Abstract
Fundo
O cancro do pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer no mundo todo. carcinoma do pulmão de não-pequenas células (NSCLC) representa a maioria dos casos de câncer de pulmão e o prognóstico dessa doença continua pobre apesar de décadas de intensa investigação. Assim, novos insights sobre os mecanismos subjacentes pelos quais NSCLC desenvolve são avidamente necessária como base para o desenvolvimento de novas linhas de estratégias terapêuticas. A última década testemunhou um interesse crescente sobre os papéis reguladores de micro RNAs em diversas categorias de doenças malignas. dados relacionados tem sido bem documentada na carcinogênese e fisiopatologia de uma variedade de doenças malignas. Mesmo assim, há uma relativa falta de dados sobre os papéis de miR-144 em biologia do tumor e não houve nenhum relatório mostrando o envolvimento de miR-144 em desenvolvimento NSCLC.
Métodos /Finding principal
a partir de amostras de tecido de tumores humanos com NSCLC e amostras de cultura de células, observou-se que a expressão de miR-144 está associada com o fenótipo maligno de NSCLC. Investigações posteriores mostraram que ectópica mir-144 expressão inibe drasticamente o crescimento de células de tumor NSCLC e induz a apoptose manifestada por marcadores proteicos apoptóticos elevados e mudança citometria de fluxo. Além disso, também descobrimos que a expressão da proteína ZFX também está associada com fenótipo maligno de NSCLC e knockdown de proteína resulta ZFX em um efeito semelhante ao da ectópica expressão de miR-144. Finalmente, descobrimos que a expressão ZFX é altamente ajustável mediante presença de mir-144 e expressão ectópica de ZFX amortece dramaticamente mir-144 acção de inibição de tumor.
Conclusões
Nossos resultados para o primeiro tempo mostrou via mir-144-ZFX está envolvido no desenvolvimento de NSCLC, que lança uma luz de novas investigações sobre os mecanismos subjacentes em direção a uma melhor compreensão e gestão das NSCLC
Citation:. Zha W, Cao L, Shen Y, Huang M (2013) Papéis de Mir-144-ZFX Pathway na regulação do crescimento de Non-Small-Cell Lung Cancer. PLoS ONE 8 (9): e74175. doi: 10.1371 /journal.pone.0074175
editor: Alfons Navarro, da Universidade de Barcelona, Espanha |
Recebido: 16 de abril de 2013; Aceito: 29 de julho de 2013; Publicação: 16 de setembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Zha et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos principais Científica Nacional e Projeto especial Tecnológico para “significativo Novas Drogas Desenvolvimento” (2011ZX09302-003-02). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o cancro do pulmão é a principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. carcinoma do pulmão de células não pequenas (NSCLC) é responsável por cerca de 80% do total de casos de cancro do pulmão. Além disso, esta doença é notoriamente devastador em fase avançada [2]. Assim, uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento NSCLC é avidamente necessário como base para identificar novos alvos terapêuticos e desenvolver novas estratégias para o tratamento destas doenças.
MicroRNAs são ubiquamente expressa pequenos RNAs que exercem negativo efeitos reguladores na expressão do gene a um nível pós-transcricional [3], [4]. Dado o facto de microARNs teoricamente atingir qualquer ARNm, é provável que microARNs possuem um espectro muito amplo funcional que inclui a regulação do ciclo celular, crescimento celular, apoptose, diferenciação celular e resposta ao estresse [5] – [9]. Consistente com esta noção, não é nenhuma surpresa que microRNAs são amplamente envolvidos no desenvolvimento do câncer humano. Embora muitos miRNAs foram relatados para ser envolvido na etiologia e patogénese do cancro, visando oncogenes ou supressores de tumor [10] – [12], os estudos sobre os papéis dos miRNAs no desenvolvimento do câncer ainda estão em um estágio inicial
recentemente, há um interesse crescente de pesquisa sobre o papel do microRNA-144 em tumorigênese e tratamento do câncer. Vários grupos de pesquisa reportaram a sub-regulação de miR-144 em diferentes tipos de cancros, incluindo mesotelioma osteossarcoma e que implicavam miR-144 como um potencial supressor de tumores [13], [14]. Mais especificamente, um estudo recente revelou uma correlação inversa entre o nível de mir-144 e ao desenvolvimento de câncer gástrico [15]. Dois artigos recentes do grupo de Courtney mostrou que knockdown DCAMKL-1 pode aumentar microRNA-144 que por sua vez contribui para a inibição do cancro colo-rectal e cancro pancreático [16], [17]. No entanto, também existem relatórios contradictive. Como para o cancro colo-rectal, um outro grupo relatado um nível elevado de miR-144 em fezes humanas e tecido de cancro [18]. Um relatório do Fu et al afirmaram que mir-144 promove a proliferação celular, migração e invasão no carcinoma da nasofaringe através da repressão de PTEN. A função de miR-144 em tumorigênese e desenvolvimento câncer parece ser complicado e altamente específico do tecido [19].
