Abstract

Fundo

TMEFF2 é uma proteína contendo um único tipo EGF domínio e dois módulos folistatina-like. A função biológica de TMEFF2 permanece incerto com relatos conflitantes que sugerem tanto um positivo e uma associação negativa entre a expressão de TMEFF2 e cânceres humanos.

Metodologia /Principais Achados

Aqui nós relatamos que o domínio extracelular de TMEFF2 interage com FCDP-AA. Esta interacção requer a região do terminal amino do domínio extracelular que contém os módulos folistatina e não pode ser mediada pelo domínio de tipo FCE por si só. Além disso, o domínio extracelular de TMEFF2 interfere com a proliferação de fibroblastos estimulada por PDGF-AA de uma forma dependente da dose. TMEFF2 expressão é regulada negativamente em cancros do cérebro humano e está negativamente correlacionada com a expressão de PDGF-AA. expressão reprimida de TMEFF2 está associada com a sua hipermetilação em vários tipos de tumores humanos, incluindo glioblastoma e cancros do ovário, rectal, do cólon e do pulmão origens. Análise de subtipos de glioma indica que TMEFF2 hipermetilação e expressão diminuída estão associados com um subconjunto de gliomas não proneural que não exibem ilha CpG methylator phentoype.

Conclusões /Significado

Estes dados fornecem a primeira evidência que a TMEFF2 pode funcionar para regular a sinalização de PDGF e que é hipermetilado e regulados negativamente em glioma e vários outros cancros, sugerindo assim um papel importante para esta proteína na etiologia dos cancros humanos

citação:. Lin K, Taylor JR Jr, Wu TD, Gutierrez J, Elliott JM, Verne JM, et ai. (2011) TMEFF2 é um PDGF-AA Binding Protein com metilação-Associated silenciamento gênico em vários tipos de cancro, incluindo glioma. PLoS ONE 6 (4): e18608. doi: 10.1371 /journal.pone.0018608

editor: Irina Agoulnik, Universidade Internacional da Flórida, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de dezembro de 2010; Aceito: 07 de março de 2011; Publicação: 29 de abril de 2011

Direitos de autor: © 2011 Lin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi financiado pela Genentech. O financiador teve um papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar, e preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Todos os autores eram funcionários da Genentech, quando este trabalho foi realizado. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

TMEFF2, também conhecido como tomoregulin [1], TPEF [2], HPP1 [ ,,,0],3] e TENB2 [4], codifica uma proteína transmembranar que contém um único factor de crescimento epidérmico (EGF) -like domínio e dois módulos de folistatina, do [1], [4] – [6]. A função biológica de TMEFF2 permanece elusiva com relatórios conflituosos de diferentes grupos. As formas solúveis de TMEFF2 domínio extracelular foram relatados para estimular a fosforilação da tirosina fracamente erbB-4 /HER4 na MKN 28 células de cancro gástrico [1], e promover a sobrevivência de neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo em cultura primária [6]. Como evidência para o seu papel positivo na proliferação de células, expressão de TMEFF2 elevada tem sido associada com elevado grau o cancro da próstata e a independência hormonal por vários grupos [4], [7], [8]. Em contraste, outros relataram a sub-regulação de TMEFF2 em xenoenxertos de cancro de próstata independente de androgénios, bem como a inibição do crescimento induzida pela expressão ectópica de TMEFF2 em linhas celulares de cancro de próstata independente de androgénios [5]. Além disso, o 5′-região do gene TMEFF2 é frequentemente hipermetilado em alguns tipos de câncer [2], [3], [9] – [16]., Sugerindo um possível papel supressor de tumor de TMEFF2 nestes cancros

