Abstract

Fundo

butirato de sódio, um inibidor da histona deacetilase , emergiu como um fármaco anticancerígeno promissor para vários cancros. Estudos recentes indicaram que o butirato de sódio podem inibir a progressão do cancro da próstata; No entanto, o mecanismo exacto ainda não é claro. O objetivo deste estudo foi investigar o mecanismo de ação butirato de sódio em células DU145 câncer de próstata.

Métodos

Os efeitos inibidores de NaB sobre o crescimento celular foram detectados pelo 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-diphenyltetrrazolium ensaio brometo. apoptose celular foi determinada por análise de citometria de fluxo de células DU145 e coradas com anexina V e PI. Hoechst 33258 e microscópios de fluorescência foram utilizados para observar a morfologia nuclear de células DU145 após o tratamento com NaB. células knockdown ANXA1 foram estabelecidas através de transfecção com ANXA1 siRNA. Os níveis de ARNm ANXA1 foram medidos por qRT-PCR. Bcl-2, Bax, ANXA1, ERK1 /2 e pErk1 /2 foram detectadas por Western Blot.

Resultados

NaB inibiu significativamente o crescimento e a indução de apoptose de células DU145 e PC3 em uma dose forma dependente. A expressão do gene anti-apoptose Bcl-XL e Bcl-2 em células DU145 são diminuídos e a expressão do gene de pró-apoptose Bax e Bak aumentou após o tratamento NaB. Outros estudos têm demonstrado que NaB-regulado a expressão de ANXA1 e que a acção de inibição do tumor de NaB foi marcadamente reduzido através knockdown do gene ANXA1 em células DU145. Além disso, as células siANXA1 mostrou que a proliferação celular aumentada e apoptose celular foi induzida pela inativação da quinase regulada extracelular (ERK).

Conclusão

Os resultados suportam uma correlação significativa entre as funções NAB e ANXA1 expressão no câncer de próstata, e pavimentar o caminho para estudar ainda mais o mecanismo molecular de ações NAB em cancros

Citation:. Mu D, Gao Z, Guo H, Zhou G, Sun B (2013) Crescimento butirato de sódio induz inibição e apoptose na próstata humana Cancer DU145 células, Up-regulação da expressão da anexina A1. PLoS ONE 8 (9): e74922. doi: 10.1371 /journal.pone.0074922

editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de abril de 2013; Aceito: 06 de agosto de 2013; Publicação: 23 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Mu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é um cancro maligno relativamente comum ea segundo câncer mais comumente diagnosticado em homens [1]. Recentemente, várias terapias eficazes podem ser oferecidos para o tratamento clínico de câncer de próstata; como a cirurgia (prostatectomia radical) e radioterapia (radioterapia externa, braquiterapia, ou ambos) para pacientes com doença em estágio precoce e tratamentos sistémicos adjuvante (quimioterapia), que são eficazes para a doença em estágio avançado [2]; No entanto, as terapias têm diferentes perfis de efeitos colaterais. butirato de sódio, um dos inibidores da desacetilase de histona mais amplamente estudados, emergiu como um fármaco anti-cancro promissor ao alterar a expressão do gene através da modificação da cromatina [3].

butirato de sódio, o sal de sódio do ácido butírico, foi reportado ter uma ampla variedade de efeitos sobre as células de mamífero de cultura, tais como a indução de diferenciação e inibição da proliferação celular, a concentrações relativamente baixas [4], [5]. Além disso, há um conjunto de evidências que mostra que o butirato de sódio pode induzir apoptose em células de cancro numerosos [6], [7]. Devido ao seu crescimento e de inibição de actividade indutora de apoptose, o butirato de sódio, sozinho ou em combinação com outros medicamentos anti-cancro, podem ser usadas para tratar uma série de tumores malignos [8], [9]. Recentemente, Degui Wang e seus colegas demonstraram que o butirato de sódio podem inibir a proliferação de linhas celulares de cancro da próstata humano e tem um efeito sinérgico com medicamentos anticancerígenos no tratamento de câncer de próstata, tanto

in vitro

e

in vivo

[10]. A utilidade clínica de butirato de sódio é restringida pelo seu mecanismo de acção, o que ainda não é claro. Um avanço recente importante foi que o butirato de sódio, foi encontrada a sobre-regular a expressão de anexina A1 (ANXA1) em células de adenocarcinoma do cólon humano [11].