Até o momento, com o melhor de nosso conhecimento, não houve nenhum papel de relatório dirigido especificamente o papel de miR-144 em câncer de pulmão. No entanto, existem vários trabalhos mais exigentes a importante função de mir-451, outro microRNA compartilhando o mesmo local com mir-144, na tumorigênese e desenvolvimento de câncer de pulmão [20] – [23]. Mir-451 tem sido relatada a ser reprimidos no cancro do pulmão, e em uma relação inversa com a ocorrência de doenças e desenvolvimento. Dado que o conjunto de unidades de miARN são geralmente transcritos coordenadamente, os autores sugerem que o miR-144 de nível também é menor no cancro do pulmão [24], [25]. Curiosamente, um artigo recente relatou uma expressão de miR-144 regulado por baixo em sangue total de pacientes com adenocarcinoma de pulmão [26]. Esses dados nos impelidos a hipótese de que a expressão de miR-144 também é regulada no cancro do pulmão, e tem uma função inibitória sobre a proliferação e metástase de células de câncer de pulmão.
O zinco dedo X-cromossômica proteína (ZFX) pertence à família de proteínas ZFY [18] e é um dos poucos genes no cromossoma X humano que são conhecidos para escapar X inactivação. Estudos prévios demonstraram que ZFX tem um papel importante na auto-renovação e manutenção de ambas as células estaminais embrionárias e as células-tronco hematopoiéticas [27] – [30]. Alguns relatos mostraram que ZFX serve como um alvo para miR-144 e exerce efeitos reguladores sobre o crescimento de tumores [31], [32]. No entanto, ainda é a falta de dados sobre o papel do ZFX sobre o comportamento do câncer de pulmão e mir-144-ZFX caminho nunca foi relatado no contexto das NSCLC.
Materiais e Métodos
Reagentes e anticorpos
kits de expressão Micro-RNA para mir451 (001.105), mir144 (002.676) e RUN48 (001.006) foram adquiridos da Applied Biosystems. Obteve-se anticorpo citocromo c (6H2) a partir de Santa Cruz Biotechnology. O anticorpo anti-ZFX (ab85483), anti-caspase 3 anticorpo (ab44976) e anticorpo anti-GAPDH (ab9485) foram adquiridos a Abcam. Trizol Reagentes foi adquirido de Invitrogen. Gene Expression Assay Kits TaqMan foram adquiridos à Applied Biosystems (Hs01017881_m1 para ZFX e 4.308.313 para GAPDH). Outros reagentes incluem reagentes Lipofectamine 2000 (Invitrogen), sistema de detecção de mancha ocidental SuperSignal substrato (Pierce, EUA), goiaba nexina Reagente (Millipore). Meio RPMI 1640 e soro fetal de bovino foram comprados a partir Kit Xangai Haoran Biotecnologia Co. Ensaio de Luciferase e PMIR-relatório do sistema foram adquiridos a Applied Biosystems. β-Gal Assay Kit foi adquirido de Invitrogen (nº catálogo K1455-01.). kit ZFX-ELISA Humano (CSB-EL026467HU) foi comprado de CUSABIO BIOTECH CO., Ltd., China. Todos os outros produtos químicos foram adquiridos a partir de fontes comerciais, ao mais alto grau de pureza disponível.