factores de crescimento derivado de plaquetas (PDGFs) não só desempenham papéis importantes em processos fisiológicos e de desenvolvimento, mas também são directamente implicada no cancro humano e outras desordens proliferativas (revisto em [17] e [18]). O genoma humano contém quatro ligandos PDGF, PDGF-A, B, C e D, e dois receptores, PDGFRα e PDGFRβ Todos PDGFs podem formar homodímeros ligados por dissulfureto funcionais, enquanto que apenas o PDGF-A e B têm sido mostrados para formar heterodímeros funcionais. PDGFRs também funcionar como homo- e hetero-dímeros que diferem nas suas afinidades para vários dimeros de PDGF (revisto em [17] e [18]). A subunidade α do PDGFR tem sido demonstrado que se ligam a PDGF-A, as cadeias B e C, enquanto que se acredita que a subunidade β para se ligar apenas a cadeias B e D. As respostas biológicas induzidas pelas diferentes ligandos PDGF dependem dos números relativos das subunidades do receptor de um dado tipo de célula e os dímeros de PDGF específicos presentes.

proteínas contendo o módulo de foliestatina tem sido mostrado previamente para ser capaz de se ligar e modular a função de uma variedade de factores de crescimento, incluindo membros da beta-factor de crescimento de transformação (TGF-β, PDGFs, e factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) [19] – [24]. Até à data, no entanto, nenhum parceiro de ligação tem sido relatado para TMEFF2. neste relatório, foram identificados PDGF-AA como um factor de crescimento que interage com TMEFF2. Além disso, mostramos que o domínio extracelular de TMEFF2 interfere com a proliferação de fibroblastos estimulados PDGF-AA de uma maneira dose-dependente . Nossos dados fornecem a primeira evidência de que a TMEFF2 pode funcionar para regular a sinalização de PDGF, e dar novas perspectivas mecanicistas nos papéis aparentemente conflitantes de TMEFF2 em cancros humanos. Além disso, mostramos pela primeira vez que a expressão de TMEFF2 é regulada negativamente em glioma e vários outros tipos de cancro e que esta regulação baixa correlaciona-se com a metilação de DNA. Em conjunto, estes dados sugerem um papel importante de TMEFF2 no desenvolvimento e progressão de cancros humanos.

Resultados

O domínio extracelular de TMEFF2 interage com PDGF-AA

TMEFF2 está previsto para conter um domínio transmembranar (TM) com uma sequência amino-terminal (NT) péptido de sinal (SP) (Fig. 1A). As proteínas recombinantes que contêm o domínio extracelular (ECD) de TMEFF2 fundido com um marcador FLAG (TECD-FLAG) ou a porção Fc da imunoglobulina gama humana (hFcγ (TECD-Fc) no carboxi-terminal (CT) foram expressos em células de mamíferos e purificada a partir de sobrenadantes de cultura de células (Fig. 1B). a TECD-FLAG purificada e TECD-Fc correu na previu ~55 kDa e ~ 70 kDa em SDS-PAGE sob condições redutoras, respectivamente (Fig. 1C). NT sequenciação do proteínas purificadas revelou que o péptido de sinal foi clivado entre os resíduos 40 e 41 em ambas as proteínas recombinantes (Fig. 1D).

(a) hidropatia parcela de proteína de TMEFF2 com base no algoritmo de Kyte e Doolittle [53] e a estrutura do domínio previsto com base em NT sequenciação do TECD recombinante neste estudo e Horie et al., 2000 [6]. SP, péptido sinal; FS I, de domínio follistatin-like I; FS II, domínio follistatin-like II; EGF, factor de crescimento epidérmico-like de domínio; TM, domínio transmembranar; N-Gly, sítios potenciais para a glicosilação N-ligada; GAG, local potencial de fixação de glicosaminoglicanos. (B) Representação esquemática da TECD-FLAG recombinante e proteínas de fusão Fc-TECD alinhados com o comprimento completo de TMEFF2 (TMEFF2-FL). (C) purificada TECD-FLAG e TECD-Fc foram analisadas por SDS-PAGE sob condições redutoras com coloração com azul de Coomassie. (D) NT sequenciação do TECD-FLAG purificada e TECD-Fc revelou o local de clivagem do péptido de sinal. A sequência de aminoácidos identificada por sequenciação NT está sublinhado. A seta indica o sítio de clivagem do péptido de sinal.

