) por lipofecção. Após o tratamento zVAD 30 uM durante 30 min seguido por 30 uM de cisplatina durante 36 h, foram preparados e sujeitos a SDS-PAGE e analisados ​​por transferência de Western com anticorpos contra ARNT, pro-caspase-3, caspase-3, p53, e actina lisados ​​de células . Foram obtidos resultados semelhantes em três experiências independentes.

O aumento em células ROS em ARNT-knockdown contribui para a apoptose induzida por cisplatina

Além desregular bombas de efluxo, um aumento na nível de ROS é outra forma de medicamentos quimioterápicos para induzir a apoptose. Como mostrado na Fig. S4, esgotamento de ROS inibiu drasticamente a apoptose celular induzida por cisplatina. Para esclarecer melhor o mecanismo envolvido na resistência à cisplatina ARNT-regulada, foi examinado o papel das ROS na morte celular induzida pela cisplatina. Primeiro, identificamos a quantidade de ROS em parental (P), shLacZ (Z), e as células shARNT. Curiosamente, verificou-se que ROS era, obviamente, maior em células deficientes em ARNT do que em células progenitores, sob condições de normóxia (Fig. 6 e Fig. S5a). O aumento das ROS foi reduzida nas células tratadas com shARNT NAC (Fig. S5A). Além disso, a quantidade de ROS aumentada por cisplatina foi eliminado em células tratadas com NAC (Fig. S5B). A cisplatina também induziu uma maior produção de ROS nas células shARNT (Fig. S5C), e a quantidade de ROS foi reduzida nas células tratadas com NAC. Estes resultados sugerem que a expressão de ARNT inibiu a produção de ROS aumentada pela cisplatina. Para esclarecer se o aumento em células ROS em shARNT desempenha um papel na apoptose induzida por cisplatina, NAC foi usada para esgotar ROS, e a razão de apoptose foi analisada. Como mostrado na Fig. 7, NAC inibiu significativamente a morte celular induzida por cisplatina em células shARNT (Fig. 7). Estes resultados revelaram que ARNT protegido células cancerosas de apoptose induzida por cisplatina, pelo menos, através da redução da produção de ROS nas células.

A375 parental e shARNT células foram incubadas sob condições de normóxia e durante a noite manchado com carboxi-DCFDA para monitorar ROS Produção. FL1 fluorescência indicado o valor de fluorescência de carboxi-2 ‘, 7’-diclorofluoresceína diacetato (carboxi-DCFDA). Foram obtidos resultados semelhantes em três experiências independentes.

As células foram pré-tratadas com 10-acetilcisteína (NAC) durante 1 h antes de A375 células parentais (P), células shLacZ (Z), e as células-ARNT silenciados (shARNT # 1 e # 2) foram tratadas com 5 uM de cisplatina, e, em seguida, foram incubadas durante 24 h. As células apoptóticas foram examinados por coloração com anexina V-FITC /iodeto de propídio (PI), e citometria de fluxo foi usada para analisar a apoptose celular. A relação foi calculada por apoptose. * Apoptose tardia; # Apoptose precoce. Resultados semelhantes foram obtidos em três experiências independentes.

Discussão

Cancro aplicações terapêuticas, como o tratamento radical combinada com drogas quimio-terapêuticas mediadas por indução de ROS, são as principais maneiras de eliminar células de câncer [22]. No entanto, as células cancerígenas são capazes de resistência aos danos causados ​​por apoptose induzida por ROS através de vias anti-apoptóticas alternativos, tais como Akt, Kras, BRAF e Myc [23], [24]. Neste estudo, demonstramos que ARNT conferiu uma capacidade anti-apoptose em células cancerosas tratadas com o anti-câncer droga, a cisplatina. Além disso, a cisplatina produziram uma maior geração de ROS nas células ARNT-knockdown, resultando no aumento da morte celular. Similar aos nossos achados que Arnt protegidas contra os danos celulares, reduzindo os níveis de ROS, células de leucemia foram sensíveis a troglitazona que também induz a apoptose através de ROS intracelular [25]. células de leucemia resistentes exibiu uma abundância de ARNT e também seguiu a regulação positiva de SODs (SOD2), fator de fator nuclear eritróide 2 relacionados com 2 transcrição (Nrf2), e concentração de glutationa intracelular [25]. SOD2 reduz antioxidantes e Nrf2 aumenta a atividade das enzimas antioxidantes [25]. Além disso, Nrf2 regula a transcrição de mir125b para inibir a Ahr repressor (AhRR), que protege o rim de lesão aguda [26]. Isto indica que a formação de AhR /complexos Arnt pode ser regulamentada por mir125b [8]. Estes resultados sugerem que ARNT pode regular a expressão SOD2 ou formação de complexos ARNT /AhR para reduzir a lesão celular causada pelo aumento da ROS.