cultura celular
A549, CRL-5875 e HTB-183 linhas de células foram adquiridos a partir de ATCC (American Type Culture Collection) através a agência de Beijing Zhongyuan Limited, Pequim, China. O 16HBE14o
– linha de células (célula epitelial brônquica humana normal) é uma oferta generosa do Dr. Dieter Gruenert (Universidade da Califórnia, San Francisco) [33]. Todas as células foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal de bovino (10%), 1% de aminoácidos não essenciais e penicilina-estreptomicina foram adicionados. As células foram cultivadas em câmara úmida a 37 ° C com 5% de CO
2.
Ética declaração
Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Institutional Review Board da província de Jiangsu Medical Association. A informação foi dada aos pacientes e consentimento escrito foi obtido para todas as amostras de doentes.
plasmídeo construção
Para construir pré-mir-144, um fragmento de DNA contendo a 86-bp hsa- miR-144 precursor (mais 100 pb a montante e 100 pb a jusante) foi amplificado a partir de ADN genómico de células 16HBE14o- e clonado em pcDNA (+) 3.1 (Invitrogen), que é modificado para a resistência a puromicina. Para expressar ectopicamente ZFX, a sequência de codificação de ADN do fragmento ZFX foi multiplicado por RT-PCR e clonado no vector pBABE-neo.
Para o ensaio de luciferase, foi utilizado PMIR-relatório do sistema (Applied Biosystems). Os plasmídeos (PMIR-report-Luciferase-ZFX-3′-UTR e os seus mutantes) foram construídas por métodos seguintes. A 3’UTR do ZFX foi amplificado por RT-PCR. Os iniciadores para a PCR são: gcgcaagcttcaatacttctacagaacg e gcgcgagctccctatatgcaccagtgac. O produto amplificado foi subclonado no vector PMIR-report-luciferase entre os sítios HindIII e SacI. QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) foi utilizado para gerar o plasmídeo PMIR-report-Luciferase-ZFX-3′-UTR-mutante, utilizando os iniciadores seguintes: 5′-cgtgtataGCAGgtttgcct-3 ‘e 5′-aggcaaacCTGCtatacacg-3’. Um plasmídeo que codifica β-galactosidase (PMIR-relatório de controlo β-Gal) foi usado para normalizar a variabilidade devido a diferenças na viabilidade das células e a eficiência de transfecção.
Para knockdown expressão ZFX, ZFX shRNA plasmídeo foi construído. Os fragmentos de ADN foram sintetizados, recozido e inserido no vector pLKO.1. A sequência madura é sentido: 5′-atgtacctgtgtgtattgct-3 ‘
Retrovírus e Infecções lentivírus
produção
Retrovirus foi realizada como descrito anteriormente [34], utilizando células AmphoPhoenix.. Lentivírus foi empacotada utilizando o kit de Invitrogen ViraPower seguindo as instruções do fabricante. O vírus foi aplicada sobre as células alvo durante 24 horas. Após a infecção, as células foram expostas quer a puromicina (1 jag /ml) ou de selecção de neomicina (500 ug /ml).
Mir-144 sobre-expressão
O pré-miR-144 ou o seu correspondente vector plasmídico foi transfectado em células A549 com lipofectamina 2000 (Invitrogen). As células transfectadas foram iniciadas para a seleção por puromicina (1 mg /ml) 24 horas após a transfecção por 2 dias.