anexinas constituem uma família de proteínas de ligação de fosfolípidos e cálcio que são compostos de 12 membros em mamíferos. Anexinas são onipresentes e expressa em uma variedade de organismos [12]. Há algumas evidências de que os membros da família anexina ter papéis importantes no desenvolvimento e progressão tumoral, porque estas proteínas podem afectar a capacidade de invasão e proliferação de células cancerosas e mostrar desregulação em numerosos cancros [13]. ANXA1, o primeiro membro da família de anexinas, é uma proteína intracelular que desempenha um papel importante na apoptose, proliferação e cancro [14], [15]. A grande controvérsia ainda existe sobre a expressão de ANXA1 em diferentes tipos de cânceres. Vários estudos têm demonstrado que a expressão de ANXA1 é sub-regulada no colo do útero, da mama, cabeça e pescoço, cancro da tiróide ou [16], [17], [18], [19], [20]. Por outro lado, há também alguma evidência de que um aumento da expressão ocorreu em ANXA1 outros tipos de cancro, tais como o pâncreas, do esófago, carcinomas gástricos e [21], [22], [23]. Há uma falta de evidência experimental funcional adequada definindo claramente o papel de anexinas no câncer de próstata. Vários estudos recentes têm indicado que a anexina II foi reduzida em cancros da próstata e anexinas A1 e A2 já têm sido associados com a supressão do tumor no cancro da próstata [24]. Lecona e colegas demonstraram que o butirato pode sobre-regular a expressão de ANXA1 em células de adenocarcinoma do cólon humano [11]. Estes estudos sublinham o possível papel de butirato de sódio como um regulador ANXA1 para inibir a progressão do cancro da próstata. O estudo fornece a primeira evidência direta em células de câncer de próstata que butirato de sódio pode up-regular a expressão de ANXA1 levando a célula a apoptose. Nós mostramos que o butirato de sódio inibe o crescimento celular e induz a apoptose de células da próstata em células cancerosas por cima-regulação da expressão de ANXA1 através da via de sinalização de ERK.

Materiais e Métodos

Anticorpos

de ratinho anti-Bcl-2 anticorpo monoclonal, de rato anti-Bax, anticorpo monoclonal, anticorpo monoclonal de ratinho anti-Bcl-xl, de ratinho anti-Bak anticorpo monoclonal, de rato anticorpo monoclonal anti-ANXA1 e anticorpo monoclonal-β actina anti-rato foram obtido a partir de Abcam (Cambridge, MA). Anti-fosfo-ERK (pERK) de anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal anti-ERK e anti-IgG de ratinho de cabra conjugado com HRP foram obtidos da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA).

Cultura celular

O cancro da próstata humano linha celular de células DU145 (HTB-4; ATCC, Rockville, MD) e células PC3 (ATCC, Rockville, MD) foram cultivadas a 37 ° C sob uma atmosfera humidificada de 5% de CO

2 e 95% de ar e foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 1% de penicilina-estreptomicina e 1% de glutamina.

ensaio de viabilidade celular

a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de exclusão de azul de tripano, tal como descrito anteriormente com modificações menores [25]. Resumidamente, as células DU145 e PC3 foram plaqueadas separadamente em placas de 24 poços a 2 x 10

5 células por poço, em meio RPMI 1640 durante 24 h e, em seguida, adicionados a diferentes concentrações de NaB para uma concentração final de 0, 1 , 5, e 10 mmol. Apenas sulfóxido de dimetilo (DMSO) foi adicionado para o grupo de controlo. As células foram cultivadas numa incubadora durante diferentes períodos. As suspensões de células (10 uL) em PBS foram misturados com 40 uL de Azul de Tripano (Sigma, St. Louis, MO). As células foram subsequentemente lavadas três vezes com DMSO antes da contagem sob um microscópio de luz. As células que demonstram a absorção do corante foram classificados como não viável.

