Abstract

Fundo

Os marcadores que podem discriminar entre são necessários tumores de próstata indolentes e agressivos. Estudamos a metilação do gene no tecido não neoplásico adjacente ao tumor da próstata (NTAT) em associação com a mortalidade por câncer de próstata.

Métodos

De duas coortes de pacientes com câncer de próstata consecutivos diagnosticados em uma ala patologia em Turim, Itália, foram selecionados 157 pacientes com disponíveis NTAT e seguiu-se por mais de 14 anos. Obtivemos DNA de NTAT em tecidos tumorais da próstata embebidos em parafina e sonda utilizada PCR em tempo real para analisar a metilação da glutationa S-transferase (GSTP1) e os promotores do gene polipose adenomatosa coli (APC).

Resultados

a prevalência da APC e GSTP1 metilação no NTAT foi entre 40 e 45%. Foi associado com a metilação em tecido de tumor da próstata para os mesmos dois genes, bem como com um alto valor de Gleason. A taxa de risco (HR) da mortalidade por câncer de próstata foi de 2,38 (95% de intervalo de confiança: 1,23-4,61) para o APC metilação, e 2,92 (1,49-5,74) para a metilação GSTP1 em NTAT. É alterado para 1,91 (1,03-3,56) e 1,60 (0,80-3,19) após o ajuste para a pontuação de Gleason e metilação no tecido tumoral da próstata. Comparação de 2 vs. 0 genes metilados em NTAT revelou uma HR de 4,30 (2,00-9,22), que diminuiu para 2,40 (1,15-5,01) após o ajuste. Os resultados foram mais fortes nos primeiros 5 anos de follow-up (HR ajustado: 3,29, 95% CI: 1,27-8,52).

Conclusões

As alterações na metilação do gene são um evento precoce na próstata carcinogénese e pode desempenhar um papel na progressão do cancro. Gene metilação em NTAT é um possível marcador prognóstico a ser avaliada em estudos clínicos

Citation:. Richiardi L, Fiano V, Grasso C, Zugna D, Delsedime L, Gillio-Tos A, et al. (2013) A metilação do APC e GSTP1 no tecido não-neoplásica Adjacente à próstata tumor e mortalidade por câncer de próstata. PLoS ONE 8 (7): e68162. doi: 10.1371 /journal.pone.0068162

editor: Jindan Yu, da Universidade Northwestern, Estados Unidos da América

Recebido: 26 de novembro de 2012; Aceito: 29 de maio de 2013; Publicação: 09 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Richiardi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi parcialmente apoiado pela Associação italiana de Investigação do Cancro (AIRC) e da Região do Piemonte. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, na coleta, análise e interpretação dos dados, na redação do manuscrito, e na decisão de enviar o manuscrito para publicação

Conflito de interesses:. Os autores têm declarou que não existem interesses conflitantes.

Introdução

o câncer de próstata é o tumor mais comum em homens em muitas populações, com uma incidência bruta de 120-130 por 10

5 na Europa e Estados Unidos [1]. Mais de 65% dos cancros da próstata são diagnosticados após os 70 anos de idade, ea maioria destes pacientes morrerão de eventos concorrentes. A incidência de cancro da próstata aumentou dramaticamente desde a introdução do antigénio (PSA), específico da próstata no final da década de 1980 [1]. rastreio oportunista com base no PSA para câncer de próstata é generalizada, embora sua capacidade de diminuir a mortalidade ainda está sendo debatido. As conclusões de um recente revisão pelo Grupo de Trabalho dos EUA Preventive Services não justificar o rastreamento com base no PSA como os benefícios não foram julgados para compensar os danos [2].