As amostras de tecido
26 pacientes que foram diagnosticados como NSCLC no Departamento de Medicina Respiratória do nosso hospital foram incluídos neste estudo. Antes da cirurgia, nenhum destes pacientes recebeu qualquer tratamento. Tumores e circundantes amostras de tecido do pulmão que não de tumor foram recolhidas e armazenadas a -80 ° C. Antes da coleta da amostra, aprovação ética foi obtida a partir do hospital e consentimento informado foi obtido de todos os participantes antes da recolha de tecidos começou.
extração de RNA a partir de tecidos e células
limpe a sonda homogeneizador, pinças, espátulas e quaisquer outros instrumentos que são utilizados para tratar as amostras de tecido, lavando-as com os seguintes tampões: RNAseZAP sequencialmente, 75% de etanol e água DEPC. Deixar as amostras de tecido congelado descongelar o suficiente, e, em seguida, o tecido cortado em pequenos pedaços com uma lâmina de barbear estéril. Raspe todos os pedaços de tecido em um tubo de 50 ml contendo L3 tampão (Invitrogen) e homogeneizar o tecido 3 vezes (30s cada vez, coloque as amostras em gelo durante o intervalo). Girar amostras homogeneizadas a 12000 g durante 5 minutos a 4 ° C. MiARN total foi extraído usando o kit de isolamento de miARN PureLink (Invitrogen) seguindo o manual de confecção.
Para extrair o ARN a partir de células cultivadas, raspar células (cerca de 2 × 10
6 para cada amostra) em 15 ml tubos, e colocá-los a 250 × g durante 5 minutos para sedimentar as células. Adicionar 300 ul de tampão de L3 para cada pelete de células, e vortex. MicroRNA foi extraído seguindo o manual (kit de isolamento PureLink miRNA, Invitrogen) manufactory.
analisa Real-Time PCR de miRNAs
Os níveis de miRNA foram determinados utilizando TaqMan MicroRNA Ensaios Kit (Applied Biosystems) . Primers para miR-451, mir144 RUN48 e foram adquiridos a partir de ABI. A reacção de transcrição reversa e PCR em tempo real foram realizados de acordo com o protocolo do fornecedor. RUN48 foi utilizado como padrão interno para normalização. A expressão relativa de miARN foi calculada pela utilização da média do grupo de controlo como um calibrador.
análises PCR em tempo real de ZFX ARNm
O ARN total foi extraído a partir de células de diferentes grupos usando reagentes Trizol. Os níveis de ARNm de ZFX foram testados utilizando kits de ensaio TaqMan gene expressão. PCR em tempo real foi realizada seguindo o protocolo de confecção. Os dados foram normalizados com o gene housekeeping GAPDH.
Goiaba nexina Ensaio
O ensaio foi realizado seguindo o protocolo manufactory (Millipore). Resumidamente, ligado e as células em suspensão foram todos recolhidos. As células foram suspensas em 100 uL de meio e incubou-se com 100 ul de Reagente de goiaba nexina em cada poço durante 20 minutos à temperatura ambiente no escuro. As amostras foram então medidas num sistema de goiaba (Millipore). Os dados foram analisados usando o software fornecido pela empresa.
Western blot
lisados de células inteiras foram colhidas em 2% SDS suplementado com inibidores de proteases. Quantidades iguais de proteínas (50 ^ g) foram submetidas a electroforese num gel de poliacrilamida (10 ou 15%). As proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose pura. Após a transferência de proteína, as membranas foram bloqueadas com 5% de leite seco sem gordura em TBS-T durante 1 h antes da adição de anticorpos primários e incubadas a 4 ° C durante a noite. As membranas foram então lavadas três vezes com TBS-T e incubaram-se com anticorpos secundários durante 1 h à temperatura ambiente em TBS-T. Após três lavagens em TBS-T, produtos imunorreactivas foram visualizadas utilizando o sistema de detecção de mancha ocidental SuperSignal substrato (Pierce, EUA).
Luciferase Assay
A luciferase foi realizada em células A549 usando PMIR -report Sistema [34] (Applied Biosystems) seguindo o protocolo do fornecedor. Resumidamente, PMIR-report-Luciferase-ZFX-3′-UTR ou seu mutante (3 ug) foi co-transfectada com PMIR-relatório de controlo β-gal (1 ug) em células A549 (10
6) com ou sem miR-144 sobre-expressão utilizando 15 ul de Lipofectmin 2000 (Invitrogen).