Desde folistatina (FS) proteínas contendo o módulo têm sido mostrados para interagir com ligandos PDGF [19], foi examinada a capacidade de cada uma das 3 formas diméricas de ligandos PDGF, PDGF-AA, BB e AB, para interagir com o ECD de TMEFF2 utilizando Enzyme-Linked Immunosorbent ensaios (ELISA). Usando um biotinilado anti-PDGF-se um anticorpo, observou-se uma ligação dependente da dose quando 1 a 10 ng /ml de PDGF-AA foi adicionado à TECD-FLAG imobilizada. Uma ligação fraca foi detectada usando PDGF-BB e um anticorpo anti-PDGF-B biotinilado, ao passo que nenhuma ligação significativa foi detectada para o PDGF-AB usando o biotinilado anti PDGF-A-anticorpo (Fig. 2A). Enquanto houve apenas uma ligeira ligação entre PDGF-AA e os poços de plástico não revestidas, a ligação do FCDP-AA para TECD-FLAG imobilizada foi comparável com a sua ligação a um anticorpo anti-PDGF imobilizada sob as mesmas condições (Fig. 2A) de fundo . A ligação foi detectada nenhuma específica para uma variedade de outras proteínas examinados, incluindo os membros da família dos receptores EGF (EGFR, HER2, HER3 ou HER4) e o receptor do factor de necrose tumoral (TNFR) fundido com hFcγ. Além disso, há uma ligação significativa foi detectada entre o ECD de TMEFF2-se quando TECD-Fc foi usado como uma substância a analisar. Como um controlo positivo, um anticorpo monoclonal anti-FLAG revelou dependente da dose da ligação ao TECD-FLAG poços revestidos fig. 2B).

(A) A ligação do PDGF dimérica ligantes para poços revestidos TECD-FLAG. O PDGF-AA, AB ou BB foram aplicados aos poços TECD-FLAG revestidos (símbolos a cheio) ou poços em branco (símbolos abertos) e detectada com biotinilado anti-PDGF-A (por PDGF-AA AB) ou PDGF-B (para PDGF-BB) Anticorpos seguido por estreptavidina-HRP. poços revestidos com anti-PDGF pAb foram usadas como controlo positivo para a ligação de PDGF-AA (X). (B) A ligação de seis ECD marcado com Fc recombinantes e de uma bandeira anti-mAb para poços revestidos TECD-FLAG. HRP-conjugado anti-ratinho e anti-Fcy humanos foram usados ​​para detectar o mAb anti-FLAG e proteínas Fc-tag, respectivamente. (C) TECD-Fc foi aplicado a poços revestidos com FCDP-AA, AB ou BB e detectados com conjugado HRP-anti-Fcy humano. (D) TECD-Fc e Fc-ECD outro com etiquetas de várias proteínas transmembranares foram aplicados aos poços revestidos de PDGF-AA e detectado com conjugado HRP-anti-humano Fcy. TNFR, receptor do factor de necrose tumoral; β receptores PDGFRβ, PDGF; mOX40, OX40 murino. As barras de erro representam desvios padrão entre duplicatas. gráficos representativos de pelo menos três experiências independentes são apresentados.

Para confirmar que a ligação observada é de facto, devido à interacção entre o PDGF-AA e de TMEFF2-ECD, que, em seguida, o PDGF imobilizada ligandos nas placas , e aplicado a TMEFF2-ECD fundida com uma marcação diferente, TECD-Fc, tal como um analito. Consistente com os resultados obtidos com imobilizada TECD-FLAG, TECD-Fc exibiu dependente da dose significativa de ligação apenas para imobilizada PDGF-AA, mas não AB, BB, CC ou DD (Figura 2C;.. Suplementar Fig S1A). Resultados semelhantes foram obtidos usando o marcador livre plataforma ForteBio (Menlo Park, CA) para medir a ligação de PDGF a TMEFF2-FLAG biotinilado imobilizado no sensor revestida com estreptavidina. PDGF-AA mostrou a mais forte ligação a TMEFF2 enquanto afinidades PDGF-BB, AB, CC, e DD mostraram fortemente reduzida (dados não mostrados). Um receptor para o PDGF recombinante solúvel do domínio extracelular α (sRa), por outro lado, mostrou dependente da dose a ligação a todas as três imobilizada dímeros de PDGF AA, AB e BB (Fig suplementar. S1B), enquanto que o receptor de PDGF βECD-Fc (PDGFRβ- Fc) de proteínas de fusão não foi capaz de se ligar FCDP-AA (figura 2D), consistentes com a especificidade relatada destes receptores [25] – [27].

