Abstract

Ao contrário da medicina ocidental, que geralmente usa compostos purificados e objetivos para atingir uma única molécula ou caminho, composições medicina tradicional chinesa (MTC), geralmente compreendem várias ervas e componentes que são necessários para a eficácia. Apesar do muito longo tempo e uso generalizado de TCM, há muito poucas comparações diretas de TCM e quimioterapia citotóxica padrão. No presente relatório, que comparou a eficácia do TCM LQ mistura de ervas contra câncer de pulmão em modelos de rato com a doxorrubicina (DOX) e ciclofosfamida (CTX). LQ inibida tamanho e peso medidos directamente, bem como por imagiologia fluorescente-proteína em subcutânea, ortotópicos, espontâneas metástase e angiogénese de ratinho modelos experimentais de cancro do pulmão de tumor. LQ foi eficaz contra o câncer de pulmão primário e metastático, sem perda de peso e toxicidade de órgão. Em contraste, a CTX e DOX, embora eficaz em modelos de câncer de pulmão causado perda de peso significativa e toxicidade de órgão. LQ também tinha actividade anti-angiogénica, como observado em tumores pulmonares em crescimento em murganhos nude transgénicos impulsionado-nestina proteína fluorescente verde (GFP) ND-, que expressam GFP selectivamente nos vasos sanguíneos nascentes. A sobrevivência de ratinhos portadores de tumor foi também prolongada por LQ, comparável a DOX.

In vitro

, as células de câncer de pulmão foram mortos por LQ como observado por imagem time-lapse, comparável a cisplatina. LQ foi mais potente para induzir a morte celular em linhas celulares de cancro do que linhas de células normais, ao contrário da quimioterapia citotóxica. Os resultados indicam que LQ tem eficácia não tóxico contra o cancro do pulmão metastático

citação:. Zhang G, Wu C, Zhang Y, Liu M, Wang X, Zhao, M. et al. (2014) Comparação de eficácia e toxicidade de Medicina Tradicional Chinesa (MTC) LQ mistura de ervas e quimioterapia convencional on Lung Cancer Metástase e Sobrevivência no mouse modelos. PLoS ONE 9 (10): e109814. doi: 10.1371 /journal.pone.0109814

editor: Beicheng Sun, The Hospital Primeira Affiliated da Universidade Médica de Nanjing, China

Recebido: 07 de fevereiro de 2014; Aceito: 13 de setembro de 2014; Publicação: 06 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por CA132971 concessão National Cancer Institute e conceder BA2011019 do Jiangsu Ciência e Tecnologia Conquistas transformação temática Fundos especiais, China. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Lei Zhang, Yong Zhang, Xiaoen Wang e Ming Zhao são afiliadas da AntiCancer Inc. fang Liu era um ex-afiliada da AntiCancer Inc. Robert M. Hoffman é uma filial não-remunerada da AntiCancer Inc. AntiCancer Inc. comercializa modelos animais de câncer. Não há outros interesses concorrentes. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

O câncer de pulmão é a principal causa de câncer morte com cancro do pulmão de células não pequenas-(NSCLC) representando cerca de 80% das neoplasias malignas torácicas. A 5 anos de sobrevida global em NSCLC continua pobre, cerca de 16%. O cancro do pulmão tem mostrado pouca melhora na sobrevida para os últimos 30 anos [1]. Novas abordagens para o tratamento de câncer de pulmão são urgentemente necessárias. produtos naturais são recursos importantes para o desenvolvimento de drogas. Para a doença do cancro, 60% das novas drogas, são originários a partir de fontes naturais. Existe actualmente um interesse crescente na medicina tradicional chinesa (MTC) misturas de ervas que têm sido usados ​​para tratar o câncer há milhares de anos na China. Ao contrário da medicina ocidental, que geralmente usa compostos purificados e visa atingir uma única molécula ou caminho, composições TCM normalmente compreendem várias ervas e componentes. Há muita evidência anedótica da eficácia do TCM sob a forma de misturas de ervas em pacientes com câncer [2] – [9].

Em um estudo anterior, que determinou a eficácia inibidora da erva TCM Celastrus orbiculatus Thunb . (COT) sobre o crescimento tumoral, metástase e antiogenesis de células de carcinoma hepatocelular (HCC) Hep-G2 em um modelo de rato nu ortotópico usando tecnologia de imagem de fluorescência. imagens de fluorescência de corpo inteiro foi realizada para medir o crescimento do tumor e monitorar o desenvolvimento de metástases. Altas doses de, tratamento precoce com COT demonstrou uma eficácia significativa no controlo do volume do tumor e peso do tumor no modelo tumoral ortotópico HCC Hep-G2 humano [4].