24 horas mais tarde, a actividade de luciferase foi medida com o luciferase Assay Kit (Applied Biosystems). Lavar as células com PBS. 250 uL Solução de Lise foi adicionado às células. Separe as células de placa com um raspador de células. Transferir o lisado celular para um tubo de microcentrifugação e centrifugar a 4 ° C durante 5 min para sedimentar os detritos. Transferir o sobrenadante para um tubo fresco. Transferir 50 uL de extracto celular a um tubo de luminómetro. Adicionar 100 mL de Substrato A (solução de ATP). Adicionar 100 mL de Substrato B (solução de luciferina). Programar o luminómetro para realizar um 2-S atraso pré-medição seguido por um período de 10 s de medição. Colocar o tubo no luminómetro e iniciar leitura. A actividade β-galactosidase foi testada através da utilização β-Gal Assay Kit (Invitrogen) seguindo o manual do fabricante. A actividade de luciferase relativa foi obtida através da normalização de expressão de luciferase com expressão β-gal.
ensaio ELISA de ZFX
Descongelar amostras de -80 ° C. Cortar tecidos normais e tumorais em pedaços pequenos, e pesa cerca de 100 mg de amostra para cada ensaio. Lavar o tecido com PBS, o tecido homogeneizar em 1 mL de PBS e armazenar durante a noite a -20 ° C. Dois ciclos de congelamento-descongelamento foram realizadas para romper as membranas celulares, centrifugar os homogeneizados durante 5 minutos a 10000 g, 4 ° C. Medir o nível de proteína de ZFX no sobrenadante usando kit ZFX-Elisa (CUSABIO BIOTECH CO., Ltd., China) seguindo o protocolo do fabricante e normalizá-lo contra o peso do tecido.
Estatísticas
os resultados experimentais estão apresentados como a média ± SD As análises estatísticas foram realizadas por estudantes desemparelhados
t
teste ou análise de variância assumindo variância desigual salvo indicação em contrário usando SigmaPlot 11.0 (San Jose, CA EUA). A significância foi definida como * p 0,05, ** p 0,01, *** p . 0.001
Resultados
Os níveis de miR-144 e miR-451 são diminuídos em tecidos tumorais NSCLC comparando a peri-tumoral tecidos normais
Tal como mostrado na Figura 1A e 1B, encontramos uma regulação negativa significativa tanto para miR-144 ( 70% de decréscimo, p 0,001) e miR-451 ( 60% de decréscimo, p 0,001) em tecidos de cancro de pulmão de células não pequenas, (n = 26) em comparação com os tecidos normais peri-tumoral (n = 26), que está em linha com os dados anteriores mostrando que o miR-144 e mir-451 partilham o mesmo locus DNA, coordenadamente transcritas e desempenha funções semelhantes em vários cenários fisiopatológicos [13], [24], [35], [36]. Além disso, uma diminuição significativa do nível de mir-144 (Figura 1C) também é observado no câncer de alto grau (III-IV) em comparação com que no câncer de baixo grau (IA-IIB).
A e B. Os níveis relativos de expressão de miR-144 e miR-451 em condições normais (n = 26) e tecidos de tumor (n = 26). Os níveis de expressão de miR-144 ou miR-451 em tecidos tumorais foram normalizados para a expressão de microRNAs acima nos correspondentes tecidos normais do mesmo paciente. C. Os níveis de expressão relativa de miR-144 em baixo grau (IA-IIB) (n = 14) e de alto grau (III-IV) adenocarcinoma pulmonar (n = 12).
os níveis de expressão de miR-144 são mais baixos em linhas celulares de cancro de pulmão humano quando comparado com as células epiteliais normais humanos brônquica
Consistentemente, também descobrimos que mir-144 é significativamente regulada em NSCLC linhas de células A549 ( 45% de decréscimo, p 0,001), CRL-5875 ( 60% de decréscimo, p 0,001), HTB-183 ( 50% de decréscimo, p 0,001), em comparação com linhas de células epiteliais brônquicas normais (16HBE14o- células) (Figura 2).
