Abstract

variantes de splicing alternativo de vários oncogenes e supressores de tumor foram mostrados para ser importante para a sua tumorigenicidade. No presente estudo, nós testamos se a proteína serina-arginina-quinase 1 (SRPK1), um importante regulador de factores de splicing, está envolvida na progressão do cancro do ovário e desempenha um papel importante na quimio-sensibilidade. Por análises de transferência de Western, a proteína SRPK1 foi encontrado para ser sobre-expresso em 4 de 6 linhas celulares de cancro do ovário, em comparação com uma linha celular epitelial da superfície do ovário imortalizada; e em 55% das amostras de tumor de ovário, em comparação com amostras de tecido de ovário não neoplásicas. Redução da expressão SRPK1 usando pequeno ARN interferente (siRNA) que codifica pequeno ARN gancho de cabelo, em células de cancro do ovário levaram a (i) redução da taxa de proliferação celular, mais lenta a progressão do ciclo celular e a capacidade de crescimento e migração independente de ancoragem comprometida

In vitro

, (ii) redução do nível de fosforilação de várias proteínas serina-arginina, e P44 /42MAPK e proteínas AKT, e (iii) aumento da sensibilidade ao cisplatino. Juntos, estes resultados sugerem que a expressão elevada SRPK1 pode desempenhar um papel na tumorigénese do ovário e SRPK1 pode ser um alvo potencial para a terapia do cancro do ovário

citação:. Odunsi K, Mhawech Fauceglia-P, Andrews C, Beck A, Amuwo O, S Lele et al. (2012) elevada expressão da Proteína Serina-Arginina quinase 1 Gene no cancro do ovário e seu papel na Cisplatina citotoxicidade

In Vitro

. PLoS ONE 7 (12): e51030. doi: 10.1371 /journal.pone.0051030

editor: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de setembro de 2012; Aceito: 23 de outubro de 2012; Publicação: 07 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Odunsi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Grants CA 107.303 (RH), Gynecologic Cancer Foundation (RH), DK60632 (JDB), e CA16056 (RPCI Núcleo Grant); Cancer Research Institute /Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer Cancer Vaccine Collaborative Grant (KO); e Hilton-Ludwig Cancer Metástase Grant, do Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer (KO). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Estima-se que 35-59% dos genes humanos são de splicing alternativo, o que contribui grandemente para a complexidade das funções celulares humanos [1], [2]. É, por conseguinte, não é surpreendente que as actividades de alguns oncogenes e genes supressores de tumores são modulados por splicing alternativo [3], [4]. Por exemplo, o splicing alternativo aberrante de determinadas supressores de tumores, tais como cancro da mama 1 e 2 (BRCA1 /2) [5], tumor de Wilms 1 (WT1) [6], e polipose coli adenomatosa (APC) [3], os resultados em mutações que representam hereditária e esporádica susceptibilidade ao câncer. Além disso, certos factores de splicing foram encontrados para ser sobre-expressa em tumores e têm sido implicados como onco-proteínas [7], [8].

SRPK1 (serina-arginina proteína cinase 1) pertence à SR-cinase família de proteínas e regula a família de factores de splicing SR. Os factores de splicing SR são algumas das proteínas auxiliares que são necessárias para o splicing de pré-ARNm em células de mamífero. SR proteínas são caracterizadas por um ou dois motivos de reconhecimento de ARN no terminal N e um domínio rico em SR no terminal C [9], [10], [11]. O domínio SR é pensado para promover interacções proteína-proteína durante a montagem [12]. proteínas SR são regulados pela fosforilação reversível mediado por SRPK1. Enquanto proteínas SR fosforilados são necessários para iniciar a montagem spliceosome na fase mais precoce, desfosforilação é essencial para o splicing a ter lugar na spliceosome [13], [14]. Evidências demonstram que tanto hipo e hiper-fosforilação de proteínas SR são prejudiciais para splicing [14], [15]. Assim, o nível de SRPK1 é crucial para manter o equilíbrio adequado entre as proteínas fosforiladas SR e desfosforilado. A sobre-expressão da proteína SRPK1 tem sido documentada em leucemia aguda Adulto tipo de célula T [16], leucemia mielóide crónica [17] do pâncreas, da mama, e cancros do cólon [18], [19], [20]. Curiosamente, SRPK1 é expressa em células germinais masculinas adulto, mas geralmente não na maioria dos outros tecidos adultos normais, sugerindo uma distribuição de cancro /testículo, do [16], [21]. Juntos, esses estudos sugerem que SRPK1 é susceptível de desempenhar um papel importante no desenvolvimento do câncer.