A alta prevalência de câncer de próstata indolente e o uso rastreio de oportunista com base no PSA para câncer de próstata pode levar a excesso de tratamento. Atualmente não existe nenhum consenso sobre se a prostatectomia radical ou vigilância activa deve ser oferecido como o tratamento de escolha, especialmente quando se trata de pacientes com câncer de próstata de baixo risco [3], [4]. Por conseguinte, é necessário compreender melhor os factores determinantes da progressão do cancro da próstata, e para identificar os indicadores de prognóstico para cancro da próstata agressivo que pode ser detectado no momento de uma primeira biópsia de diagnóstico. Uma série de grupos, incluindo o nosso, têm investigado mudanças epigenéticas em tecido de tumor de próstata em um esforço para identificar possíveis marcadores prognósticos [5] – [8]. Em particular, vários estudos têm avaliado a presença de CpG Island (aglomerados de dinucle�idos de uma citosina e uma guanosina) metilação do promotor de alguns genes específicos em associação com recorrência bioquímica ou a mortalidade por câncer de próstata. No nosso estudo anterior, verificou-se que a APC (adenomatous polyposis coli) metilação no tecido de tumor da próstata foi associado com um aumento de risco de 50% de mortalidade por cancro da próstata. Alguns estudos sustentam esta conclusão [9] – [12], e outros encontraram um papel prognóstico para a metilação em outros genes [13], [14]. A metilação do GSTP1 (glutationa S-transferase) promotor é o mais amplamente investigado mudança epigenética no cancro da próstata. Pode ser encontrado em mais do que 80% dos cancros da próstata, com uma prevalência mais baixa em tecido benigno [15]; é fortemente associado com Gleason marcar, mas o seu papel prognóstico independente da pontuação Gleason está claro [5].

Neste trabalho, investigou se as mudanças de metilação no tecido não-neoplásica adjacentes ao tumor da próstata (NTAT) estão associados com o prognóstico do câncer de próstata. tumores da próstata são frequentemente multifocal, e um número de estudos observaram cancerisation campo (isto é, alterações no tecido normal adjacente ao tumor) no cancro da próstata. Estudos comparando NTAT com o tecido da próstata benigna e /ou tecido de cancro alterações identificadas na expressão do gene [16] – [20], o conteúdo de DNA do telómero [21], o ADN mitocondrial [22], e a prevalência de metilação em alguns genes, incluindo APC [23 ], GSTP1 [24], [25] e RARβ2 [23], [24]. Os mecanismos subjacentes a estas alterações não sejam claramente entendidas (quer efeitos de substâncias cancerígenas, expansão lateral do tumor, ou a influência do tumor no tecido adjacente estendido), mas o campo cancerisation provavelmente tem relevância clínica. No entanto, alguns dos estudos anteriores sobre esta questão incluem follow-up para a mortalidade, dificultando, assim, a avaliação do significado prognóstico de alterações na NTAT. Este estudo centra-se na metilação do GSTP1 e APC no tecido não-neoplásica. Ele tem como objetivo avaliar se estas mudanças moleculares são potenciais candidatos como marcadores prognósticos de avaliar a sua associação com a mortalidade por câncer de próstata.

Pacientes e Métodos

Estudo da População

O estudo é aninhado em duas coortes de um total de 459 pacientes com câncer de próstata consecutivos submetidos a biópsia, prostatectomia radical ou ressecção transuretral da próstata (RTU), entre 1982 e 1988 ou entre 1993 e 1996, na enfermaria patologia do Battista Hospital San Giovanni, Turin , Itália. Os detalhes desses dois grupos têm sido publicados anteriormente [5]. Obtivemos o DNA de tecidos tumorais de próstata embebidos em parafina armazenados para todos os 459 pacientes. O DNA foi então analisado para a APC, de GSTP1 e de RUNX3 (factor de transcrição relacionados com o Runt 3) metilação de genes utilizando a modificação com bissulfito e PCR-metilação específica [5]. Informações sobre idade, fonte de grau tecido do tumor da próstata, tumor residência e estava disponível a partir de relatórios de patologia. Todas as lâminas de diagnóstico originais correspondentes para os animais de estimação utilizados para as análises moleculares foram identificados e re-avaliados por um único uropathologist (LD), a fim de atribuir um Gleason uniforme marcar de acordo com as diretrizes atuais. Nós não temos informação sobre os níveis de PSA ou outras características clínicas. Inicialmente, os dois grupos foram acompanhados até 2007 [5], mas, para o presente estudo, nós estendemos o acompanhamento até o dia 8 de agosto de 2010. Nós usamos informações de atestados de óbito para classificar a causa da morte ou como câncer de próstata, ou outras causas.