ectópica miR-144 expressão inibe o crescimento de células A549 e promove a apoptose das células
em seguida, procurou-se determinar se mir-144 desempenha um papel regulador directo sobre o crescimento do tumor. Para testar esta hipótese, projetado com sucesso mir-144 hiperexpressão em células de câncer de pulmão A549. Os resultados mostraram expressão de miR-144 em mir-144 células A549 hiperexpressa é mais de 7 vezes maior do que o controle de vetores (Figura 3A). Curiosamente, verificou-se que o miR-144 hiperexpressão resulta numa inibição significativa do crescimento de células de tumor (Figura 3B) e aumento da apoptose como manifestado por marcadores proteicos apoptóticas elevada (citocromo-c e caspase 3) e citometria de fluxo resultados (Figura 3C-F) .
A. A sobre-expressão de miR-144 em células A549, média ± DP, n = 3. B. curvas de crescimento das células A549 com ou sem miR-144 sobre-expressão, média ± DP, n = 3. C. ocidentais-blots de As células A549 com ou sem mir-144 sobre-expressão. D e E. As imagens representativas de resultados Goiaba nexina Ensaio de células A549 sem e com mir-144 sobre-expressão, respectivamente. F: Quantificação de goiaba nexina Assay resultados, significa ± SD, n = 3.
Os resultados mostraram na Figura 1-3 fortemente sugerido que o miR-144 pode desempenhar um papel inibitório importante no desenvolvimento do câncer de pulmão . Especificamente, parece que mir-144 está negativamente associado com o fenótipo maligno dos cancros do pulmão (Figura 1, 2). De acordo com este conceito, a expressão ectópica de miR-144 resulta numa inibição dramática do crescimento de células tumorais e uma indução de apoptose tumoral.
ZFX proteína, um alvo a jusante de miR-144, é expressa maior em linhas celulares de cancro do pulmão humano do que na linha celular epitelial bronquial
Como próximo passo, parece ser interessante para descobrir o mecanismo subjacente para miR-144 de inibição do tumor mediada. Ao pesquisar exaustivamente dados relacionados, encontramos ZFX (proteína de dedo de zinco, X-ligada) pode ser uma molécula efectora potencial para miR-144 acção no contexto do crescimento e desenvolvimento NSCLC. Para testar esta hipótese, verificamos a expressão da proteína e do mRNA em células NSCLC e em vias normais. Como mostrado na Figura 4A, verificou-se que a proteína ZFX é significativamente mais elevada em linhas celulares de NSCLC, em comparação com a sua contrapartida normal. Não foi observada uma diferença entre NSCLC e células normais nos níveis de mRNA de ZFX (Figura 4B). Nós também descobrimos nível de proteína ZFX foi menor em miR-144 células A549 sobre-expresso quando comparado com as células transduzidas de controlo do vector (Figura 4C). Na Figura 4D nós mostramos o esquema do ensaio de luciferase utilizando PMIR-relatório do sistema para avaliar a inibição direta da mir-144 na expressão da proteína ZFX. Encontrámos Mir-144 pode inibir eficientemente a expressão de luciferase por ligação a ZFX 3′-UTR, mas não tem efeito sobre a expressão de luciferase quando os locais de ligação foram mutados em ZFX 3′-UTR (Figura 4E).
O efeito da expressão de miR-144 ectópica no nível de proteína ZFX em células A549. A. níveis de expressão de ARNm relativos de ZFX em A549, CRL-5875, HTB-183 células e 16HBE14o-, média ± DP, n = 3. B. ocidentais-blots de ZFX e GAPDH em células acima. C. Ocidental-borrões de ZFX e GAPDH nas células A549 com ou sem mir-144 sobre-expressão. D. O esquema do ensaio de luciferase utilizando PMIR-relatório do sistema para avaliar a inibição direta da mir-144 na expressão da proteína ZFX. E. Os diferentes efeitos do miR-144 em ZFX 3′-UTR e o seu mutante, média ± DP, n = 5.Mir-144 pode inibir eficientemente a expressão de luciferase por ligação a ZFX 3′-UTR, mas não tem efeito sobre a expressão de luciferase quando os locais de ligação foram mutados em ZFX 3′-UTR.