Nós [22] e outros [23] descobriram anteriormente que a inactivação de

Sky1

, o homólogo de levedura do factor de splicing SRPK1, aumenta a resistência das células de levedura para cisplatina (cDDP). No entanto, se a expressão SRPK1 desempenha um papel na determinação da sensibilidade ou resistência dos tumores à quimioterapia humana permanece pouco clara, pelas seguintes razões. Em primeiro lugar, mais baixo nível de expressão SRPK1 tem sido demonstrado que se correlacionam com a resistência do ovário [23], testicular [20] e HT29 [24] linhas celulares de tumores para os regimes de tratamento contendo platina. Em segundo lugar, tem sido recentemente demonstrado que o rompimento de expressão SRPK1 por siARN aumenta a apoptose causada por cDDP em linhas de células pancreáticas, do cólon e do cancro da mama [18], [19].

No presente estudo procurou-se examinar se a expressão SRPK1 está associada com a progressão do câncer de ovário, se o padrão de SRPK1 expressão correlaciona-se com respostas clínicas ao tratamento envolvendo cDDP e se inibição da SRPK1 altera a sensibilidade de células de cancro do ovário para cDDP. Em primeiro lugar, verificou-se que o nível de proteína SRPK1 elevada estava presente em aproximadamente 55% de amostras de tumores de ovário, em comparação com amostras de tecido de ovário não neoplásicas. Em segundo lugar, a inibição siRNA mediada por SRPK1 levou a uma redução da OVCA taxa de proliferação celular,

in vitro

migração celular, potencial e mais lenta progressão do ciclo celular tumorigénico. Estes fenótipos foram associadas a alterações mediadas por SRPK1 de MAPK /AKT vias de sinalização, uma vez que os níveis de proteína fosforilada (activada) MAPK /AKT foram reduzidos nas células SRPK1 knockdown. Finalmente, em contraste com o sistema de levedura, que feita a observação surpreendente de que a inibição de SRPK1 sensibilidade melhorada para tratamento com CDDP, sugerindo que SRPK1 pode ser um alvo para a terapia do cancro do ovário.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

o estudo envolvendo seres humanos foi realizada sob um protocolo aprovado pelo Institutional Review Board RPCI (CIC0215). Todas as amostras de tecido foram coletadas de pacientes que forneceram consentimento informado por escrito.

Pacientes e tumor ovariano espécimes

amostras de tecidos congelados

Flash (n = 47) foram obtidas de pacientes submetidos a cirurgia debulking para o câncer epitelial de ovário no Roswell Park Cancer Institute (RPCI), Buffalo, NY entre 1995 e 2006. as amostras de ovário normal (n = 9) foram obtidos de pacientes submetidos a histerectomia para condições benignas, como leiomioma. informações clínico-patológica para toda a coorte, incluindo a resposta à quimioterapia, sejam mantidas em um banco de dados do Departamento de Oncologia Ginecológica.

Cultura de Células

linhas celulares de cancro do ovário SKOV3 e OVCAR3 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA). A2780 e células A2008 e os seus homólogos-resistentes cDDP A2780 /CP [25] e A2008 /C13 [26], as células foram obtidas do Dr. Steven Howell (Universidade da Califórnia, San Diego). Estas células foram mantidas em meio RPMI1640 suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS). Uma linha não transformada superfície do ovário células epiteliais (IOSE-385, a seguir designada como Iosé) foi imortalizado com os primeiros genes SV40 [27] e obteve do Dr. Nelly Auersperg (University of British Columbia, Canadá). Iosé células foram mantidos em M199 /MCDB 105 médio (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) suplementado com FBS a 5% e gentamicina (Invitrogen, Carlsbad, CA).