lâminas de diagnóstico de pacientes dos dois grupos foram analisados ​​para identificar NTAT. Foram excluídos

a-priori

pacientes da década de 1980, cujo diagnóstico lâminas incluídos tecido neoplásico, principalmente, e foram associadas a problemas técnicos consideráveis ​​no isolamento NTAT sem contaminação a partir de tecido de tumor de próstata. Todas as outras fontes de tecido, nomeadamente Turps (n = 11) e prostatectomia radical (n = 23) a partir da década de 1980, e biópsias (n = 164), Turps (n = 45) e prostatectomia radical (n = 34) a partir de 1990, foram incluídos no presente avaliação. O uropathologist identificadas e destacadas uma área de NTAT em cada slide de diagnóstico. Foram excluídas as áreas de neoplasia intraepitelial prostática. Se mais do que uma área de NTAT estava presente, o patologista escolheu o mais distante a partir do tumor. Se havia mais de uma área que se reuniu este critério, a maior área foi escolhida. As porções seleccionadas do NTAT tinha, pelo menos, 1,5 milímetros de distância a partir de células tumorais, de acordo com estudos anteriores sobre o efeito de campo epigenética no cancro da próstata [23]. Esta distância mínima foi mantida também quando o material do tecido é relativamente pobres (isto é, em biópsias); caso contrário, o paciente foi excluído do estudo. Para lâminas incluindo fragmentos fisicamente separados do tecido (97 pacientes), ambos de NTAT e tecido de tumor, a distância in vivo entre os fragmentos era desconhecido, embora muito provavelmente era maior do que 1,5 mm. Para alguns doentes, algumas das lâminas incluídos apenas NTAT; estas lâminas foram incluídos no estudo.

No final deste processo, NTAT foi identificada em 157 pacientes, os quais foram incluídas no presente estudo. O processo de selecção a partir dos 459 pacientes originais actuado de modo diferente, dependendo da fonte do tecido do tumor e na coorte (1980 ou 1990 coortes). Especificamente, foram selecionados 91% dos pacientes originais que foram submetidos a ressecção transuretral da próstata ou uma prostatectomia radical em qualquer um dos dois grupos, 33% dos que foram submetidos a uma biópsia na coorte de 1990 e, de forma consistente com os nossos critérios a priori, nenhum dos que foram submetidos a uma biópsia na coorte de 1980. Esta seleção, sendo na linha de base (ou seja, antes da ocorrência do resultado), é improvável que tenha introduzido viés nas estimativas de associações ([26]).

Quatro e cinco (10 mm de espessura) secções sequenciais foram cortadas a partir do tecido embebido em parafina dos 157 lâminas de diagnóstico seleccionados. As fatias sobrepostas exatamente com os slides em que o uropathologist destacadas a área NTAT selecionado. Eles foram dissecados manualmente, a remoção da porção de NTAT com uma fina lâmina descartável, que foi alterada entre cada sujeito. DNA foi então extraído com sucesso para todos os sujeitos do estudo

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Battista Hospital San Giovanni -. CTO /CRF /Maria Adelaide Hospital de Turim (Prot N. 0.021.727, 19 de março de 2007. ). dados anónimos sobre a metilação do gene estão disponíveis mediante solicitação para pesquisadores qualificados para fins de pesquisa acadêmica e não-comercial.

As análises moleculares

O QIAamp comercial ® Kit Tissue DNA FFPE (Qiagen, Hilden, Alemanha) foi utilizado para a extracção e purificação de ADN genómico. A adequação do DNA foi verificada usando a amplificação PCR do gene β-globina de limpeza [27].

As amostras de DNA genômico, incluindo os controlos positivos para o estado metilado e não metilado, sofreu modificação com bissulfito utilizando Epitect Bissulfito Kit (Qiagen , Hilden, Alemanha).