A eficácia da tubeimu TCM erva, extraiu-se a partir do tubérculo da planta

Bolbostemma paniculatum

foi testado em MDA-MB-231 células de câncer de mama humano

in vitro

. A linha celular MDA-MB-231 foi modificado para expressar RFP no citoplasma e GFP ligado a histona H2B no núcleo, o que permite a imagem em tempo real da dinâmica nuclear-citoplasmáticos. A apoptose foi prontamente visualizados nestas células por mudanças de forma nucleares e fragmentação. As células RFP-GFP MDA-MB-231 foram cultivadas quer em duas dimensões sobre plástico ou em três dimensões em Gelfoam. As células foram tratadas com um extracto de diclorometano de tubeimu fresco. Tubeimu induzida a apoptose das células MDA-MB-231, como observado por microscopia de fluorescência, tão cedo quanto 24 horas de tratamento in vitro em cultura bidimensional. Por tratamento de 48 horas, a fragmentação do ADN pode ser observada. Tubeimu também induziu apoptose de células MDA-MB-231 em cultura tridimensional sobre o Gelfoam, mas em menor grau do que em cultura 2D [5].

Apesar do muito longa história e generalizada da utilização TCM, há muito poucas comparações diretas de TCM e quimioterapia citotóxica padrão. Temos anteriormente desenvolvida uma formulação de ervas TCM, LQ, que tem sido demonstrado que têm potentes propriedades terapêuticas não-tóxicos em clinicamente e em modelos de ratos ortotópicos de cancro do pâncreas [6]. Nós comparamos LQ a gemcitabina, que é terapia de primeira linha para câncer de pâncreas para a atividade-tumoral anti anti-metastático e, assim como a segurança. A eficácia terapêutica do LQ foi comparável com gemcitabina, mas com menor toxicidade [6].

No presente relatório, foram utilizados modelos tecnológicos e de animais imagens de fluorescência estado-da-arte para comparar a eficácia e toxicidade de LQ a doxorrubicina (DOX) e ciclofosfamida (CTX) sobre o cancro do pulmão. Com a utilização de GFP e /ou RFP expressa de forma estável em células de cancro humano ou ratinhos, a eficácia da LQ foi comparado com quimioterapia padrão sobre o crescimento tumoral e metástase, assim como angiogénese.

Nós demonstramos aqui que tem LQ antitumoral , a eficácia anti-metastático e anti-angiogênico em modelos do rato clinicamente relevantes de câncer de pulmão comparável a doxorrubicina e ciclofosfamida, sem a sua toxicidade.

Materiais e Métodos

declaração Ética

Todos os estudos com animais foram realizados com uma Comissão AntiCancer Institutional animal Care e Uso (IACUC) -protocol aprovado especificamente para este estudo e de acordo com os princípios e procedimentos descritos no Instituto Nacional de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais sob Assurance número A3873-1. A fim de minimizar o sofrimento dos animais foram utilizados a utilização de anestesia e analgésicos para todas as experiências cirúrgicos. Os animais foram anestesiados com uma mistura de 20 mL de cetamina (22-44 mg /kg), acepromazina (0,75 mg /kg), e xilazina (2-5 mg /kg) por injecção intramuscular de 10 minutos antes da cirurgia. A resposta dos animais durante a cirurgia foi monitorizada para assegurar adequada profundidade da anestesia. Ibuprofeno (7,5 mg /kg por via oral na água de beber a cada 24 horas, durante 7 dias pós-cirurgia) foi utilizado a fim de proporcionar analgesia pós-operatório nos animais tratados cirurgicamente. Os animais foram observados diariamente e humanamente sacrificados por CO

2 inalação quando se encontraram os seguintes critérios endpoint humanas: prostração, lesões de pele, perda significativa de peso corporal, dificuldade respiratória, epistaxe, movimento de rotação e queda de temperatura corporal. A utilização de animais foi necessário entender a eficácia in vivo, em especial a eficácia, anti-metastático dos agentes testados. Os animais foram alojados com não mais do que 5 por gaiola. Os animais foram alojados em uma instalação de barreira em um ar de alta eficiência (HEPA) cremalheira filtrado por sob condições padrão de 12 horas ciclo claro /escuro. Os animais foram alimentados com uma dieta de laboratório roedores autoclavada.