shRNA e salvamento-SRPK1 Constructos

shSRPK1-1 e shSRPK1-2, codificação shRNA segmentação nucleótidos 288-308 (CAAGAAGATCCTAATGATTA) e 1423-1443 (GGTCAGTCATTCAGTGAACAA), respectivamente, do ARNm SRPK1, foram adquiridos a Abrir Biosystems (Huntsville, AL). Para a transfecção, SKOV3 e A2780 /CP células foram semeadas em placas de 6 poços a 80% de confluência e transf ectadas com 3-4 ug de ADN de plasmídeo utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA e proteínas a partir de células controlo ou shSRPK1-transfectadas foram analisados ​​3 dias após a transfecção. shSRPK1 clones estáveis ​​foram seleccionados usando 2 ug /ml de puromycine durante 3 semanas. Para plasmídeo SRPK1-salvamento, um iniciador contendo 3 mutações silenct (GCAAGAAGATCCTAATGATTA, sublinhado nucleótidos foram alterados para G, G, C, respectivamente) dentro das sequências alvo shSRPK1-1 foi introduzido no plasmídeo p-CMV-Flag-SRPK1 (uma oferta do Dr. Xiang-Dong Fu, Universidade da Califórnia, San Diego) utilizando PCR assimétrica [28]. A transfecção foi realizada como descrito acima e os cones estáveis ​​foram seleccionadas usando G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Chemicals

Cisplatina (CDDP,

cis-dicloro-

-diammine platina II) e de MTT {3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-} foram comprados na Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). solução da CDDP preparados no seio de DMSO (330 mM), armazenado como alíquotas a -20 ° C, e usados ​​dentro de 2 semanas. cDDP foi adicionalmente diluída em meio antes de adicionar às células.

Análise Western Blot

Vinte a trinta miligramas de tecido tumoral congelado foi homogeneizado com um almofariz e pilão em tampão de amostra de tecido (10% de SDS , 5% β-mercaptoetanol, 50 mM de Tris-HCl, pH 8,0, glicerol a 10%) para a extracção de proteínas. Os lisados ​​celulares foram extraídos utilizando tampão RIPA (NaCl 150 mM, 1% de NP-40, 0,5% de ácido desoxicólico, 0,1% de SDS, Tris-HCl a 50, pH 8,0). As proteínas foram resolvidas por 10% SDS-PAGE, transferidos para membrana de PVDF (Millipore, Billerica, MA) e bloqueadas em TBS contendo 0,05% de Tween-20 e 5% de leite seco durante a noite a 4 ° C. As membranas foram incubadas com anticorpo primário durante 1-2 horas, e depois com anticorpo secundário conjugado com peroxidase durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a incubação, as membranas foram lavadas várias vezes e as proteínas foram visualizadas utilizando o kit ECL (reforçada Quimiluminescência) (Pierce, Rockford, IL). Sinais digitais foi fotografada e quantificados por densitometria com um gerador de imagens Alpha (Alpha Innotech, San Leandro, CA). Os anticorpos utilizados para detectar a SRPK1 era da BD Biosciences (San José, CA), proteínas SR fosforilados foram mAB104 [29] isolado a partir de células de hibridoma (ATCC, Manassas, Virginia), p44 total /42 MAPK e AKT (AKT1 /2/3 , sc-8312) eram de sinalização celular (Danvers, MA) e Santa Cruz, respectivamente, MAPKp42 fosforilada /44 (Thr

202 /Tyr

204) e AKT (Ser

473 /Tre

308) eram de sinalização celular (Danvers, MA), Anticorpo contra Upf1 foi um presente do Dr. Harry Dietz (Johns Hopkins University). Anti-actina foi de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Os dados foram expressos como a expressão vezes em relação ao longo de actina.

imuno-histoquímico de coloração

As secções (4 mm de espessura) de, tecido ovário e tumor normal, embebido em parafina fixado em formalina foram processadas para IHC, como descrito anteriormente [30]. A peroxidase endógena foi bloqueada com peroxidase de hidrogénio a 0,3% durante 30 min. A recuperação de antígenos foi realizada em tampão de pH elevado num vaporizador para o anticorpo SRPK1 (BD Biosciences). Para controlo negativo, foi utilizado o rato-IgG.