Após a modificação com bissulfito, de um ensaio de PCR com sondas específicas para determinar o estado de metilação de APC e promotores de GSTP1 foi usada. Este ensaio permite a detecção de citosina metilada com alta sensibilidade (1 metilado citosina de 10.000 citosinas não metiladas [28]). Cada reacção de PCR continha: tampão 1 × PCR, 5,5 fiM de MgCl2, 200 uM de dNTP, 600 nM de dois iniciadores, 200 nM e 80 nM de sonda específica para a metilação do APC e promotores de GSTP1, respectivamente, 5 U de Taq, 2 uL de ADN modificado com bissulfito de sódio e destilou-H

2O para se obter um volume final de 25 ul. A reacção foi realizada num termociclador (iCycler, BioRad, CA, EUA) com as seguintes condies de PCR: 1,30 minutos a 95 ° C, 15 segundos a 95 ° C, 1 minuto a uma temperatura de hibridação específica do iniciador (60 ° C ) durante 50 ciclos, e 10 minutos a 72 ° C. O ADN metilado universal CpGenome (Intergen Co., Oxford, Reino Unido) foi utilizada como um controlo positivo. Os controlos negativos foram incluídos em todas as reacções.

iniciadores e as sondas foram escolhidos com base em sequências publicadas (Tabela 1) [29], [30]. Sondas alvejado quatro ilhas CpG em cada gene.

As informações sobre a APC, GSTP1 e metilação RUNX3 no tecido tumoral da próstata já estava disponível no nosso estudo anterior [5]. No entanto, em análises do anterior que utilizaram PCR específicos de metilação em vez do sonda-PCR em tempo real. Desde o último método tem uma maior sensibilidade, nós testada novamente todas as amostras de tecido de tumor de próstata no qual APC ou GSTP1 foi não metilado, para tornar os resultados de tecido do tumor de próstata e NTAT mais comparáveis. Metilação em RUNX3 não foi reavaliada porque análises no NTAT envolveu apenas APC e GSTP1 e o potencial efeito de confusão adicional de metilação RUNX3 no tecido tumoral era esperado para ser limitado. Consistentemente, a metilação do tecido tumoral em RUNX3 não foi considerado ainda mais neste trabalho.

Análises Estatísticas

Por meio de regressão logística multivariada, que estimou a probabilidade de prevalência proporções de APC ou metilação GSTP1 em NTAT para selecionada características (escore de Gleason, a metilação no tecido tumoral da próstata).

O efeito da NTAT metilação em cada um dos dois genes sobre a mortalidade cumulativa de câncer de próstata foi investigada tendo em conta os riscos concorrentes, e as diferenças de mortalidade foram avaliados com o teste de Gray [31]. Nós usamos modelos de regressão de riscos proporcionais de Cox para estimar a taxa de risco (HR) da mortalidade por câncer de próstata em associação com a metilação em NTAT. tempo de seguimento foi utilizado como escala de tempo e idade no momento do diagnóstico foi introduzido como uma variável contínua. Ambos os controlos gráficas e testes formais, com base em resíduos de Schoenfeld (p 0,14), indicou que o pressuposto de risco proporcional foi recebida. APC e metilação do GSTP1 no NTAT foram analisadas em modelos separados, bem como num modelo de investigar o número de genes metilados, de 0 a 2. Todos os modelos foram realizadas tanto não ajustar, e ajustar para classificação de Gleason e presença de GSTP1 ou APC . metilação no tecido tumoral da próstata

Desde marcadores prognósticos são necessários principalmente para tumores de baixo e de risco intermediário, e no momento do diagnóstico antes de decidir sobre a prostatectomia, realizamos duas análises de subgrupo restrito a: i) sujeitos do estudo com uma pontuação de Gleason de 7 ou menos, ou ii) sujeitos que foram submetidos a biópsia. Nós também avaliou a associação de metilação em NTAT com a mortalidade a curto prazo através da realização de análises separados, com os primeiros 5 anos de follow-up.