As linhas celulares e de cultura de células

linhas celulares de cancro do pulmão humano H460 [12], A549 [13], carcinoma do pulmão de rato Lewis (LLC) [ ,,,0],14], e a linha de macaco normais de células endoteliais de rim (VERO) [15] foram mantidas em meio RPMI-1640 (Hyclone, Sul Logan, UT) com soro fetal bovino a 10% (Gemini Bio-Products, Calabasas, CA). As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) [16] foi mantida em meio EGM-2 Bulletkit (Lonza, Anaheim, CA). As células

LLC expressa estavelmente a proteína fluorescente vermelha (RFP), como previamente descrito [10] , [11]. As células H460 expressa estavelmente verde proteína fluorescente (GFP), como descrito anteriormente [12], [17] – [19]. H460 células de duas cores de GFP expresso ligada a histona H2B no núcleo, como descrito anteriormente [20] – [22].

Ratos

ratinhos nus atímicos (

nu /nu

) e murganhos C57BL /6 (AntiCancer Inc., San Diego, CA), 6-8 semanas de idade, foram utilizados neste estudo. -driven nestina-GFP (GFP-ND) transgénico C57 /B6 ratinhos nus (AntiCancer, Inc.) que expressa GFP sob controlo do promotor de nestina foram também usadas [23] – [26]. Não transgénicas C57 B /6 murganhos (AntiCancer, Inc.) também foram utilizados.

subcutânea

crescimento tumoral

A549, H460, LLC, e H460-GFP células foram colhidas por trypzinization e lavada duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Hyclone, Sul Logan, UT). As células (5 × 10

6) foram injectados por via subcutânea no flanco direito de ratos num volume total de 100 ul de PBS no prazo de 30 min de colheita. Os tumores subcutâneos foram também usadas como a fonte de tecido para implante ortotópico no pulmão.

implante ortotópico cirúrgico (SOI)

peças tumorais (1 mm

3) derivada de H460- tumores subcutâneos GFP que crescem no ratinho nu foram implantados por implante ortotópico cirúrgica (SOI) [27] para a pleura visceral deixado em coortes de ratos adicionais nus [12], [28] – [30]. Os ratinhos foram anestesiados com isoflurano inalação. Uma pequena incisão transversal cm 1 foi efectuada no lado esquerdo do peito-lateral dos ratinhos nus por meio do quarto espaço intercostal. Uma pequena incisão (0,4-0,5 cm) entre a terceira e quarta costela na parede do peito fornecido acesso ao espaço pleural e resultou em colapso pulmonar total. fragmentos de tumor (1 mm

3) foram costurados com um 8-0 sutura cirúrgica e fixo, fazendo um nó. O pulmão foi recolhido por meio de fórceps e o fragmento do tumor cosido na parte inferior do pulmão com uma sutura. O tecido pulmonar foi, então, voltou para a cavidade torácica. Os músculos do peito e pele foram fechados com uma sutura cirúrgica 6-0. A condição fechada da parede torácica foi examinado imediatamente e, se um vazamento existiu, foi fechado por suturas adicionais. Depois de fechar a parede torácica, o pulmão era un-inflado pela retirada do ar da cavidade torácica com uma de calibre 25 ½ agulha. Após a retirada de ar, um pulmão completamente insuflado pode ser visto através da parede torácica fina do rato. Em seguida, o músculo e pele foram peito fechado com uma sutura cirúrgica 6-0 em uma camada. Todos os procedimentos da operação descrita acima foram realizados com um 7 × microscópio [12].

metástase Experimental modelo singênica rato

células LLC-RFP (2 × 10

6) foram colhidas por tripsinização e lavadas com PBS frio, em seguida, injectada na veia da cauda de /6 ratinhos nus ou C57B num volume total de 100 ul com um 1 ml de calibre 29, a seringa sem látex até 30 minutos após a colheita. A semeadura e prisão de células cancerosas individuais no pulmão, acumulação de êmbolos de células do cancro, a viabilidade das células do cancro, e a formação de colónias metastático foram fotografadas no dia 14 após a injecção das células [31]. As imagens isoladas de pulmões excisados ​​dos ratos no modelo de metástases experimentais foram obtidos com o animal OV100 pequeno sistema de imagem (Olympus Corp., Tóquio, Japão). A área de fluorescência e de pulmão peso vermelha totais foram medidos para carga metastático. As imagens foram analisadas usando Imagiologia-Pro Plus 6.0 software (MediaCybernetics Inc., Rockville, MD).

