Abstract

fibroblastos do estroma células modular as células cancerosas através de fatores secretados e aderência, mas esses fatores não são totalmente compreendidos. Aqui, nós identificamos fatores estromais críticos que modulam o crescimento do câncer positiva e negativamente. Usando um sistema de co-cultura de células, observou-se que as células do estroma gástrico segregado IL-6 como um factor de sobrevivência e de crescimento para células de cancro gástrico. Além disso, as células de cancro gástrico segregado PGE2 e TNFa que estimulou a secreção de IL-6 pelas células do estroma. Além disso, verificou-se que as células estromais secretada desidrogenase gliceraldeído 3-fosfato (GAPDH). GAPDH extracelular, ou o seu domínio N-terminal, inibiu o crescimento de células de cancro gástrico, o que foi confirmado em outros sistemas celulares. GAPDH ligada a E-caderina e regulados negativamente a via mTOR-p70S6 cinase. Estes resultados demonstram que as células do estroma poderia regular o crescimento de células de cancro através do equilíbrio destes factores segregados. Propomos que a regulação negativa de crescimento do câncer utilizando GAPDH poderia ser uma nova estratégia anti-câncer

Citation:. Kawada M, Inoue H, Ohba S-i, Yoshida J, Masuda T, Yamasaki M, et al. (2015) células estromais positiva e negativamente modular o crescimento de células cancerígenas: A estimulação através da PGE2-TNFa-IL-6 Inibição Caminho e segregada através de Interacção GAPDH-E-caderina. PLoS ONE 10 (3): e0119415. doi: 10.1371 /journal.pone.0119415

Editor do Academic: Hiroshi Shiku, Mie University Graduate School of Medicine, JAPÃO

Recebido: 02 de outubro de 2014; Aceito: 13 de janeiro de 2015; Publicação: 18 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Kawada et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por MEXT KAKENHI Grant número 23112522. o financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação de o manuscrito

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os tecidos tumorais são compostas de células cancerosas e estroma circundante. O estroma contém vários tipos de células embebidas numa matriz, tais como macrófagos, células endoteliais, células do sistema imune e células do estroma de tipo fibroblasto [1, 2]. As células do estroma apresentam plasticidade fenotípica mudando entre as características fibroblásticas e miofibroblásticas [3, 4]. Os miofibroblastos que expressam vimentina e do músculo liso α-actina (SM-α-actina) [1] tem uma alta capacidade para secretar factores de crescimento, proteínas de ECM, e proteinases [1, 5] e são denominados estroma reactivo ou fibroblastos associados ao cancro (FAC ) [5, 6]. Uma vez que o conteúdo de miofibroblastos de tecidos de tumor se correlaciona bem com o mau prognóstico de alguns cancros [7], células estromais, especialmente miofibroblastos, está significativamente envolvida no desenvolvimento do cancro. Relatórios recentes esclareceram o papel das células do estroma na manutenção de células-tronco cancerosas [8], nichos metastáticos [9, 10], e chemoresistance [11, 12]. Devido a tais evidências crescentes, as células do estroma estão se tornando um alvo atraente para as estratégias anti-câncer.

As células estromais regular o crescimento das células cancerosas positiva e negativamente por fatores secretados e adesão [1, 5, 6, 13- 17]. Vários factores de crescimento tais como o factor de crescimento de hepatócitos (HGF) [18], o factor-I de crescimento semelhante à insulina (IGF-I) [19], e de crescimento de fibroblastos factor de 7 (FGF-7) [20] são segregadas a partir de células do estroma . Por outro lado, as células cancerosas também segregam diversos factores para modificar ou “educar” células estromais para melhorar o seu microambiente. Factor de crescimento transformante-β1 (TGF-β1) é um de tais factores e estimula fibroblastos de se diferenciar em miofibroblastos [1, 3]. Teses fatores e as interações entre células cancerosas e células estromais diferem em cada câncer e, portanto, não são completamente compreendidos [21].