Resultados

Características seleccionadas dos 157 participantes do estudo são apresentados na Tabela 2. a maioria dos indivíduos foram diagnosticados na década de 1990, com uma sobrevida média de 6,79 anos. Dos 128 pacientes que morreram durante o acompanhamento, 43 homens morreram de câncer de próstata. A fonte de tecido foi igualmente distribuído entre biópsia, ressecção transuretral da próstata e prostatectomia radical. Houve uma alta prevalência de ambos metilação APC (82,2%) e metilação GSTP1 (84,1%) no tecido do tumor de próstata.

A metilação prevalência em NTAT foi de 43,9% para APC e 42% para GSTP1. Tal como resumido na Tabela 3, o padrão de metilação em NTAT correlacionada com que no tecido de tumor da próstata: metilação em qualquer um dos dois genes em tecido de tumor da próstata foi associado a metilação do mesmo gene em NTAT. Gleason também foi um determinante importante de ambos APC e GSTP1 metilação em NTAT.

Conforme mostrado na Figura 1 NTAT metilação tanto na APC (Fig. 1a) e GSTP1 (Fig. 1b) foram associados com um risco aumentado de mortalidade a longo prazo do cancro da próstata. taxas de risco para a presença de metilação foram aumentadas em cerca de três dobras (Tabela 4). Estes foram atenuados após ajuste para a metilação no tecido tumoral da próstata, e após o ajuste para a pontuação de Gleason (HR = 1,91 IC 95%: 1,03-3,56 para APC e HR = 1,60, 95% CI: 0,80-3,19 para GSTP1). A análise por número de genes metilados em NTAT revelou uma associação positiva com a mortalidade por câncer de próstata (valor-p de tendência = 0,001): o HR bruta de mortalidade por cancro da próstata para 2 vs 0 genes metilados foi CI 4,30 (95%: 2,00 -9,22), que diminuiu para 2,40 CI (95%: 1,15-5,01) após o ajuste tanto para a metilação do gene em tecido de tumor da próstata e classificação de Gleason (Tabela 5). associações semelhantes em que foram encontrados quando as análises foram restritas para estudar indivíduos com pontuação de Gleason de 7 ou menos. Nós não encontrou evidência de modificação de efeito introduzidas por fonte de tecido tumoral (valor p = 0,37). Resultados restritos a indivíduos submetidos a biópsia são relatados na Tabela 5. Tabela 5 também mostra os resultados para as análises restritas para os primeiros 5 anos de seguimento. A comparação de 2 vs 0 genes metilados deu uma HR bruto de 5,71 (IC 95%: 2,23-14,6) e 3,29 (95% CI: 1,27-8,52) após ajuste para a metilação do gene no tecido tumoral da próstata e da escala de Gleason

Discussão

Nós encontramos uma forte associação entre a presença de APC e GSTP1 metilação em NTAT e mortalidade a longo prazo e mortalidade em 5 anos de câncer de próstata. A associação permaneceu após o ajuste para a escala de Gleason e em análises restritas a estudar indivíduos com uma pontuação de Gleason de sete ou menos e em pacientes submetidos a biópsia.

Estes resultados suportam a hipótese de que a hipermetilação DNA é um evento precoce na carcinogênese que pode ser detectada antes de o tumor torna-se morfologicamente evidente; eles também suportam a noção de cancerisation campo no câncer de próstata e seu papel na progressão do câncer de próstata. O facto de o padrão de metilação é semelhante em NTAT e em tecido de tumor da próstata sugere que as alterações encontradas nestes tecidos são a consequência de mecanismos semelhantes, incluindo uma expansão lateral ou influência do tumor ou efeitos difusos dos mesmos agentes cancerígenos.

Foram estudados metilação em GSTP1 e APC por causa de seu envolvimento em vias de controle de células cruciais cruciais. GSTP1 é um gene “zelador”, impedindo danos genómicos mediado por agentes cancerígenos ou oxidantes. Defeitos em genes “zelador” (isto é, hipermetilação) pode favorecer a susceptibilidade ao desenvolvimento de câncer. Além disso GSTP1 pode interferir com o crescimento ou sobrevivência vias de sinalização, agindo como um gene supressor de tumores [32]. Analogamente APC é um gene supressor de tumor, bem caracterizado, inicialmente identificado em cancro colorrectal, que desempenha um papel integral na via de sinalização Wnt e na adesão intercelular. Interage com o beta-catenina, uma proteína envolvida na adesão celular e a motilidade. Regulamento de beta-catenin impede genes que estimulam a divisão celular e crescimento excessivo de células [33].