transcrição reversa de Reacção em Cadeia da Polimerase (RT-PCR) Análise

O ARN total foi extraído a partir de dez milhões de células utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc foi sintetizado a partir de 2 ug de ARN total, em tampão de reacção de 20 ul usando M-MuLV da transcriptase reversa, Ribolock ribonuclease Inibidor (Fermentas Life Science, Glen Burnie, MD) e os iniciadores de hexâmeros aleatórios após digestão ADNasel. Os produtos de ADNc foram utilizados para PCR com iniciadores semi-quantitativa, utilizando polimerase de ADN Taq (Fermentas Life Science, Glen Burnie, MD) Os iniciadores para SRPK1 (SRPK1-R, 5′-TGTTGTCCAGTGGTCCGTTA, e SRPK1-exon10, 5′-CAAGAAAAACTTGAAGAGTC) foram concebidos de acordo com as sequências de referência de dados do NCBI. GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase) foi utilizado como referência de sequências-alvo (iniciadores: 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC e 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC).

Ensaio de sobrevivência clonogénica

Células (3 x 10

2) foram semeadas em placas de 6 poços durante a noite e tratou-se com cDDP, durante 24 h. Após a remoção da droga, as células foram lavadas com PBS e re-alimentadas com meio isento de fármaco e incubadas durante 10-14 dias. As colónias foram coradas com 0,1% de violeta de cristal e contadas. Percentagem de sobrevivência de células é expressa relativamente ao controlo não tratado.

Ensaio MTT

se as células (5 × 10

3) foram semeadas em placas de 96 cavidades, em triplicado, durante a noite e tratou-se com cDDP para 72 h, adicionou-se MTT durante 4 horas, e o corante de formazano foi dissolvido com DMSO e lido a 540 nm num leitor de microplacas FL6000 (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT). Percentagem de sobrevivência de células é expressa relativamente ao controlo não tratado.

Anchorage-ensaio de crescimento independente

se as células (5 × 10

3) foram semeadas em triplicado em placas de 6 poços contendo uma camada superior de 0,3% de agar macio e uma base de agar a 0,5%. Vinte e quatro horas mais tarde, o número médio de células semeadas por campo foi determinado por contagem de células em 5 campos diferentes sob o microscópio de luz. As colónias formadas ( 0,1 mm de diâmetro) após 3 semanas de crescimento em agar mole foram contadas; 10 campos diferentes por poço foram quantificadas e foi calculado o número médio de colónias por campo. O índice AIG (crescimento independente de ancoragem) foi expressa relativamente ao número de células semeadas.

cicatrização de feridas (raspadinhas) Ensaio

As células foram semeadas em placas de 60-mm de confluência e a célula monocamada foi raspado em três linhas retas com uma ponta de pipeta de 200 mL para criar “arranhões”. Detritos foi removido com PBS e, em seguida, a cultura foi re-alimentadas com meio fresco. Photohgraphs da área da ferida foram tomadas a 0 e 28 h após os riscos para calcular a taxa de migração celular. Vinte medições aleatórias foram tomadas em cada ponto de tempo. As distâncias relativas de migração as áreas das feridas foram medidos nas imagens.

Análise do Ciclo Celular

As células foram sincronizadas em fase G2 /M por tratamento com nocodazole (600 ng /ml) durante 12 hr , lavadas duas vezes com PBS e, em seguida, liberado para meio sem drogas. As células também foram sincronizadas na fase G0 /G1, colocando em meio isento de soro durante 48 h. As células quiescentes foram estimuladas para re-entrar no ciclo celular através da adição de 10% de FBS. Em cada ponto de tempo indicado, as células foram recolhidas e lavadas com PBS frio (solução salina tamponada com fosfato e fixadas em etanol a 70% durante mais do que 15 min). As células foram então tratadas com RNase (50 ug /ml) em citrato de sódio a 1,0% a 37 ° C durante 30 min e em seguida coradas com iodo de propidio (50 ug /ml) durante 15 min. teor de ADN foi medido com um analisador de células activadas por fluorescência (citómetro de fluxo FACScan, Becton Dickson, San Jose, CA). A porcentagem de células em cada fase do ciclo celular foi determinada utilizando os programas WinList e ModFit (Verity Software House, Topsham, ME).

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada utilizando GraphPad Prism V4.03 Software ea R V2.7.0 Statistical Computing Environment. A

p

-valor menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Estudante de

t

-test foi usada para a maioria das comparações de SRPK1 RNA e expressão da proteína vs parâmetros clínico. Os métodos de Kaplan e Meier e de Cox foram usados ​​para estimar relações de tempo de sobrevivência e de perigo medianos.