TMEFF2 interage com FCDP-AA através do seu módulo de FS. região molecular contendo quando expresso na superfície de células de mamífero

para determinar se o ECD de TMEFF2 pode interagir com o FCDP-AA quando expresso na superfície de células de mamífero, que células 293 transfectadas com construções que contêm a full-length TMEFF2 (TMEFF2-FL), ou um TMEFF2 truncada sem o domínio intracelular (TMEFF2-ΔICD) (Fig. 3). PDGF-AA ou PDGF-AB foi então adicionada ao meio de cultura e deixou-se ligar à superfície da célula durante 30 minutos. ligandos PDGF não ligados foram subsequentemente lavadas e os lisados ​​celulares foram sujeitos a imunoprecipitação com um anticorpo policlonal (PAB) que reconhece tanto o PDGF-AA e AB dímeros, ou um pAb reconhecendo o ECD de TMEFF2. Como mostrado na Fig. 3 Fig suplementar. S8, um anti-PDGF-A anticorpo pode detectar a desnaturado PDGF-monómero nos imunoprecipitados anti-PDGF a partir de células incubadas com PDGF-AA ou PDGF-AB, o que sugere que ambos os dimeros de PDGF ligado à superfície celular, através de interacções com receptores específicos ou proteínas da matriz extracelular (ECM). No entanto, PDGF-A foi detectada nos imunoprecipitados anti-TMEFF2 apenas a partir de células incubadas com o FCDP-AA, mas não a partir das incubadas com PDGF-AB. Além disso, PDGF-AA estava presente em imunoprecipitados anti-TMEFF2 a partir de células que expressam quer o comprimento total de TMEFF2 ou TMEFF2 o truncado-CID. Isto é consistente com o resultado de ELISA mostrando que o PDGF-AA, mas não PDGF-AB exibiu ligação para o ECD de TMEFF2 dependente da dose.

múltiplas bandas de TMEFF2-FL e TMEFF2-ΔICD foram detectadas pelo anti- TMEFF2 mAb devido a diferentes graus de glicosilação e apego proteoglicanos [4]. mAb, um anticorpo monoclonal; PAB, anticorpo policlonal de coelho; Ig LC, cadeia leve do Ab utilizado para a imunoprecipitação.

TMEFF2 contém 2 FS módulos e um domínio do tipo EGF. Para dissecar os domínios de TMEFF2 estão envolvidos na sua interacção com os FCDP-AA, fizemos Herpes simplex tipo 1 glicoproteína D (gD) do -epitope etiquetado mutantes de deleção de TMEFF2 e analisou a sua capacidade para se ligarem FCDP-AA quando expresso na superfície de 293 células (Fig 4 .. suplementar Fig S8). Como esperado, PDGF-AA-co-imunoprecipitada com gD com etiquetas de TMEFF2 de comprimento total por um anticorpo monoclonal anti-gD. No entanto, quando gD-tagged mutantes TMEFF2 falta ou o NT FS I (gD-TMEFF2-ΔFS I) ou de ambos os módulos FS (gD-TMEFF2-ΔFS I /II) foram imunoprecipitados com o mesmo anticorpo anti-gD, não PDGF -AA foi derrubado, embora ambas as proteínas mutantes TMEFF2 foram derrubados nos imunoprecipitados. A análise FACS também confirmou a expressão de membrana de todas as 3 proteínas gD-tag (Supplemental Fig. S2). Isto sugere que as regiões NT contendo o domínio I FS são necessários para a interacção de PDGF-AA, ao passo que EGF domínio si só é insuficiente para esta interacção. Consistente com este resultado, um recombinante marcada com His em tandem-matriz do domínio EGF de TMEFF2 também não conseguiu mostrar ligação específica a placas revestidas com FCDP-AA-por ELISA (dados não mostrados).

múltiplas bandas de TMEFF2 -FL e TMEFF2-ΔFS I foram detectados pelo TMEFF2 anti-mAb devido a diferentes graus de glicosilação e apego proteoglicanos [4].