ZFX knockdown inibe o crescimento de células A549 e promove a apoptose de células
Para testar se ZFX também exerce direta função reguladora no crescimento do tumor NSCLC, nós derrubado proteína ZFX em células A549. Como mostrado na Figura 5A, o knockdown construir resulta em 80% de expressão da proteína regulação para baixo, em comparação com células de controlo (Figura 5A). Como esperado, verificou-se que ZFX knockdown induz apoptose fortemente NSCLC (tal como se manifesta por meio de marcadores de proteína melhoradas apoptóticas e citometria de fluxo) e suprime o crescimento de células de tumor (Figura 5B-F), que é semelhante ao que os efeitos biológicos observados para miR-144 sobre- expressão mostrado nas figuras anteriores.
a. Os níveis de expressão de ARNm relativos de ZFX em A549 com ou sem ZFX knockdown, média ± DP, n = 3. B. ocidentais-blots de ZFX, citocromo-c, caspase-3 e GAPDH em células acima. C. As curvas de crescimento de células A549 com ou sem ZFX knockdown, média ± DP, n = 3. D e E. As imagens representativas dos resultados goiaba nexina doseamento de células A549 sem e com ZFX knockdown, respectivamente. F: Quantificação de goiaba nexina Assay resultados, significa ± SD, n = 3.
ZFX é necessário para a função supressora de miR-144 no crescimento NSCLC
Para determinar ainda se ZFX é necessário para mir-144 ação no cenário NSCLC, que, simultaneamente, sobre-expressos mir-144 e ZFX proteína na linha de células A549. Nós sobre-expressa miR-144 por transfecção das células com pré-miR-144 de plasmídeo utilizando Lipofectamine 2000. As 24 horas mais tarde, as células infectadas com retrovírus que codifica a proteína que ZFX. Os resultados revelaram que a sobre-expressão ZFX parcialmente mas significativamente amortece miR-144 acção como demonstrado pela diminuição da apoptose celular (Figura 6A, 6C-6F) e um aumento do crescimento de células de tumor (Figura 6B) em relação às células tumorais apenas com miR-144 hiper- expressão, o que sugere claramente que ZFX-depressão é necessário para miR-144 A549 mediada por apoptose de células NSCLC e inibição do crescimento. Combinado com os dados apresentados na Figura 4 e Figura 5, parece que ZFX como um gene efector a jusante, podem ser envolvidos em miR-144 mediada regulação do desenvolvimento do tumor de NSCLC, que lança luz sobre uma investigação mais aprofundada desta nova via na gestão de NSCLC.
A. Ocidentais-blots de ZFX, citocromo-c, caspase-3 e GAPDH em células A549 apenas com miR-144 sobre-expressão ou miR-144 sobre-expressão combinada com ZFX sobre-expressão. O grupo controle foi transducted com dois vírus de codificação vetor vazias. B. As curvas de crescimento de células acima. C, D e E. As imagens representativas dos resultados goiaba nexina Ensaio de células acima. F. Quantificação de goiaba nexina Assay resultados, significa ± SD, n = 3.
níveis de expressão ZFX são significativamente mais elevados em tumores quando comparados aos seus tecidos normais adjacentes
Em conformidade com o dados anteriores, ELISA mostraram os níveis de expressão relativos de ZFX em condições normais (n = 26) foram significativamente menores do que nos tecidos de tumor (n = 26, p 0,001) (Figura 7A). Os níveis relativos de ZFX em tumores foram obtidas normalizando contra a expressão de ZFX nos tecidos normais correspondentes provenientes de um mesmo paciente. Além disso, os níveis de expressão relativos de ZFX em baixo grau (IA-IIB) e adenocarcinoma do pulmão de grau elevado (III-IV), também foram comparados. Embora os níveis de proteína ZFX em agenocarcinoma pulmão de alto grau foram ligeiramente maiores do que os de baixo grau, os dados não foi significativa, possiblely por causa do pequeno tamanho da amostra (Figura 7B).