Quanto à regulação da ARNT, descobrimos que a cisplatina pode inibir a ARNT em alguns aspectos desconhecidos. ARNT foi degradado de uma maneira dependente da dose em células não resistentes tratados com cisplatina. meia-vida de ARNT parece ser importante para a apoptose causada pela cisplatina. Por exemplo, os inibidores do proteassoma, tais como MG132 e lactacistina, bloqueou a degradação de ARNT causado pela cisplatina. No entanto, as linhas celulares de cancro resistentes a cisplatina mostraram que a estabilidade ARNT não foi alterada durante o tratamento com cisplatina. Estas células cancerosas com níveis constantes Arnt também mostraram uma boa capacidade para evitar que a capacidade da apoptose. Estes resultados correspondem a um estudo anterior em que ARNT interrupção foi correlacionada com a degradação proteossómica através do processo de ubiquitinação [27]. Consistente com as nossas descobertas de que ARNT foi empobrecido por drogas anti-câncer, ARNT também foi degradada por curcumina em condições de normóxia e de hipóxia em vários tipos de células de cancro [27]. Além disso, a expressão de ARNT pode ser restaurada por tratamento com NAC, um eliminador de ROS, na presença de curcumina. Estes resultados são consistentes com os nossos resultados que a NAC resgatados a expressão de ARNT em células sensíveis tratadas com cisplatina. O ARNT também pode ser interrompido usando H

2O

2 em células de câncer [27]. Além de ROS e consistente com o facto de que a caspase-3 e caspase-9 também clivar ARNT no local de aminoácido Asp 151 in vitro [11], verificou-se que a degradação induzida por cisplatina de ARNT foi reprimida após o tratamento com o inibidor de caspase zVAD. Assim, as caspases activadas com cisplatina pode provocar a desregulação de ARNT em células sensíveis a fármacos mas não de células resistentes. fármacos quimioterapêuticos, tais como o taxol e doxorrubicina, respectivamente, também pode induzir apoptose de células de cancro por meio de caspase-10 e as vias de p53 [28], [29]. Neste estudo, o taxol e doxorrubicina também reforçada degradação ARNT, resultando na apoptose de células sensíveis. Estes resultados revelaram que ARNT é um fator essencial na proteção das células cancerosas contra os danos induzidos por drogas. Um estudo prévio revelou também que a clivagem de ARNT reforçada pela hipóxia induzida caspase activa, e esta regulada negativamente a actividade de transcrição de genes de sobrevivência induzidas pelo HIF [27]. A produção de ROS é um dos efeitos, através do qual a cisplatina causa a morte das células [17]. Também foi relatado que o miR-24 induzida por ROS faz com que a depleção de ARNT no nível de proteínas em linhas celulares de carcinoma hepatocelular humano [30]. Tomados em conjunto, ROS pode ser induzida por esgotamento de ARNT, em seguida, produz ainda um regulador negativo da ARNT por indução de mirRNA. Por esta razão, a prevenção da degradação ARNT no tratamento inicial de drogas é importante para a sobrevivência das células cancerosas. No entanto, se o ROS induzida miR-24 é a causa da supressão de ARNT em células tratadas com cisplatina iria ser investigado nos nossos estudos posteriores. Embora o mecanismo envolvido na regulação positiva de nível ROS induzida pela depleção de ARNT não era claro e iria também ser investigada, especulamos que a repressão de ARNT poderia ser um dos mecanismos responsáveis ​​pela alteração do nível de ROS na morte celular induzida por cisplatina.

de um modo geral, ARNT pode interagir com o HIF-1α para regular os genes envolvidos na promoção de angiogénese, interagir com a c-Jun e SP1 para modular a expressão de MDR1, ou regular a expressão induzida por EGF da COX-2, 12 (S ) -lipoxygenase e p21