TMEFF2 modula a proliferação estimulada por PDGF de fibroblastos NR6

ligandos PDGF são mitogénios potentes das células do tecido conjuntivo, incluindo f ibroblastos, células de músculo liso, condrócitos, e algumas células endoteliais [17], [28], [29]. A constatação de que TMEFF2 interage com PDGF-AA em ng /ml concentrações de ambos recombinante TMEFF2 ECD e PDGF-AA nos levou a examinar a possibilidade de que TMEFF2 pode regular a sinalização de PDGF-AA. Em primeiro lugar, se solicitado PDGFRα, o único receptor que se liga FCDP-AA, pode competir com TECD para a ligação do FCDP-AA. Como mostrado na Fig suplementar. S1C, TECD-Fc de ligação para o FCDP-AA placa revestida foi bloqueada por o domínio extracelular solúvel de PDGFRα, sRa, de uma forma dependente da dose, indicando que a TMEFF2 ECD e sRa ligam-se PDGF-AA em locais que se sobrepõem.

a seguir, examinou o efeito de TMEFF2-ECD em PDGF estimulou a proliferação. A linha de células de fibroblasto de murino NR6 expressa ambos os receptores de PDGF e α β [30], e exposições dependente da dose da proliferação em resposta a PDGF-AA ou PDGF-AB como medido por incorporação de BrdU (fig. 5A, C). Quando 10 ng mL de PDGF-AA /foi adicionada na presença de concentrações crescentes de TECD Fc-etiquetado, a incorporação de BrdU foi inibida de uma maneira dependente da dose em concentrações entre 0,6 e 2,000 ng /ml de TECD-Fc (Fig. 5B) . Este efeito foi semelhante à do sRa que também inibiram a incorporação de BrdU induzida por PDGF-AA a uma gama de concentração semelhante, embora com uma eficiência ligeiramente superior. PDGF-AB induzida por incorporação de BrdU, por outro lado, não foi afectada pela TECD-Fc nas mesmas condições (Fig. 5D). Curiosamente, sRa também teve pouco efeito sobre a proliferação induzida por PDGF-AB, embora consistente com relatórios anteriores [31], PDGF-AB se podia ligar sRαwith uma afinidade semelhante a PDGF-AA (Suplementar Fig. S1B). Isto pode ser devido à capacidade de PDGF-AB para se ligar a todos os 3 PDGFR dímeros, αα, αβ ou ββ [26], enquanto que o PDGF-AA pode sinalizar apenas através PDGFR αα dimers.It é possível que o PDGF-AB pode ter um maior afinidade para o receptor de PDGF nativa αβ dímeros do que para sRa, ou que não pode ser mais abundante do receptor de PDGF αβ dímeros e /ou receptor de PDGF ββ dímeros sobre estas células

(a) estimulação (C) dose-dependente da incorporação de BrdU por PDGF-AA e PDGF-AB em células de NR6. (B) (D) Efeito de concentrações crescentes de TECD-Fc (barras a cheio) ou PDGF sRa (barras em branco), em 10 ng /mL de PDGF-AA (B) ou PDGF-AB (D) estimulou a incorporação de BrdU.

expressão de TMEFF2 é regulada negativamente em cancros cerebrais e está negativamente correlacionada com PDGF-A expressão

O 5′-região do gene TMEFF2 é frequentemente hipermetilado em alguns tipos de câncer [2], [3], [9] – [16], sugerindo um possível papel supressor de tumor para TMEFF2 nestes cancros. Para comparar os níveis de expressão de TMEFF2 em tecidos humanos, foram analisados ​​dados de microarray Affymetrix obtidos a partir GeneLogic, Inc. (Gaithersburg, MD) contendo múltiplos tumores humanos e amostras de tecidos normais. Os níveis mais elevados de expressão de TMEFF2 foram encontrados em tecidos cerebrais e da próstata (Suplementar Fig. S3, S4).