Em nosso estudo, utilizamos a mortalidade por câncer de próstata como o resultado (em oposição a recorrência bioquímica) e tivemos um tempo muito longo tempo de seguimento. Foram incluídos ambos os sujeitos do estudo com um baixo risco de câncer de próstata, e aqueles com câncer de próstata mais agressivo. A fonte de tecido de tumor da próstata, incluído biópsias Turps e prostatectomias radicais.

A prevalência de metilação em NTAT que encontramos é semelhante ou superior ao detectado em estudos anteriores, os quais, no entanto, apresentar considerável variação inter-estudo [23] – [25], [34], [35]. Todas estas estimativas não são directamente comparáveis, já que os estudos utilizaram diferentes protocolos para a amostragem de tecido e técnicas moleculares diferentes. Nossos métodos moleculares teve como objetivo maximizar a sensibilidade e nós seguimos um protocolo simples para obter fatias de NTAT com risco reduzido de contaminação a partir de tecido de tumor de próstata. Embora não possamos excluir

a-priori

que a contaminação ocorreu em algumas amostras, a sua frequência foi, no máximo, limitado, o que é demonstrado pelo fato de que a associação entre a metilação em NTAT e mortalidade por câncer de próstata manteve-se praticamente inalterada após ajuste para metilação em tecido de tumor da próstata. Teve a presença de metilação em NTAT sido devido à contaminação de metilação no tecido tumoral da próstata, a associação entre a metilação em NTAT e mortalidade por câncer de próstata teria sido fortemente reduzido após o ajuste.

A principal limitação do nosso estudo é a falta de informação clínica e patológica que não seja a pontuação de Gleason. Além disso, estudamos uma população com, em, a mortalidade média mais elevada de câncer de próstata do que é habitual série de pacientes contemporânea. Essas limitações dificultam a possibilidade de avaliar o valor prognóstico adicional real de metilação em NTAT comparação com nomograms utilizados atualmente. Nosso estudo é, portanto, capaz de sugerir um possível papel do methytlation em NTAT na progressão do cancro da próstata, embora a possibilidade de tradução clínica desse achado requer uma investigação mais aprofundada em um ambiente clínico melhor definido. Nós também não tinha informações sobre o tratamento no momento da inscrição, o que implica que nossa coorte inclui um grupo heterogêneo de pacientes, o que dificulta ainda mais a tradução clínica direta de nossas descobertas. No entanto, o facto de a fonte de tecido de tumor (biópsia, prostatectomia radical, a RTU) não foi um efeito modificador sugere que as nossas descobertas sobre a metilação em NTAT não são explicados por heterogeneidades confundindo a partir dos pacientes e /ou o tratamento inicial.

a magnitude da associação entre a metilação em NTAT e mortalidade por câncer de próstata que encontramos é mais forte do que normalmente encontrado para metilação no tecido tumoral da próstata [5], [8] – [14]. Embora os dois genes que foram estudados seleccionado

a priori com base na evidência substancial do seu potencial papel na carcinogénese da próstata, é provável que a informação de prognóstico adicional poderia ser obtida pelo estudo de um maior número de genes .

em conclusão, os nossos resultados de APC frequente e GSTP1 metilação em NTAT e sua associação com a mortalidade por câncer de próstata apoiar a noção de que as mudanças na metilação do gene são um evento precoce na carcinogênese de próstata e desempenham um papel na progressão do câncer . A força da associação com a mortalidade a partir do cancro da próstata e o facto de que a associação permanece em pacientes com uma pontuação de Gleason abaixo de 8 sugerem que o padrão de metilação em NTAT poderia ser um possível marcador prognóstico para cancro da próstata a ser testado em estudos clínicos futuros.