Resultados

Expression SRPK1 é elevada em certas linhas celulares de ovário Carcinoma e ovarianos tumores

encontraram-se anteriormente que a inactivação da proteína cinase de levedura SR Sky1p confere resistência a cisplatina [22]. No entanto, o nível do gene SRPK1 humana tem sido positivamente e negativamente correlacionada com a resistência das células tumorais aos regimes de tratamento contendo platina [18], [19], [20], [23]. Propusemo-nos a continuar a analisar a relação entre o nível do gene SRPK1 e resistência cDDP no cancro do ovário humano (OVCA) expressão. Utilizou-se em primeiro lugar uma análise para a expressão de RNA SRPK1 em 6 linhas de células OVCA com sensibilidade diferencial cDDP (Figura 1A, o painel inferior) semi-quantitativo de RT-PCR (da transcriptase reversa reacção em cadeia da polimerase). Alguns dos que foram, pelo menos, seis vezes mais do que a resistência à cDDP uma linha celular epitelial da superfície do ovário não transformada (Iosé) que tinha sido imortalizadas com os genes precoces de SV40 [27]. Os dados mostram que não houve uma correlação clara entre cDDP fenótipo de resistência e os níveis de ARN destes genes entre estas linhas celulares. No entanto, o nível de ARNm SRPK1 foi elevada em 4 de 6 linhas celulares, em comparação com a das células Iosé (Figura 1A). A seguir avaliou a expressão da proteína SRPK1 nas linhas de células mencionadas acima, utilizando análise de Western blot. O nível relativo de proteína SRPK1 foi determinado por normalização com a do gene de actina de arrumação. A Figura 1B mostra que a proteína SRPK1 também é elevada em 4 de 6 linhas celulares de carcinoma do ovário (definidas como 2 vezes em relação a média da amostra Iosé), embora com padrão ligeiramente diferente daquele do ARN. Notamos que as células imortalizadas Iosé também expressam certo nível de SRPK1. Isto não é surpreendente uma vez que os outros também têm demonstrado que a imortalização de células epiteliais do ovário, em comparação com as células humanas normais OSE não imortalizadas, aumenta a expressão de um factor de splicing, proteína de ligação ao tracto polipirimidina [8]. Semelhante à expressão de mRNA, encontramos nenhuma correlação clara entre cDDP fenótipo de resistência eo nível de proteína SRPK1 entre estas linhas celulares. Uma vez que os níveis de genes em linhas de células cultivadas de longa duração pode ser alterada, o próximo examinados expressão SRPK1 arquivados em amostras de tumor de pacientes OVCA OVCA que foram tratadas com regimes de platina após a cirurgia. Para avaliar a expressão específica de proteína SRPK1 no epitélio do tumor ao nível celular, foi realizada a coloração imuno-histoquímica (IHC) em secções de tecido embebidas em parafina. A Figura 2A mostra que a coloração SRPK1 era quase inexistente no epitélio do ovário normal. Em contraste, a coloração SRPK1 foi facilmente detectada em tumores de ovário, com intensidade de coloração que varia de fraca a forte, e apresentar-se predominantemente no citoplasma das células epiteliais. A localização citoplasmática do SRPK1 em amostras de tumor OVC é semelhante ao encontrado em células de cultura de tecido [15]. Uma vez que os tumores do ovário são compostas principalmente de células epiteliais, o nível de SRPK1 em homogenatos de proteína de 47 tumoral congelado e 9 amostras de tecido não-neoplásicas foi investigada utilizando análise de Western blot. A Figura 2B mostra os resultados de immunobloting 21 tumoral e 9 amostras de tecido não-neoplásicas. A análise densitométrica de SRPK1 e níveis de actina foi realizada e o nível relativo de expressão SRPK1 foi normalizado com o nível de actina. Verificou-se que 26 dos 47 (55%) casos SRPK1 sobre-expresso (definido como superior a duas vezes em relação à média das amostras normais nove).