MTT Ensaio de Proliferação

DU145 e PC3 a proliferação celular foram medidos utilizando o anteriormente descrito 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2 , brometo de 5-diphenyltetrrazolium (MTT) [26]. Resumidamente, células DU145 e PC3 (aproximadamente 2 × 10

5) foram plaqueadas separadamente em placas de 24 poços durante 48 h. O MTT (20 ul, 5 mg /ml) foram então adicionados à DU145 e PC3 células cancerosas durante 4 h a 37 ° C. DMSO (200 ul) foi adicionado para solubilizar os cristais durante 25 min à temperatura ambiente. O valor de densidade óptica (OD) foi medida a um comprimento de onda de 490 nm por um espectrofotómetro (Multiskan MK3, Thermo, Waltham, MA). Todas as experiências foram realizadas pelo menos três vezes e foram calculados utilizando os resultados médios.

A detecção de células apoptóticas por citometria de fluxo

O rácio apoptótica de células foi medida por anexina V-FITC e PI seguido por coloração análise com citometria de fluxo (Coulter Beckman-, Brea, CA). Resumidamente, 2 × 10

5 células por poço foram plaqueadas em placas de 24 poços e, em seguida, foram adicionadas várias concentrações de NaB. As células foram tripsinizadas e recolhidas por centrifugação e, em seguida, incubadas com Annexin V e PI, durante 15 min à temperatura ambiente. A apoptose foi analisada por citometria de fluxo utilizando o kit de anexina V-FITC /PI (BD PharMingen, San Diego, CA). Depois de 30 minutos a 37 ° C, as células estavam prontas para a análise por citometria de fluxo e a taxa de apoptose celular foi determinada.

Nuclear morfológica de observação de NaB trataram células do cancro DU145

As células foram plaqueadas em placas de 24 poços a 2 x 10

4 células por poço e tratada com NaB a várias concentrações. As células foram fixadas com formalina tamponada 10% /4% de formaldeído, e foram então lavadas duas vezes com PBS e coradas com solução de coloração de Hoechst 33258. A morfologia nuclear de células DU145 foi observada por microscopia de fluorescência reflectiu (Nikon MF30 LED, Japão). A quantificação de células apoptóticas foi realizada por contagem de 500 células DU145, e, em seguida, a determinação da percentagem de células em apoptose em pelo menos cinco secções transversais por lâmina. O experimento foi repetido pelo menos três vezes.

quantitativo em tempo real-PCR (qRT-PCR)

ANXA1

níveis de mRNA foram medidos em linhas celulares de cancro da próstata DU145 utilizando o método de qRT-PCR. O ARN celular total foi isolado a partir de células DU145 usando Trizol Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. 2 ug de RNA total foi sujeito a transcrição reversa usando um de alta capacidade para o ARN-ADNc-Kit (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. QRT-PCR foi realizada em um de uma cor só em tempo real do sistema de detecção de PCR BioRad MyIQ utilizando SYBR Green Supermix (BioRad, Carlsbad, CA). As sequências dos iniciadores utilizados para qRT-PCR eram como se segue:

ANXA1

para a frente, GAGCCCCTATCCTACCT TCA;

ANXA1

reversa, GGTTGCTTCATCCACACCT;

ACTIN

frente, TCCCTGGAGAAGAGCTACGA;

ACTIN

reversa, AGGAAGGAAGGCTGGAAGAG. Estes iniciadores foram todos sintetizados por Sangon Biotech Co., Ltd. (Xangai, China). As condições de amplificação foram como se segue: pré-incubação: 95 ° C, 10 min; PCR: 94 ° C, 10 s e 60 ° C, 30 s, 45 ciclos; alongamento final: 72 ° C, 10 min. Os níveis de expressão dos genes relativos foram calculados usando o

-ΔΔCT Método 2 [27] e com o ARNm β-actina como um controlo interno.