in situ

elevados níveis de experiências de hibridação confirmados de expressão de ARNm de TMEFF2 em adulto normal e os sistemas nervoso central fetal, bem como ambos os tecidos da próstata malignas e não-malignas (Suplementar Fig. S5). O nível de expressão de TMEFF2 média é significativamente mais elevada em tecidos de cancro da próstata em comparação com os tecidos normais da próstata (Fig 6A;.. Suplementar Fig S3, S4), consistente com relatos anteriores [7]. Em contraste, exposições TMEFF2 significativamente mais baixos níveis médios de expressão em amostras cerebrais malignos, especialmente em glioblastomas (GBMs), em comparação com tecidos normais do cérebro (Fig 6B;.. Suplementar Fig S3, S4). A maioria dos outros tecidos expressam TMEFF2 em níveis muito mais baixos do cérebro e da próstata. Vários tecidos também mostram uma tendência de diminuição da expressão em cânceres, como o colo-rectal, esófago e do estômago, com diferença estatisticamente significativa em amostras de câncer colorretal em comparação com tecidos normais do cólon (Supplemental Fig. S3, S4). Estes dados são consistentes com um possível papel supressor de tumores de TMEFF2 nestes tecidos.

(A) Affymetrix intensidade de sinal de expressão de TMEFF2 em cancro da próstata vs tecidos não-cancerosas com base em dados GeneLogic. (B) Affymetrix intensidade do sinal de expressão TMEFF2 em cerebral normal vs tecidos de câncer de cérebro com base em dados GeneLogic. Cada círculo aberto no (A) (B) representa uma amostra do paciente. Os diagramas de caixa e bigode também estão incluídos no âmbito dos dados brutos para indicar a média e os intervalos percentuais 25 e 75. Os bigodes são atraídos a 1,5 vezes a amplitude interquartil da caixa. (Acampamento; (D) sinais normalizados de TMEFF2 (C) e a expressão de ARNm de PDGF-A (D), em proneural (PN), proliferativa (Prolif), ou mesenquimais (MES) subtipos de 36 amostras de glioma. sinais médios para cada subtipo são mostrados como inserções. *

p

≤0.05; **,

p

≤0.005. (E) TMEFF2 expressão está negativamente correlacionada com a expressão de PDGF-A, em 133 (76 MD Anderson e 57 UCSF) amostras HGG (coeficiente de correlação de Pearson r = -0,37). Cada eixo representa sinais normalizados de cada gene. Todos os dados de expressão foram obtidos usando Affymetrix HG-U133A e HG-U133B GeneChips de 223557_s_at sonda para TMEFF2 e 205463_s_at para PDGF-A, respectivamente.

gliomas de alto grau (HGGs) foram classificadas em três molecular subtipos com base na semelhança com assinaturas de expressão definidos: proneural (PN), proliferativa (Prolif) e mesenquimais (MES) [32]. O subtipo expressa proneural genes associados com cérebro normal e o processo de neurogenesis. Este subtipo tem sido associada a um melhor prognóstico [32], e, recentemente, tem sido associada a um subconjunto de tumores que exibem um glioma de CpG island methylator fenótipo (L-CIMP) e isocitrato desidrogenase 1 (IDH1) mutação (ver abaixo) [33 ]. Em contraste, os outros dois subtipos são de prognóstico pobre [32], e caracterizam-se por uma semelhança de linhas celulares de altamente proliferativas ou tecidos de origem mesenquimal, com programas de expressão do gene indicativos da proliferação celular ou angiogénese, respectivamente. análise de microarray de TMEFF2 em um conjunto de 36 amostras de HGG que incluiu 12 casos prototípicos de cada subclasse [32], [34] revelaram níveis significativamente mais elevados de expressão de TMEFF2 na subclasse PN do que os Prolif MES e subclasses (Fig. 6C). Curiosamente, PDGF-A mostrou um quase espelho-imagem, tendência oposta com a expressão mais elevada na subclasse MES (Fig. 6D). Uma tal tendência não foi observada para o PDGF-B nestas amostras (dados não mostrados). Uma análise mais aprofundada dos dados de microarranjos em 76 amostras HGG de MD Anderson Cancer Center (MDA) e 57 amostras HGG da Universidade da Califórnia, San Francisco (UCSF) sugere uma correlação negativa entre TMEFF2 e PDGF-A expressão em ambos os conjuntos de amostras (Fig 6E. ). Estes dados são consistentes com a hipótese que o PDGF-AA pode ser um importante factor de crescimento necessário para o desenvolvimento de não-HGGs PN, e que a expressão de TMEFF2 pode ser seleccionado contra nestes HGGs que são dependentes de sinalização de PDGF-AA.