(A) em tempo real de transcrição reversa-reacção em cadeia da polimerase quantitativa (RT-PCR), análise do nível de ARN SRPK1 em 6 células e células OVCA Iosé. GAPDH foi usada para controles de carga e normalização. Cinquenta por cento de concentração de inibição de crescimento (IC

50,? M) da CDDP para as células OVCA foi indicado painel inferior). (B) Análise Western blot da proteína SRPK1 em 6 células OVCA e células Iosé. A banda mais baixa no blot sondado com anticorpo anti-SRPK1 é provavelmente fragmento proteolítico de SRPK1. Os blots foram re-sondados com a actina, que foi utilizado como um controlo de carga e para a normalização. O gráfico representa a expressão relativa determinada por medição densitométrica das bandas e é expressa em relação à actina. Bar-gráfico mostrado é a média de 4 experiências. A sobre-expressão de SRPK1 em OVCA foi definido como superior a duas vezes em relação à média das amostras Iosé e é marcada por asteriscos.

(A) coloração imuno-histoquímica para a expressão da proteína SRPK1 em secções normais e tumorais de ovário de tecidos . As células coradas positivamente para o anticorpo são SRPK1 castanho. Para controlo negativo, o hospedeiro-IgG foi usada (não mostrado). E, epitélio; S, estroma. (B) Análise de transferência de Western de proteína SRPK1 em 21 amostras de tumores do ovário (t), e 9 amostras de tecido do ovário não neoplásicas (N). As amostras normais e tumorais no painel mais baixo foram cortadas a partir de duas manchas diferentes para fins de apresentação. As bandas menores no blot sondado com anticorpo anti-SRPK1 são provavelmente os fragmentos proteolíticos da SRPK1. plot (C) Box-Whisker com SRPK1 /actina dobra expressão derivada da análise densitométrica das bandas em análise de Western blot. Suiças abranger todos os tumores (n = 47) ou as amostras normais (n = 9), caixas de conter pelo menos 50% dos dados, e as linhas de centro das caixas de mostrar medianas. A média de expressão foi comparada por estudante do

t

-test (p = 0,03).

A maioria dos 47 pacientes testados apresentaram com grau 3 tumores (91%), no estádio IIIC (76%), e com a histologia serosa (85%). A sobrevivência média para todos os pacientes foi de 39,7 meses {intervalo de confiança (CI), meses 26.5-∞}, enquanto que a sobrevida livre de doença médio, excluindo pacientes com doença persistente /progressiva após a terapia inicial, foi de 17,5 meses (CI, 14,4-35,9 meses). Usando um modelo de regressão de Cox, não observamos uma correlação clara entre o nível SRPK1 e global (p = 0,26) ou doença (p = 0,62) sobrevida livre nos pacientes com câncer ovariano. níveis SRPK1 não foram correlacionados com histologia, grau, ou a resposta clínica ao cDDP contendo regime de quimioterapia. No entanto, a expressão de dobragem média relativa da proteína SRPK1 foi significativamente diferente entre amostras tumorais e de amostras normais (Figura 2C; amostras independentes t-teste, p-valor = 0,03). Assim, os nossos dados indicam que o nível elevado de expressão da proteína SRPK1 é um evento frequente em doenças malignas epiteliais ovarianos.

redução do nível de SRPK1 por Short Hairpin RNA Melhora cDDP citotoxicidade

Tem sido demonstrado que perturbação da expressão SRPK1 por pequeno ARN interferente aumenta a apoptose causada por cDDP em linhas de células pancreáticas, do cólon e do cancro da mama [18], [19]. Para testar se o knockdown do gene em células SRPK1 OVCA afecta a sua sensibilidade a cDDP, que este gene alvo em duas posições no domínio de cinase com duas construções diferentes de ARN de gancho de cabelo curto (SH-SRPK1-1 e SH-SRPK1-2) em células SKOV3 e A2780 /CP, ambos os quais são relativamente mais resistentes a cDDP do que as células Iosé e algumas outras linhas de células OVCA (Figura 1A). Como controlos, o vector pSM2-EV também foi transfectada em ambas as linhas celulares. transfecção transiente (48 horas) de qualquer construção especificamente reduziu o ARNm SRPK1 (dados não mostrados) e o nível de proteína tal como foi confirmado por reprobing as manchas de Western com o anticorpo contra uma proteína não relacionada, Upf1, e a actina foi utilizado como um controlo de carga (Figura 3A). O efeito inibidor do construto shSRPK1-2 é mais significativa do que a do shSRPK1-1. Utilizando o ensaio de cor formazan (MTT), a Figura 3B mostra que a redução da proteína em células SKOV3 SRPK1 resultou no aumento da sensibilidade ao tratamento com CDDP (t-teste emparelhado e * indica P 0,05). Para aprofundar o estudo do efeito de sensibilizar quimioterapia de inibir SRPK1, geramos clones estáveis ​​com diferentes potências shRNA em células SKOV3. Foram obtidos vários clones com ARNm SRPK1 reduzida e proteína como avaliada por RT-PCR e análise de transferência de Western, respectivamente. Dois deles são mostrados na Figura 3C, onde o nível de proteína SRPK1 foi reduzido para aproximadamente 60% (pshSRPK1-C4, alvo de SH-SRPK1-2) ou 20% (pshSRPK1-C5, alvo de SH-SRPK1-1) do controle células pSM2-EV. níveis SRPK1 nestes clones correlacionam inversamente com a sua sensibilidade cDDP, tal como determinado pelo ensaio de formação de colónias (Figura 3D). Estes dados indicam que SRPK1 desempenha um papel na modulação cDDP citotoxicidade