com código de cores angiogênese modelo

ratos nus transgênicos

ND-GFP, de 6 a 8 semanas de idade , foram usados. Os camundongos foram anestesiados e células LLC-expressando RFP (5 × 10

5 células em 25 ul) foram injectadas na pele da orelha e da almofada da pata da ratinhos nus ND-GFP com uma seringa sem látex 1 ml 27G½ [ ,,,0],32]. O comprimento total dos vasos sanguíneos que expressam GFP e intensidade de fluorescência foram quantificadas. As imagens foram analisadas com Imagiologia-Pro Plus 6.0 software (MediaCybernetics Inc.).

Avaliação da eficácia

in vivo

A eficácia do tratamento foi determinada por medidas padrão de tumor volume e o peso do tumor nos modelos subcutâneos. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula (diâmetro longo × diâmetro curto

2) /2. Nos modelos ortotópicos, os ratinhos foram sacrificados e explorado quando apareceram pré-mórbido. Após a eutanásia, cada rato foi submetido a laparotomia e esternotomia mediana e foi então trabalhada, a fim de identificar tumores primários e metastáticos por RFP imagiologia ou de fluorescência de GFP. O Sistema de Imagem OV100 Small Animal foi utilizado [33]. Após a realização de corpo inteiro, a imagem aberta, os órgãos sólidos foram cuidadosamente examinados para qualquer evidência de metástase. O peso corporal, a estrutura de observação do órgão, e aparência geral de cada rato foram monitorados e gravados como evidência de toxicidade sistémica

hematoxilina e eosina (H E). coloração

O coração, fígado, baço , pulmão, rim e intestino de ratinhos de cada grupo foram recolhidas e incorporadas em matriz de tecido congelado (PTU) e imediatamente congelados com azoto líquido. Todos os tecidos foram preparados como se cortes congelados e cortados em lâminas 5 um de espessura para a H E de coloração. As estruturas histopatológicos de diferentes órgãos foram examinadas usando um microscópio Olympus BH-2.

Preparação de extratos de ervas chinesas

LQ é uma mistura de ervas medicinais chinesas, compreendendo

Sinapis alba , Atractylodes macrocephala, Coix lacryma-jobi

, e

Polyporus adusta Comprar e preparada pela Faculdade de Farmácia da Universidade de Nanjing de Medicina tradicional chinesa como relatado anteriormente [6]. A razão usada (2:3:4:3) é a partir de plantas secas. As partes de plantas utilizadas eram

Sinapis Albe:

sementes;

Atractylodes macrocephala:

raiz;

Coix lacryma-jobi:

do kernel;

Polyporus adusta

: Cogumelo todo. Seguimos US farmacopeias UPS231 para testes de metais pesados. Todas as ervas foram testadas e os níveis de metais pesados ​​foram inferiores a dose mínima diária US Pharmacopoeias. Cada erva foi extraído em água a ferver durante 20 min, a solução foi filtrada. O resíduo foi extraído com 75% de etanol, e o extracto foi filtrado. Tanto o extracto de água e extracto etanólico foram combinadas e concentradas por liofilização. Para se obter 100 mg de LQ requerido 402 mg de ervas secas. O pó liofilizado foi suspenso em PBS. A mistura foi agitada em vórtice durante 1 minuto e incubado a 80 ° C durante 30 min. A amostra foi arrefecida até à temperatura ambiente e foi então centrifugada a 2000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi recolhido a uma concentração final de 90 mg /ml. LQ foi então diluída para experimentos com doses escalonadas nos modelos de rato ou filtrada através de uma membrana de 0,2 mm para

in vitro Use.

In vivo

dosagem era por sonda.

Drugs

Doxorobucin (DOX) (Bedford Laboratories, Bedford, OH), cyclophosphonate (CTX) (Sigma, St. Louis, MO), Pingxiao (PX) (CP Pharmaceutical Co., Ltd., Xian, China), cisplatina (CDDP) (Dong-A Pharmaceutical Co., Seul, Coreia do Sul) e paclitaxel (Taxol) (Bedford Laboratories, Bedford, OH ) foram utilizados.

imagem Time-lapse de células dual-cores H460

a FluoView FV1000 microscópio confocal laser (Olympus Corp., Tóquio, Japão) foi utilizado para a imagem H460 células dual-cores tratadas com LQ e CDDP para geração de imagens de lapso de tempo. As imagens de alta resolução foram capturados directamente para um período de 72 horas com intervalos de 30 min a 37 ° C.