Western Blot Assay

A proteína total de células DU145 foram extraídos utilizando o tampão de lise RIPA (Beyotime, Nantong, China) de acordo com os protocolos de operação. A concentração de proteína nos lisados ​​foi determinada pelo kit de ensaio de proteína BCA (Beyotime, Nantong, China). As proteínas (40 ^ g /pista) foram sujeitas a 10% de SDS-PAGE e transferidas electroforeticamente para Immobilon P Millipore (Bedford, MA, EUA). Monoclonal de ratinho e anticorpos policlonais foram utilizados como o anticorpo primário e de cabra conjugado com HRP de IgG anti-rato foi utilizada como anticorpo secundário. Os anticorpos ligados foram visualizados utilizando o reagente LumiGLo (Pierce, Rockford, IL) foram determinados e os níveis das proteínas em relação a p-actina. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes.

pequeno ARN interferente Transfecção

As células DU145 de cancro da próstata com a proteína ANXA1 foram transfectadas com ARNsi ANXA1 (siANXA10) ou o ARNsi de controlo (siMock) ( Takara, Dalian, China) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o método de Máximo [28], com modificações menores. Resumidamente, um dia antes da transfecção, 2 × 10

5 células de cancro da próstata foram semeadas em placas de 60 mm em meio RPMI 1640 contendo 5% de FCS. No total, 1,5 ug de ADN de plasmídeo foi transfectado em células DU145 para o ARN e a extracção de proteínas. Os transfectantes estáveis ​​de células DU145 foram seleccionadas com meio de cultura contendo puromicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). As colónias viáveis ​​foram colhidos e transferido para novos pratos após 2 a 3 semanas após a transfecção. As sequências alvo siANXA1 foram: 5′-ATGCCTCACAG- CTATCGTGAA-3 (anti-sentido) ‘(sentido) e 5′-TTCACGATAGCTGTGAGGCAT-3’. SiANXA1-transfectadas e células siMock-transfectadas foram utilizadas para outras experiências.

Análise estatística

Todos os dados foram expressos como média ± o erro padrão da média (SEM). As diferenças entre os grupos controle e tratado NaB foram comparadas pelo teste de Dunnett posterior à análise de variância. Um valor de P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes.

NaB inibe a proliferação e sobrevivência celular em células DU145

O efeito citotóxico do NaB sobre o câncer de próstata humana DU145 e PC3 células Resultados

foram examinadas com concentrações variáveis ​​de e NaB vezes por ensaio de exclusão de azul de tripano (Fig. 1 A e C). Os resultados mostraram que a viabilidade de células DU145 e PC3 foram todos reduzidos por NaB de uma maneira dose e dependente do tempo. Nab induziu uma diminuição aparente no número de células hospedeiras viáveis ​​dependentemente da dose com um IC

50 de 7,07 mmol /L a 48 h em células DU145 e IC

50 de 8,71 mmol /L a 48 h em células PC3 . Uma gama de dose de 0-10 mmol NaB tratamento de células DU145 câncer de próstata e PC3 por 48 h são a nossa concentração e do tempo esperado.

(A) NaB inibe a viabilidade celular em um tempo e dose-dependente maneira como DU145 células. As células cancerígenas foram tratados com várias concentrações de NaB (1, 5, 10 mmol) durante diversos períodos (12, 24, 48, 72, 96 e 120 h) ou meio sozinho. (B) Efeito de NaB sobre a proliferação celular DU145. As células cancerígenas foram tratados com várias concentrações de NaB (1, 5, 10 mmol) durante 48 h ou meio sozinho. (C) NaB inibe a viabilidade das células em células PC3. As células cancerígenas foram tratados com várias concentrações de NaB (1, 5, 10 mmol) durante diversos períodos (12, 24, 48, 72, 96 e 120 h) ou meio sozinho. (D) Efeito de NaB sobre a proliferação de células PC3. As células cancerígenas foram tratados com várias concentrações de NaB (1, 5, 10 mmol) durante 48 h ou meio sozinho. (E) Efeito de NaB em combinação com DOC sobre a viabilidade celular de células DU145 e PC3. As células cancerígenas foram tratados com meio sozinho ou NaB (5 mmol) em combinação com DOC (1 mol) durante 48 h. (F) Efeito de NaB em combinação com DOC em DU145 e proliferação de células PC3. As células cancerígenas foram tratados com meio sozinho ou NaB (5 mmol) em combinação com DOC (1 mol) durante 48 h. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de exclusão de azul de tripano. A proliferação celular foi detectada por ensaio MTT. NaB inibiu significativamente o crescimento de células DU145 e PC3. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes. Os dados são médias ± SEM. (N = 3) (teste de Dunnett, * P . 0,05

vs

controle)