in vitro Comprar e que a segmentação nucleótidos 288-308 do mRNA SRPK1 resultou em um efeito de silenciamento mais forte.

células do cancro do ovário foram transitoriamente ( a) ou de forma estável (C) transfectadas com o plasmídeo que codifica shSRPK1-siRNA ou o vector vazio (pSM2-EV). Os níveis de proteína de SRPK1, UPF1 e actina foram determinados por análise de Western blot. blots representativos de três experiências independentes são apresentados. (B) e (D) SRPK1 knockdown aumenta a citotoxicidade de cisplatina. (B) As células (5 × 10

4) foram re-semeadas 24 h após a transfecção, tratado com várias concentrações de cisplatina durante 48 h e o número de células sobreviventes foi analisada pelo ensaio de MTT. Sobrevivência (%) é expressa em relação a células pSM2-EV não-tratados. (D) Os transfectantes estáveis ​​(3 × 10

2) foram semeadas em triplicado, tratadas com cisplatina durante 24 h e a formação de colónias foi avaliada depois de 10-14 dias. Os dados foram analisados ​​com uma ANOVA caminho e * indica P 0,05; bares, SD.

Knockdown de SRPK1 Expressão diminuição da proliferação celular e

in vitro

potencial tumorigénico de células SKOV3

Os dados apresentados na Figura 3D também indicam que as células com reduzida expressão SRPK1 por shRNA cresceu mais lento do que os de controle de células pSM2-EV. Formaram menos colónias do que o grupo de controlo não tratado na ausência de tratamento com CDDP. Para testar ainda se reduzir expressão SRPK1 inibe a proliferação de células de cancro do ovário, o tempo de duplicação de pSM2-EV e células pshSRPK1-C5 foi comparada. taxa de proliferação celular foi determinada em células em crescimento exponencial por tripsinização e exclusão de corante azul de tripano às 24, 48, 72, e 96 horas após plaqueamento. A Figura 4A mostra que o tempo de duplicação de pshSRPK1-C5 é aproximadamente 1,4 vezes superior do controlo de células pSM2-EV (31 horas vs 22 horas). Isto foi confirmado pelo ensaio de MTT (dados não mostrados). A seguir, investigou o potencial tumorigénico de SRPK1 utilizando o ensaio independente de ancoragem para o crescimento (AIG). células de knockdown e de controlo SRPK1 foram semeadas no agar macio e deixaram-se crescer durante 3 semanas. Figura 4B mostra que ambos os clones shSRPK1 produziu menos e menores colónias em agar mole, sugerindo uma redução no

in vitro

tumorigenicidade. motilidade celular é um dos factores que contribuem para a invasão de células tumorais. Para testar se a capacidade de migração celular é comprometida nas células SRPK1 knockdown, foi realizado um ensaio

in vitro

migração celular (cicatrização de feridas). A Figura 4C mostra que a taxa média de migração de células shSRPK1-C5 (5,8 ± 0,81 unidades) foi de aproximadamente 60% do que para as células de controlo pSM2-VE (9,9 ± 1,5 unidades). Em conjunto, os nossos dados indicam que SRPK1 contribui para a proliferação celular,

In vitro

migração celular e potencial tumorigénico de células SKOV.