MTS ensaio

As células foram expostas a várias concentrações de LQ e agentes quimioterapêuticos para 72 horas. O número de células viáveis ​​foi subsequentemente determinada utilizando o Cell Titer 96 Aqueous ensaio de proliferação de células One Solution (Promega, Madison, WI) como descrito no manual de instruções.

A análise estatística

Os dados foram analisados ​​usando Estudante de

t

-teste. A análise de Kaplan-Meier com um teste de log-rank foi utilizado para determinar a sobrevivência e diferenças entre os grupos de controle e tratamento. A

p valor

de ≤0.05 foi definido como estatisticamente significativo.

Resultados e Discussão

Comparação de eficácia da LQ e CTX em modelos de ratos subcutâneas de câncer de pulmão

Foi testada a eficácia de diferentes doses de LQ e CTX em diferentes linhas celulares de cancro de pulmão

in vivo

. H460, A549, e LLC células crescendo subcutaneamente durante 7 dias em ratinhos nus foram tratados com LQ (150, 300, e 600 mg /kg) durante 10 dias, o TCM ervas mistura PX [34] (600 mg /kg, diariamente gavagem) durante 10 dias, ou CTX (30 mg /kg /dose IP diariamente) durante 7 dias. No grupo de controlo, os ratinhos receberam PBS por administração oral. O crescimento do tumor medido pelo tamanho foi significativamente inibida por LQ em doses de 150 mg /kg, 300 mg /kg, e 600 mg /kg de um modo dependente da dose (Figura 1A-F) (todos p 0,01). peso final do tumor também foi diminuída após o tratamento LQ em todas as doses (todos p 0.01) significativamente (Figura 1G). CTX e PX também inibiu o tamanho do tumor e peso do tumor de forma significativa, em comparação com os ratinhos de controlo (todos p 0,01) (Fig. 1A-G). LQ (600 mg /kg) foi mais eficaz do que o PX (600 mg /kg), com base no tamanho e peso (todos com p 0,01) do tumor. (Fig. 1D, E, F e G)

Pela H460 e A549 de células linhas, cada grupo de tratamento continha 6 ratos e 10 ratinhos foram usados ​​para os grupos de controlo não tratados. Para a linha celular de LLC, cada grupo de tratamento continha 8 ratos e 16 ratinhos foram utilizados para o grupo de controlo não tratado. Após os tumores subcutâneos cresceu, foram dadas aos ratinhos nus quer CTX (30 mg /kg /dia i.p.), durante 7 dias ou PX (600 mg /kg /dia p.o.) durante 10 dias. PBS (PO) foi utilizado no grupo de controlo. Os ratinhos foram tratados com 150, 300, e 600 mg /kg /dia de LQ (po) durante 10 dias. O tamanho do tumor foi medido duas vezes por semana. O peso do tumor foi medido no ponto de extremidade. A significância estatística entre os grupos foi determinada com o Student

t

-teste. H460 (A D), A549 (B E), e LLC (C F) era a inibição do crescimento e a inibição do tamanho do tumor após o tratamento com todos os agentes. O peso do tumor também foi significativamente inibida por todos os agentes (G) (

P 0,01)

. Após o tratamento LQ, o crescimento do tumor de pulmão e o peso do tumor foi significativamente inibido, comparado com o grupo de controlo não tratado em todos os modelos (

P 0,01

). CTX e tratamento PX resultou numa inibição significativa do peso do tumor (

P

0,01) em comparação com o grupo de controlo para todas as linhas celulares. LQ tinha mais eficácia do que o PX (

P 0,05

) em todas as linhas de células (g). CTX perda induzida de peso corporal (

p

0,05)., Mas não LQ ou PX (H)

Foi observado o peso corporal e aparência geral de cada rato durante os experimentos e no ponto final. O peso corporal em ratinhos tratados com CTX diminuiu significativamente após o tratamento (