Nós também mediram o efeito de NaB em DU145 e proliferação de células PC3 por ensaio MTT.. Como mostrado na Fig. 1B e D, não houve uma diminuição drástica na proliferação de células com doses crescentes de NaB (0-10 mmol). Nab inibiu a proliferação celular dependente da dose, tanto em células DU145 e PC3 (Fig. 1B e D). Estas observações indicam que NaB pode inibir a proliferação e sobrevivência de células DU145 e PC3, no entanto, DU145 é mais sensível para o tratamento NaB.

Tem algumas evidências de que NaB combinada com outros agentes anti-cancro pode ser muito útil na bexiga cancros [10]. Assim, examinou-se o efeito de NaB em combinação com docetaxel (DOC) em células de cancro da próstata. Os resultados mostraram que existe uma inibição sinérgica do crescimento de células de cancro de próstata humana por NaB e DOC (Fig. 1E). Para confirmar ainda mais o efeito sinérgico de inibição do crescimento de NaB, a proliferação celular foi detectada por ensaio MTT. Como mostrado na Fig. 1F, NaB combinado com DOC pode inibir a proliferação celular significativa.

NaB induz a apoptose em linhas celulares DU145

A indução da apoptose por NaB foi analisado em primeiro lugar por meio de análise de citometria de fluxo de células coradas com DU145 anexina V e PI (Fig. 2A). Os resultados mostraram que NaB causou um aumento dependente da dose na apoptose celular, e a taxa de apoptose aumentou para 30% quando a concentração de NaB foi superior a 5 mmol /L.

(A) análise de citometria de fluxo de NaB tratada células DU145 coradas com anexina V e PI. observação morfológica (B) Nuclear de NaB trataram células cancerosas DU145. Hoechst 33258 e um microscópio de fluorescência foram utilizados para observar a morfologia nuclear de células DU145 após o tratamento com NaB (400 ×). (C) análise quantitativa da taxa de apoptose celular. (D) NaB modula a expressão de Bcl-XL e Bak em células DU145. (E) NaB modula a expressão de Bcl-2 e Bax em células DU145. A expressão de Bcl-XL, Bcl-2, Bax e Bak foram determinados por análise de Western blot. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes. Os dados são médias ± SEM. (N = 3) (teste de Dunnett, * P 0,05

vs

controle.)

A seguir, quantificou as alterações na morfologia nuclear de células de coloração Hoechst sob microscopia de fluorescência.. Como mostrado na Fig. 2B, as células cancerosas mostrou fluorescente brilhante blebbing núcleos e fragmentação de ADN, em comparação com as células de controlo DU145 após o tratamento com NaB durante 48 horas. Além disso, o número de células apoptóticas foi aumentada de uma maneira dependente da dose NaB (Fig. 2C). Simultaneamente, a densidade celular foi reduzida de uma forma dose-dependente. Estas alterações estão em conformidade com as características da apoptose

apoptose celular parece ser controlada por numerosos genes.;

Bcl-XL, Bcl-2

,

Bax e Bak Quais são os mais importantes genes relacionados com apoptose entre eles. Bcl-XL e a proteína Bcl-2 são dois inibidores da morte celular, enquanto que o Bax e Bak têm um papel crítico no sentido de facilitar a apoptose. Assim, nós medimos a expressão de Bcl-XL, Bcl-2, Bax e Bak proteínas em células DU145 por western blot após o tratamento com NaB (Fig. 2D e E). Os resultados mostraram que a expressão de Bcl-XL e Bcl-2 foram reduzidos e a expressão de Bak e Bax foram simultaneamente regulada para cima. A taxa de apoptose foi significativamente aumentada por causa do aumento da regulação de genes pró-apoptose.