(A) ensaio de proliferação celular. As células (1 x 10

4) foram semeadas em triplicado numa placa de 24 cavidades, tratadas com tripsina e contadas, na presença de azul de tripano em tempos indicados. (B) ensaio de crescimento independente de ancoragem. As células (5 × 10

3) foram semeadas em agar mole e o número de colónias foi determinado 21 dias mais tarde. campos representativos das colónias em placas de agar macio-também são mostrados. Os dados apresentados são a média de três experiências independentes e foram analisados ​​com o teste t emparelhado; * Indica P 0,05, barras, SD. células SKOV3 foram semeadas como controlo positivo. (C)

In vitro

ferida ensaio de cura. células confluentes foram riscados com um ul-tip 200 para gerar linha-lacunas retas. Imagens das lacunas foram tomadas a 0 e 28 h e a largura dos intervalos (branco tracejadas-linhas) foi medido sob um microscópio de luz para calcular a taxa de migração celular. Imagens representativas estão apresentados nas distâncias de migração para a esquerda e relativos (encerramento da ferida) mostrado do lado direito foram calculados a partir de 20 zonas de cada placa. Os dados apresentados são de três experiências independentes.

Os asteriscos

apresentaram diferenças significativas em comparação com o controle (P

Art 0,05).

Knockdown de SRPK1 expressão reduzida fosforilação de certas proteínas SR e MAPK /AKT Proteínas

proteínas SR são os alvos diretos de SRPK1 [15]. O padrão de fosforilação destes factores de splicing SR está prevista para ser afectada em células SRPK1 knockdown. Para testar esta previsão, análise de Western blot utilizando um anticorpo que reconhece um epitopo pan-específico fosfo comum a várias proteínas SR [29] foi realizada. Como esperado, a expressão reduzida SRPK1 resultou na diminuição dos níveis de fosforilação de certas proteínas SR em células SKOV3 (Figura 5, painel do meio). É interessante notar que as proteínas SR diferentes são afectados entre clones shSRPK1-C4 e shSRPK1-C5. Por exemplo, o nível de SRp55 foi muito mais reduzida do que no shSRPK1c5 que em células shSRPK1-C4. O oposto é verdadeiro para o SRp40 e SRp20. O diferencial de knockdown SRPK1 observada nestes dois clones (Figura 5, painel superior) podem contribuir para as diferenças na fosforilação do substrato. O nível de enzima SRPK1 pode determinar o seu reconhecimento do substrato e a actividade catalítica. As diferenças do nível entre os clones SRPK1 shSRPK1-C4 e shSRPK1-C5 também se reflectem na proliferação de células e a sensibilidade ao cisplatino (ver abaixo) afectada por SRPK1 regulação negativa.

análise de transferência de Western foi realizada em lisados ​​preparados a partir de células SKOV3 -derived células pSM2-EV e dois clones knockdown-SRPK1 estáveis. Os anticorpos foram utilizados para detectar as proteínas SR fosforilados (mAB104), MAPK42 /44 (

202 /Tyr

204 Thr), e AKT (Ser

473 /Thr

308), bem como de proteína total níveis de MAPK42 /44, e AKT.

que a activação

é bem conhecido, ou seja, nível elevado de fosforilação, de MAPK (quinase de proteína activada por mitogénio) e AKT vias de sinalização está envolvida em muitas doenças malignas ( 29, 30) e que estas vias regular o processamento de pré-ARNm [31], [32]. O padrão de fosforilação dos dois transdutores de chave de sinais de proliferação, p44 /42 MAPK-(ERK1 e ERK2) e AKT foi analisada nas células SRPK1 knockdown. A Figura 5 mostra que as células pshSRPK1-C4 e pshSRPK1-C5 tinham níveis reduzidos de 42-MAPK (p-MAPK) e AKT proteínas p44 fosforilado (p /-AKT). Em contraste, a quantidade total de proteínas MAPK e AKT não foi afectada pela inibição da expressão SRPK1. Os níveis reduzidos de p44 fosforilada /42-MAPK e AKT correlacionada com o crescimento mais lento das células SRPK1 knockdown (Figura 4). Estes dados sugerem que SRPK1 desempenha um papel na regulação do nível de formas activadas de MAPK e /ou proteínas AKT.

Células knockdown-SRPK1 Anexo Slower Ciclo Celular Progressão

Os dados acima descritos indicam que a inibição