P 0,05

) e recuperou-se lentamente após a cessação do tratamento. No entanto, não houve diminuição no peso corporal em grupos LQ com todas as dosagens. (Fig. 1H). O coração, fígado, baço, pulmão, rim e intestino de um rato de cada grupo (de controlo não tratado, LQ e CTX) foram coradas com H E para visualizar a toxicidade após o tratamento. A estrutura histológica dos órgãos foram observados e comparados microscopicamente. A Figura 2 mostra alterações morfológicas no tecido renal após a administração CTX. Após o tratamento CTX, as células dos túbulos proximais foram feridas, incluindo edema, degeneração e necrose e descamação de células epiteliais tubulares (Fig. 2B). No entanto, as alterações no tecido renal não foram observados nos ratinhos tratados LQ (Fig. 2C). Esses resultados indicaram que a toxicidade renal foi causado por CTX, mas não LQ.

(A) córtex renal de rato não tratada. (B) O córtex renal de ratos tratados com CTX demonstrou toxicidade renal. A toxicidade foi principalmente nas células tubulares proximais, incluindo a degeneração, obstrução, necrose e edema. (C) O córtex renal de camundongos tratados com LQ teve nenhuma toxicidade.

O objectivo desta experiência foi comparar LQ à quimioterapia convencional em doses terapêuticas eficazes publicados (ED) [35]. Uma dose baixa de doxorrubicina também foi testada que não têm toxicidade aparente, mas tinha menos eficácia em comparação com LQ (dados não mostrados).

Comparação da LQ e DOX no cancro do pulmão humano por via subcutânea modelo de ratinho H460-GFP

De última seção dos dados; utilizou-se 600 mg /kg de LQ (gavagem diariamente) na linha celular de cancro do pulmão humano H460. Testamos as células H460-GFP que crescem subcutaneamente em comparação com a linha celular parental H460 em ratinhos nus tratados com LQ. Utilizou-se DOX (7,5 mg /kg i.v., duas vezes por semana durante três vezes), como controlo positivo para comparar com LQ. No grupo de controlo, os ratinhos receberam PBS para administração oral. imagiologia de tumores (Figura 3D, E F) e medição de compasso de calibre (Fig. 3A) mostraram que o crescimento tumoral foi inibido após LQ e tratamento DOX (o valor de P = 0,029, P-valor = 0,005, respectivamente), em comparação com os ratinhos de controlo . peso final do tumor foi também inibida de forma significativa após o tratamento LQ e DOX tratamento em comparação com o controlo de PBS (

P

= 0,037,

P

= 0,01, respectivamente.) (Fig. 3B). No entanto, DOX resultou numa perda significativa de peso corporal em comparação com os animais tratados com (LQ

P

= 0,002) e para os controlos não tratados (p = 0,001) (Fig. 3C). Em contraste, nenhuma perda de peso corporal significativa foi encontrada no grupo LQ comparação com o controlo (Fig. 3C). Os dados também sugeriram que a linha celular parental H460 H460-GFP e não mostrou nenhuma diferença no crescimento em ratos e a resposta LQ.

Cinco ratinhos foram usados ​​em cada grupo. Após os tumores subcutâneos cresceu a 100 mm

2, os ratinhos nus foram dadas quer DOX (7,5 mg /kg i.v.) (duas vezes por semana durante 3 vezes). PBS (PO), LQ (600 mg /kg, po por dia). O tamanho do tumor e peso corporal foram medidos diariamente. O peso do tumor foi medido no ponto de extremidade. A significância estatística entre os grupos foi determinada com o Student

t

-teste. Após o tratamento LQ, o crescimento do tumor de pulmão e o peso do tumor foi significativamente inibido (

P

0,01), em comparação com o grupo de controlo não tratado. tratamento DOX também resultaram numa inibição do crescimento do tumor e o peso significativo em comparação com os controlos não tratados (

P 0,01)

. Os ratos tratados com DOX apresentaram perda de peso corporal significativo em comparação com os controles LQ-tratados e não tratados (

P

0,01). *

p

0,05; **

p

0,01. Imagens de tumores H460-GFP em camundongos vivos a partir do modelo subcutânea nude-rato são mostrados para os diferentes grupos de tratamento e controle sem tratamento (D); LQ (E); e DOX (F).