TMEFF2 é hipermetilado em múltiplos tipos de tumores, com a sua expressão negativamente correlacionada com os níveis de metilação

hipermetilação do gene TMEFF2 em cancros humanos tem sido reportada em vários tecidos, incluindo o colorrectal, cancros gástricos e esofágicos [2], [ ,,,0],3], [9] – [12], [16]. No entanto, estes tecidos expressam níveis muito baixos de TMEFF2 mesmo em amostras normais, tornando o significado de supressão do gene menos clara nestes tumores. Uma vez que o estado de metilação de TMEFF2 não tem sido relatada em glioma e a maioria dos outros tecidos, analisamos todos os dados disponíveis publicamente do Cancer Genome Atlas (TCGA) com resultados em ambos expressão Agilent e matrizes de metilação Infinium [35]. Dos sete tipos de tumores onde se encontram actualmente disponíveis estes dados, apenas o glioblastoma, e amostras de cancro do ovário e, ocasionalmente, rectais apresentam níveis significativos de expressão de TMEFF2 (Fig. 7). Todas as amostras com níveis elevados de expressão de TMEFF2 correspondem aos baixos CpG estados ilha de metilação, enquanto as amostras com um valor de metilação beta superior a 0,1 têm uma expressão reprimida de TMEFF2, o que é especialmente evidente nas amostras de GBM (teste t de p-value 4 × 10

-14). expressão de TMEFF2 é dificilmente detectável em quase todos adenocarcinoma de cólon, câncer de reto, adenocarcinoma de pulmão e amostras de carcinoma de células escamosas do pulmão. Embora a maioria destas amostras tumorais mostram metilação beta valores superiores a 0,1, não existem dados suficientes disponíveis para determinar se os diferentes limiares de valores beta metilação existir em diferentes tipos de tumores para a expressão de TMEFF2 suprimida, ou outros mecanismos existem para suprimir a sua expressão. No entanto, tomados em conjunto com outros relatórios publicados de TMEFF2 metilação em outros tipos de tumores, estes dados são consistentes com a hipótese de que a TMEFF2 é silenciado por meio de metilação do DNA em uma proporção significativa de cancros humanos, incluindo os gliomas e os cancros do ovário, rectal, do cólon e do pulmão origens.

os níveis de metilação são representados no eixo dos x pela média dos valores da beta Infinium duas sondas, e cg06856528 cg18221862, e os níveis de expressão de ARNm obtido no chip Agilent são representados no eixo dos y.

recentemente, um subconjunto de gliomas com o promotor característica alterações de metilação do DNA, referido como L-CIMP, foram identificados no contexto de amostras TCGA GBM [33]. Curiosamente, os tumores L-CIMP-positivos pertencem a um subconjunto de tumores proneural e está intimamente associada com mutação IDH1. Estes tumores têm um prognóstico favorável no GBMs como um todo e também dentro do subconjunto proneural. Para entender a relação entre TMEFF2 metilação ea assinatura G-CIMP, comparamos o status de metilação TMEFF2 contra o conjunto de amostras TCGA GBM com disponíveis G-CIMP e IDH1 informações mutação. Das amostras analisadas por TCGA Noushmehr et ai. [33], 88 sobreposto com as amostras que analisamos usando o conjunto de dados disponíveis ao público. 76 destes eram G-CIMP-negativas e 12 eram G-CIMP-positivo. Todas as amostras de G-76 CIMP-negativas foram negativos para a mutação IDH1, enquanto todas as amostras de G-12 CIMP-positivos foram positivos para a mutação IDH1.