WAF1 /CIP1

, que sentir a mudança do componente microambiental [1], [13]. ARNT também desempenha um papel fundamental na regulação de progressão tumoral, desintoxicação, e o efluxo de drogas anti-cancro, o que aumenta a possibilidade de sobrevivência em circunstâncias adversas, [3], [8], [9], [24]. No tratamento quimioterapêutico de cancro, a cisplatina se acumula nas células cancerosas que causam danos no ADN e induz a apoptose. A bomba de efluxo de droga, MDR1, é sobre-regulada por ARNT para prevenir a apoptose induzida por cisplatina [9]. Além de regular a resistência aos medicamentos em estudo anterior, ARNT também protege células contra a toxicidade do microambiental. Por exemplo, o complexo Ahr /ARNT detecta toxinas ambientais e regula vias responsáveis ​​para a desintoxicação. Por exemplo, TCDD induz numerosos genes mediadas pelo complexo Ahr /ARNT, tais como citocromo P450 1A1 (CYP1A1), que pode desintoxicar de compostos aromáticos policíclicos [8], [31]. Neste estudo, descobrimos que ARNT desempenha outro papel na regulação negativa da ROS para evitar células cancerosas sofreram danos devido a tratamento com cisplatina. Tomados em conjunto, nós especulamos que a ARNT é um mediador central para eliminar citotoxicidade animado por fatores ambientais.

Em conclusão, nossos resultados revelaram que a depleção de ARNT promovido no efeito das drogas anti-câncer sobre a morte de células cancerígenas. Em nosso entendimento, havia pelo menos dois mecanismos envolvidos na resistência aos medicamentos ARNT-causado: MDR1 regulação positiva [9] e prevenção da produção de ROS. Embora o mecanismo envolvido na regulação da produção de ROS por expressão ARNT permanece desconhecida, desenvolvimento de antagonistas visando o ARNT pode fornecer novas estratégias para destruir as células cancerosas resistentes.

Materiais e Métodos

As culturas de células

As linhas celulares de melanoma humano maligno (A375) e câncer cervical humano (HeLa) foram adquiridas da American Type Culture Collection. As células humanas de nasofaringe de carcinoma (HONE1 e aprimorar-1-C15) foram gentilmente cedidas pelo Dr. Jane-Yang Chang (Institutos Nacionais de Pesquisa em Saúde, Taiwan) [32]. A375 e linhas de células HeLa foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com glucose a 1% (Gibco). Hone-1 células e sua variante resistente a cisplatina derivado, HONE-1-C15, foram mantidas em meio RPMI 1640 (Gibco). Todas as linhas celulares foram suplementados com 10% de soro fetal bovino (FBS, Hyclone), 100 ug /ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich), e 100 U /ml de penicilina (Sigma-Aldrich) em meio de cultura e incubou-se com 5% de CO

2 a 37 ° C durante a manutenção. células de afiar-1-C15 resistentes à cisplatina foram mantidas em meio contendo 15 pM de cisplatina. As linhas de células A375-ARNT deficientes eram linhas celulares estáveis ​​independentes infectadas com lentivírus ARNT derivadas de vectores pequeno gancho de cabelo (SH) de ARN [9]. Pedra de afiar-1 e linhas de células deficientes em Hone ARNT-1-C15 linhas celulares estáveis ​​foram infectadas com lentivírus derivadas de vectores ARNT shRNA [9]. horários de resistência a drogas foram usadas para desenvolver as sublinhas resistentes a cisplatina [9]. As células HeLa foram expostas a cisplatina, durante um período de 9 meses. A sub-linha de resistência obtido por este processo é designado como HeLa R.

exclusão de tripano azul ensaio

As células foram colocadas em placa a 5 x 10

4 por poço em placas de 24 poços. Depois as células foram deixadas a ligar durante a noite, o meio foi substituído com meio fresco com ou sem cisplatina. As células foram incubadas a 37 ° C sob uma condição hipóxica humidificada (1% O

2) por um adicional de 24 h e tripsinizadas para ressuspender-los em meio contendo soro. Tripano corante azul em 20 ul e 20 ul de uma suspensão de células foram misturados para medir o número de células vivas (com um factor de diluição de 2). As células coradas foram contadas e consideradas como células mortas.