A. Os níveis relativos de expressão de ZFX em condições normais (n = 26) e tecidos de tumor (n = 26). Os níveis relativos de ZFX em tumores foram obtidas normalizando contra a expressão de ZFX nos tecidos normais correspondentes provenientes de um mesmo paciente. B. Os níveis de expressão relativa de ZFX em baixo grau (IA-IIB) (n = 14) e de alta qualidade (IIIA-IV) adenocarcinoma pulmonar (n = 12).
Discussão
o cancro do pulmão é o tumor maligno mais comum no mundo e ocupa o número 1 para todos morte por câncer. O modelo actual para patogénese do cancro do pulmão acredita-se ser devido à combinação de factores de risco genéticos e ambientais indesejáveis estimulações [37]. Como discutido antes, Non-Small-Cell Lung Cancer (NSCLC) é responsável por cerca de 80% entre todos os subtipos de câncer de pulmão [2]. Portanto esclarecimento do mecanismo subjacente para o desenvolvimento NSCLC permanece como um grande desafio para a gestão bem sucedida de câncer de pulmão.
Infelizmente, embora a carcinogênese e fisiopatologia das NSCLC têm sido intensamente investigados durante as últimas décadas, o mecanismo subjacente de desenvolvimento NSCLC continua mal compreendida e ainda há falta de estratégias terapêuticas ótimas mesmo após décadas de intensa investigação.
A última década testemunhou microRNA como uma área quente para biologia do câncer. Embora microARNs também são essenciais para a fisiologia humana normal, muitas espécies de microRNA foram mostrados para desempenhar funções reguladoras importantes na tumorigénese e desenvolvimento do cancro bem. Exemplos incluem, mas não se limitando a, mir-574-3p e cancro da próstata [38], miR-23a e cancro gástrico [39], Mir-21 e o cancro do cólon [40]. Com base nos dados abundantes acumulados durante as últimas duas décadas, os cientistas começaram a discutir para uso de microRNAs como novos alvos terapêuticos para várias doenças malignas [41]. microRNAs relacionados com cancro do pulmão identificadas incluem mir-210 [42], mir-365 [43], mir-449c [44], etc.
No estudo atual, nós foram se esforçado para oferecer uma nova visão sobre NSCLC o desenvolvimento de uma perspectiva da ciência translacional. Primeiro, foram coletados dados do lado da cama, o que mostra uma associação forte entre o fenótipo maligno de NSCLC e expressão de miR-144. À luz dos dados a partir de amostras de NSCLC reais, exploramos ainda mais o papel do miR-144 em desenvolvimento NSCLC. Resultados acabou por ser muito positivo. Os dados mostraram que miR-144 robustamente induz a apoptose e inibe o crescimento de células NSCLC. Além disso, os resultados também sugerem que a proteína X-cromossómico do dedo de zinco, ou ZFX, parece ser uma molécula efectora a jusante para miR-144 acção. Em termos de NSCLC, parece que a actividade anti-tumoral de miR-144 é pelo menos parcialmente através de virar para baixo a expressão da proteína ZFX a um nível pós-transcrição. Esta hipótese foi ainda confirmada com outras duas observações importantes 1) Mir-144 exerce funções reguladoras directas sobre a expressão ZFX e 2) a expressão da proteína ZFX (ELISA) parece estar associado com tumorigênese.
Até o momento, a melhor do nosso conhecimento, não houve nenhum relatório mostrando um envolvimento directo do eixo mir-144-ZFX no desenvolvimento NSCLC, que merece uma investigação mais aprofundada desta via no comportamento NSCLC. Embora não devemos descartar o envolvimento de outros genes-alvo para mir-144 ação no cenário atual, os nossos resultados, em menor medida, pelo menos, fornecer uma prova de princípio mostrando que as abordagens de translação pode ser útil para o desenvolvimento futuro do romance terapêutica estratégias para NSCLC.