Comparação de eficácia LQ e DOX na H460-GFP cancro do pulmão humano modelo ortotópico

Para determinar a eficácia anti-metastático da LQ, uma ortotópico nu modelo -mouse de câncer de pulmão humano, H460-GFP foi utilizado [12]. A abertura de imagens de tumores em pulmão de ratinhos tratados e não tratados são mostrados na Fig. 4C-E. O tamanho do tumor foi inibido por LQ e DOX (todos p 0,01) (Fig. 4A). O peso do tumor foi significativamente diminuída nos ratos tratados com LQ (600 mg /kg de administração forçada dia) comparado com o grupo de controlo de PBS (

P

= 0,0041) (Fig. 4A). DOX (7,5 mg /kg i.v., duas vezes por semana durante três vezes) o peso do tumor também inibida (

P 0,0001

) (Fig. 4A). DOX resultou na perda de peso corporal significativo em comparação com o controlo não tratado (

P

0,001) (Fig. 4B). Em contraste, nenhuma perda de peso corporal significativa foi observada nos animais tratados com LQ em comparação com o controlo não tratado (Fig. 4B). Não houve metástases, observada no grupo de controlo.

dez ratinhos foram usados ​​em cada grupo. fragmentos H460-GFP a partir de tumores crescidos subcutaneamente (1 mm de diâmetro) foram colhidos e implantado por implantação ortotópica cirúrgico (SOI) para os pulmões esquerdo de ratinhos nus. Os ratinhos nus receberam PBS (PO); DOX (7,5 mg /kg i.v. duas vezes por semana durante 3 vezes desde o dia 7) ou LQ (600 mg PO /kg /dia diariamente. Desde o dia 7). Os pesos corporais foram medidos diariamente. Os pesos dos tumores foram medidos no ponto final. A significância estatística entre os grupos foi determinada com o Student

t-t

est. o crescimento de tumor de pulmão foi significativamente inibida por LQ (

P 0,01

), sem perda de peso corporal. DOX inibiu o crescimento do tumor do pulmão (

P 0,001

) mas induziu perda de peso corporal significativo em comparação com ratinhos de controlo (

P 0,001

). Abrir imagens de tumores H460-GFP no modelo de ratinho nu ortotópico são mostrados para os diferentes grupos de tratamento e de controlo não tratado (C); LQ (D); e DOX (E).

Os resultados acima LQ indicado pode inibir significativamente o crescimento do tumor de pulmão ortotópico sem toxicidade ao contrário DOX que causou a perda de peso significativa.

Eficácia do LQ no pulmão experimental metástase do cancro em ratinhos nus e em camundongos C57BL imuno-competente /6 ratos

Foi testada a eficácia anti-metastático de LQ em modelos experimentais de rato. células que expressam RFP de Lewis de carcinoma de pulmão (LLC-RFP) As células foram injectados i.v. em ambos nu e C57BL ratinhos imunocompetentes /6, a fim de obter a metástase experimental. As imagens isoladas de pulmões excisados ​​dos ratinhos foram obtidos. Os pulmões do grupo de controlo não tratado foram aumentados, e a cor vermelho escuro foi devido ao tamanho do tumor. Os animais tratados tinham pulmões LQ rosadas com tamanho significativamente reduzido em comparação com controlos não tratados. A intensidade de fluorescência vermelha e a área devido à presença do tumor LLC-RFP foi reduzido nos ratos tratados com LQ em comparação com os ratinhos de controlo não tratados (

P

0,01) (Fig. 5A-B). LQ similarmente inibida colonização do tumor no pulmão em ambos nus e C57BL /6 murganhos (FIG. 5A-B). Reduzido o peso total do pulmão no grupo LQ, em comparação com o controlo não tratado, também indicou a colonização do tumor reduzida em ambos os LQ-nu tratados e murganhos C57BL /6 (

P

= 0,001 e

P =

0,01, respectivamente) (Fig. 5C-D). Calculou-se a área total de fluorescência vermelha do pulmão. A área fluorescente correlacionada com o peso do pulmão. A área total do tumor RFP em ratinhos tratados LQ foi de 4% e 20%, em comparação com a sua nudez ou C57BL /controle de 6, respectivamente (todo o

p

valor 0,001) (Fig. 5E). Os resultados indicaram que LQ pode inibir significativamente a colonização do tumor no pulmão, indicando assim a eficácia anti-metastática.