Bromodeoxiuridina (BrdU) ensaio de incorporação

a síntese de DNA em células em proliferação foi detectada por incorporação de BrdU (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). knockdown células parentais e Arnt foram espalhadas em placas de 96 poços e incubou-se durante 24 h. 5-bromodesoxiuridina (BrdU) reagente foi adicionado ao meio de cultura durante 0 a 48 h, a 100 ul de solução fixadora foi adicionado às células durante 30 min. As células foram lavadas com tampão de lavagem e incubou-se durante 1 h com anticorpo BrdU 100 ul de 1 x. Após a adição de solução de HRP-conjugado de 100 ul de 1 x durante 30 min, foi adicionado 100 uL de solução de substrato TMB. Após 30 minutos de incubação, foi adicionada a solução de paragem. A OD foi medida a 450 nm utilizando um leitor de placas. Para imunof luorescência, as células transfectadas com 30 nM de oligonucleótidos ARNT siRNA foram marcadas com impulsos com BrdU 20 nM durante 20 min ou 24 h. As células foram fixadas e coradas com anticorpos anti-BrdU seguido de rato anti-FITC e DAPI. A percentagem de células cancerosas com uma coloração nuclear e de BrdU positiva foi calculada por contagem das células imunopositivas em quatro escolhidos aleatoriamente utilizando o software Image J..

Colónia ensaio de formação de

As células foram plaqueadas como células individuais separadas em seis placas de cultura celular -Bem. Depois as células foram deixadas a ligar durante a noite, as células foram tratadas com ou sem 1 ^ M de cisplatina durante 8 h e o meio foi mudado para meio de cultura fresco. O meio de cultura foi mudado a cada 2 dias. Após incubação durante 7 dias, a colónia de células foi lavada duas vezes com PBS e fixadas com paraformaldeído a 4% (PFA, Sigma-Aldrich). Metanol (JT Baker) foi usada para aumentar a penetração de células e corante de Giemsa (Sigma-Aldrich) foi usado para a coloração de células. número de colónias foram determinados com o software Image J. [33]. A formação de colónias foi confirmada, pelo menos, por três vezes.

ensaio de agar mole

DMEM-elevado teor de glucose contendo FBS a 10% com 0,5% de agarose foi plaqueada na parte inferior (1,5 ml /poço) de placas de 6 poços. Após o ágar basal tinha congelado, 5 × 10

3 células foram ressuspensas em DMEM de alto teor de glucose contendo FBS a 10% com 0,25% de agarose e em camadas no topo (1,5 ml /poço) de placas de 6 poços. As células foram incubadas com 0,5 ml de meio suplementado após a camada superior de agar tinha congelado. O meio de cultura foi mudado a cada 2 dias. Após incubação durante 2 semanas, as células foram lavadas duas vezes com PBS e fixadas com PFA a 4%. O metanol foi utilizado para aumentar a penetração de células, e Giemsa foi usada para coloração de células. A formação de colónias foi confirmada, pelo menos, por três vezes.

A transcrição reversa-PCR (RT-PCR)

ARN celular foi extraído por Trizol reagente (Invriogen) e seguido por manuscrito. Dois RNA ug foi revertida por IMPROM-II ™ de transcriptase reversa (Promega) e utilizado para o molde de ADNc de reacção em cadeia da polimerase (PCR). 50 ng de modelo de cDNA foi usada para PCR com 2,5 U de DNA polimerase Tag (Bio MD, Taiwan) [34]. Os conjuntos de iniciadores foram utilizados como se segue: ARNT (F): 5′-TGGGTCCAGCCATTGCCTCT-3 ‘, ARNT (R): 5′-CGAGCCAGGGCACTACAGGT-3′, GAPDH (F): 5’-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3 ‘, GAPDH (R ): 5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3 ‘. As reacções de PCR foram, em seguida, electroforese em 2% de gel de agarose LE SeaKem (Lonza, ME, EUA).

análise Western blot

As células foram colhidas com RLCC ou 1x tampão RIPA (10 mM de tampão Tris a pH 6,5, NaCl 150 mM, EDTA 50 mM, 1% de DOC, e 1% de NP-40 contendo inibidores de protease).