NaB Up-regula a expressão de ANXA1 na linha celular do cancro da próstata DU145

Os resultados acima indicaram que NaB pode inibir a proliferação e apoptose induzida em células de cancro da próstata; No entanto, o mecanismo de acção NaB ainda não é claro. Lecona e colegas sugeriram que o butirato pode sobre-regular a expressão de anexina A1 em células de adenocarcinoma do cólon humano. Assim, questionou se havia alguma conexão entre NaB e ANXA1. A expressão de ANXA1 e a sobre-regulação de ANXA1 por NaB em células DU145 foram determinados por RT-PCR e western blot, respectivamente (Fig. 3). Como mostrado na Fig. 3, o aumento dos níveis de ARNm ANXA1 e a expressão da proteína foi detectada nas células DU145 tratados com NaB. Os resultados demonstraram que NaB pode sobre-regular a expressão de ANXA1 em células DU145.

(A), a expressão de ARNm é detectado ANXA1 por qRT-PCR. grupos de tratamento NAB significativamente maior do que o grupo controle (tratamento por meio apenas). (B) Análise de Western blot de expressão ANXA1 em células DU145 após o tratamento NaB. Os dados estão normalizados com os valores de p-actina e são expressos como alterações de dobragem de β-actina em NaB grupo tratado relativamente ao controlo. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes. Os dados são médias ± SEM. (N = 3) (teste de Dunnett, * P . 0,05

vs

controle).

Criação e as análises funcionais das células ANXA1 Knockdown

Desde ANXA1 expressão foi regulada nas células DU145 tratados com várias concentrações de NaB, assumiu-se que ANXA1 pode desempenhar um papel significativo na actividade de NaB. Para medir a ANXA1 funções

in vitro,

um experimento de siRNA foi realizada em células DU145. O nível de ARNm e de proteína ANXA1 no grupo siANXA1-transfectadas foram significativamente mais baixos do que o grupo siMock transfectadas (Fig. 4A). A seguir, analisou o efeito da ANXA1 knockdown sobre a actividade de NaB, incluindo a inibição do crescimento das células (MTT), e a indução da apoptose das células (ensaio Western blot). Os resultados mostraram que não houve um aumento no crescimento celular do grupo siANXA1-transfectados em comparação com o grupo siMock-transfectadas (Fig. 4B). Além disso, a taxa de apoptose foi reduzida nas células siANXA1-transfectadas (Fig. 4C). Os resultados indicaram que a actividade de inibição do crescimento NaB e pró-apoptose em células cancerosas DU145 foi associada com a sobre-expressão de ANXA1.

(A) análise de transferência de Western de expressão em células ANXA1 siANXA1 e siMock após NaB tratamento. Os dados foram normalizados com os valores de p-actina e são expressos como alterações de dobragem de β-actina em NaB grupo tratado relativamente ao controlo. (B) A proliferação de células siANXA1 e depois do tratamento NaB siMock. (C) Análise de Western blot da expressão do Bax e Bcl-2 em células siANXA1 e siMock. Bcl-2 e Bax níveis de expressão foram normalizados para a p-actina e são apresentadas como a razão da Bax /Bcl-2. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes. Os dados são médias ± SEM. (N = 3) (teste de Dunnett, * P 0,05

vs

controle.)

Sobre-expressão de ANXA1 está diretamente relacionada com a ativação de ERK

a via ERK é frequentemente sobre-regulada numa variedade de cancros [29], [30], e há alguma evidência mostrou que ANXA1 modula a via ERK num local proximal [31]. Para investigar ainda um mecanismo potencial que pode estar envolvido na inibição do crescimento e pró-apoptose em células cancerosas, foi detectada a expressão de ERK e ERK fosforilada (pERK). pERK foi significativamente diminuída em células transfectadas-siANXA1 comparado com o grupo siMock. Os resultados demonstraram que a via de ERK foi atenuada em células siANXA1-transfectadas (Fig. 5).

A expressão de p-ERK e ERK são detectadas por análise Western Blot. A expressão de p-ERK é reduzida significativamente em células ANXA1 knockdown em comparação com as células siMock, ao passo que o nível de ERK é quase inalterada. Os dados estão normalizados com os valores de p-actina e são expressos como alterações de dobragem de β-actina. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes. Os dados são médias ± SEM. (N = 3) (teste de Dunnett, * P 0,05

vs

controle.)