Seis ratos foram usados ​​em cada grupo. As imagens isoladas de pulmões excisados ​​dos ratos no modelo de metástases experimental, foram obtidos. células cancerosas LLC-RFP (2 × 10

6) foram injectados na veia da cauda de ratinhos nus ou ratinhos C57BL /6. A partir do dia 2, os ratos receberam PBS (PO) a cada dia que o controlo não tratado. Os ratinhos foram tratados com LQ (600 mg /kg /dia po) durante 10 dias. Os ratos tratados com LQ tinha reduzido significativamente o peso do pulmão (

p

0,001) e reduziu a área fluorescência vermelha no pulmão (

p

0,001) em comparação com os controlos de PBS não tratados. A e B são as imagens dos pulmões. C-D são pesos pulmonares. E é a área total de fluorescência vermelha.

LQ sobrevivência prolongada de animais portadores de tumor

LQ sobrevivência significativamente prolongada de ratos com câncer de pulmão H460 ortotopicamente-implantados, bem como em ratos com LLC metástase pulmonar experimental. Median-sobrevivência aumentou de 26 dias nos animais de controlo não tratados para 30,3 dias em ratinhos tratados com LQ (

P

= 0,005), para 33,4 dias em ratinhos tratados com DOX no modelo ortotópico de cancro do pulmão (

p

= 0,0001) (Fig. 6A, C). No modelo de metástases experimental, a sobrevivência mediana foi aumentado de 14 dias nos animais de controlo não tratados a 20 dias nos murganhos tratados com LQ (p = 0,001) e 22 dias nos ratinhos tratados com DOX (

P

0,001) (Fig. 6B, C). LQ sobrevivência prolongada dos animais portadores de tumor comparável à DOX.

dez ratinhos foram usados ​​em cada grupo. LQ aumentou significativamente a sobrevivência em ambos os (

p

= 0,015) e metástase experimental (

p

= 0,001) modelos ortotópicos. DOX também aumentou significativamente (

p

0,001). Sobrevivência em ambos os modelos

A destruição de vasos sanguíneos do tumor por LQ

No modelo de rato ND-GFP, apenas novos vasos sanguíneos induzidos pelo tumor expressa GFP-driven nestin. Observação com o sistema de imagem FV-1000 mostrou que os vasos sanguíneos no tumor eram muito densa e entrelaçados para formar uma rede de vasos sanguíneos (Fig. 7A). Após o tratamento LQ, os vasos sanguíneos em tumores GFP LLC-RFP na orelha e pata foram severamente danificados (Fig. B). Os vasos sanguíneos GFP fragmentado em diferentes áreas do tumor, e observou-se necrose de tumor. Área total fluorescente, intensidade óptica integrada e comprimento ea densidade de vasos sanguíneos GFP foram quantificados. Os resultados mostraram que os vasos sanguíneos do tumor foi reduzido para ~ 50% do controlo (

P 0,05

) após a administração LQ (Fig 7C).

células LLC-RFP foram cultivadas em nestin-. GFP conduzido (ND-GFP) ratinhos nus transgénico em que o navio de sangue nascente expressa GFP. Três ratos foram usados ​​em cada grupo. Nos ratinhos tratados com LQ, vasos sanguíneos do tumor apareceu para ser destruída. A fluorescência da GFP dos vasos sanguíneos foi quantificado para a área, densidade, densidade óptica integrada (IOD), comprimento e contagens. As medições indicaram que LQ diminuiu vasos sanguíneos em 50%.

LQ cancro morte celular induzida

in vitro

H460 células dual-cores, expressando GFP na núcleo e RFP no citoplasma foram cultivadas em 35 milímetros peri-prato tratado com LQ ou CDDP. A proliferação celular foi representada por imagem a cada 4 horas durante 72 horas. A proliferação celular foi totalmente inibida por LQ. Após o tratamento, não havia nenhuma mitose. H460 células de duas cores tratados com LQ diminuiu em tamanho. O citoplasma encolheu em um ponto de tempo precoce e desapareceram, mas os núcleos manteve-se (Fig. 8A, B, D). No final dos estágios, os núcleos fragmentados. Nas células de duas cores H460 tratadas com CDDP, as células apoptóticas e algumas células em proliferação foram observadas (Fig. 8C). Aproximadamente 60% das células estavam apoptóticas no ponto de tempo de 36 horas. núcleos fragmentados foram observados, mas tinha uma aparência diferente do que em células tratadas com LQ. LQ pode desencadear um mecanismo de morte celular diferente do que a apoptose induzida pela CDDP. Outras investigações serão conduzidas no futuro.

Células de controlo não tratados

A e B) às 0 horas e 36 horas. células C) CDDP-tratada a 36 horas.