Discussão

O câncer de próstata é o segundo câncer mais comumente diagnosticado e. a segunda principal causa de mortes por câncer entre os homens. Atualmente, várias radiação e cirúrgica terapias eficazes podem ser oferecidos para o tratamento clínico de câncer de próstata; no entanto, terapias para o câncer de próstata estão longe de câncer de próstata satisfatória e avançado permanece incurável [9]. Existe uma necessidade urgente de encontrar substâncias ou drogas que são adequados para a prevenção e um melhor controlo do cancro da próstata. NaB, um membro do grupo de inibidores de histona-desacetilase (HDAC), é um ácido gordo de cadeia curta que ocorre naturalmente que é capaz de iniciar a diferenciação de muitos tipos de células, tais como HT29, células de cancro do cólon humano e células de cancro gástrico [32], [33]. NaB pode aumentar a actividade anti-tumoral com menos toxicidade, e existem várias linhas de evidência, que têm demonstrado que NaB pode induzir a inibição do crescimento e apoptose em vários cancros, incluindo o cancro da próstata [5], [6], [9]. No entanto, o mecanismo exacto de NaB na tumorigénese é mal compreendida.

é agora bem estabelecido que o NaB pode sobre-regular a expressão de ANXA1. Além disso, anexinas são frequentemente desregulada em vários tipos de câncer e sua expressão indicou um supressor de tumor ou possível papel homeostático [34], [35]. Assim, assumimos que NaB inibiu a proliferação celular e apoptose induzida através da expressão regulada para cima de ANXA1.

No presente estudo, foram avaliados os efeitos de inibição de proliferação e apoptose de promoção de NaB em células DU145 cancerosas humanas da próstata , juntamente com o seu mecanismo de acção. Os nossos estudos mostraram que NaB a 1-10 mmol tanto poderia inibir a proliferação de células DU145 e induzir a apoptose celular. A apoptose, também conhecida como morte celular programada, é um processo fisiológico que é regulada por um certo número de genes bem caracterizados e é importante para o desenvolvimento e homeostasia de muitos organismos. Neste estudo, descobrimos que NaB pode regular negativamente a Bcl-2 expressão e up-regular a expressão Bax. É provável que NaB induz a apoptose de células do cancro da próstata DU145 por inibição da expressão de Bcl-2 e Bax activação.

Simultaneamente, observou-se que NaB-regulado a expressão de ANXA1 em células DU145. Para determinar se a função ANXA1 é relevante para a ação NaB, realizamos estudos funcionais usando siRNA. Os resultados mostraram que a inibição da expressão de ANXA1 diminuiu significativamente a acção NaB de inibição do crescimento celular e pró-apoptose. Além disso, os nossos resultados sugerem que o mecanismo de NaB contra a apoptose através da sobre-regulação de ANXA1 estava relacionado com a via de sinalização de ERK. A inibição da expressão de ANXA1 poderia inibir a fosforilação de ERK1 /2, o que indica que a expressão de ANXA1 pode activar a via de sinal de ERK. Até à data, a expressão de ANXA1 ser regulada para cima por NaB no cancro da próstata ainda não foi confirmada. Em nosso estudo, nós fornecemos alguma evidência de que o NaB up-regula a expressão de ANXA1 e está correlacionada com a progressão do câncer de próstata. Estes factos implicam fortemente que ANXA1 tem um papel importante na progressão do cancro da próstata.

Em conclusão, NaB exibe anti-proliferativa e a actividade pró-apoptótica de um modo dependente da dose em células de cancro da próstata humanos. Além disso, NaB pode aumentar a expressão de ANXA1, e ANXA1 pode aumentar a actividade da via de sinalização de ERK. Mais estudos são necessários para revelar as interações definidas de ANXA1 e a via de sinalização ERK. Os presentes resultados sugerem que NaB é particularmente eficaz na inibição da progressão do cancro da próstata por meio da sobre-regulação da expressão de ANXA1.