Temos vindo a estudar interações entre células tumorais-estromal usando sistemas de co-cultura das duas células [22] . Enquanto as células do estroma da próstata aumentar o crescimento de células de câncer de próstata, quando co-injetadas em ratos nus [19], os nossos

in vitro

co-cultura método imita os

In vivo

resultados [22]. Utilizando este modelo, verificou-se que o IGF-I é segregada a partir de células estromais da próstata e desempenha um papel crítico no desenvolvimento do cancro da próstata [19]. Além disso, utilizou-se o

In vitro

sistema de co-cultura como um ensaio de rastreio para identificar compostos que exercem actividade anti-cancro por meio da modulação de interacções de células de tumor-estromal. Como resultado, nós descobrimos muitos compostos a partir de fontes naturais, como caldos de cultura de bactérias e fungos [23-26]. Entre eles, phthoxazolin A e A são leucinostatin encontrado para inibir a secreção de IGF-I a partir de células estromais da próstata e suprimir o crescimento de células de cancro da próstata na presença de células estromais [23, 24]. Por outro lado, NBRI16716A inibe o crescimento de células de cancro da próstata num modelo de xenoenxerto de [26], mas que não afecta a secreção de IGF-I a partir de células estromais da próstata. Nossos experimentos preliminares sugerem que NBRI16716A pode estimular as células do estroma a secretar fatores supressores tumorais não identificados. Assim, estes resultados indicam fortemente que podemos controlar o desenvolvimento de cancro através da modulação de interacções de células de tumor-estromal.

Neste estudo, analisámos as interacções cancro gástrico utilizando como modelo. Identificámos factores críticos que modulam o crescimento de células cancerosas de forma positiva e negativamente. Estas descobertas sugerem novas estratégias anti-câncer.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e reagentes

cancerosas humanas da próstata células DU-145, DLD-1 células cancerígenas do cólon humano, linhas celulares de cancro pancreático humano MiaPaCa2, BxPC-3, Capan-1 Panc-1 e foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC). PC-3 de células humanas de cancro da próstata e células 293 de rim embrionário humano foram obtidos a partir do DS Pharma. A linhagem celular LNCaP-CR [27] foi estabelecido no nosso laboratório a partir de células LNCaP de cancro da próstata humana (DS Pharma). Outras linhas celulares de cancro foram descritos noutro local [28, 29]. Todas as linhas celulares de cancro foram mantidas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) (Nissui) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Sigma), 100 unidades /ml de penicilina G (Invitrogen), e 100 ug /mL de estreptomicina (Invitrogen) a 37 ° C com 5% de CO

2. células Hs738 humanos gástricas do estroma (CRL-7869), CCD-18Co fibroblastos de cólon humano (CRL-1459), e Hs371 fibroblastos da glândula mamária (CRL-7256) foram obtidas a partir da ATCC. NHLF fibroblastos pulmonares humanos normais e células estromais da próstata humano foram obtidos a partir CARP BioWhittaker. células estromais pancreáticos humanos PS foram obtidos a partir do DS Pharma. Todas as células estromais foram mantidas em DMEM suplementado com 10% FBS, 100 unidades /ml de penicilina G, 100 ug /ml de estreptomicina, ITH (5 ug /ml de insulina, 5 ug /ml de transferrina, e 1,4 ^ M de hidrocortisona), e 5 ng /FGF básico mL (PeproTech) a 37 ° C com 5% de CO

2 tal como descrito [22].

anti-Pan-citoqueratina (sc-8018), anti-STAT3 (sc-8019), anti-GAPDH (SC-47724), anti-PAI-1 (SC-8979), anti-p70S6 cinase (SC-230), anti-14-3-3 epsilon (sc-1020), e anti-fosfo-MAPK anticorpos (sc-7383) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology. Anti-vimentina (V2258), anti-SM-α-actina (A2547), anti-α-tubulina (T9026), anti-fosfo- (tyr705) -STAT3 (SAB4300033), anti-RPL-18A (HPA055259), e M2 anti-FLAG (F3165) anticorpos, GAPDH músculo de coelho (G2267) e GAPDH humana de eritrócitos (G6019) foram adquiridos da Sigma. Anti-fosfo-Ser /Thr quinase substrato (9614 e 9624), anti-proteína ribossomal S6 (RPS6) (2217), anti-fosfo- (Ser235 /236) -RPS6 (2211), anti-fosfo- (Ser240 /244 ) -RPS6 (2215), anti-fosfo- (Ser473) -Akt (9271), anti-fosfo- (Thr389) -p70 S6 quinase (9234), anti-fosfo- (família Tyr416) ​​-Src (2102), anti -phospho- (Thr172) -AMPKα (2535), anti-myc (2278), anti-caveolin-1 (3267), e anti-β-catenina (9562) Os anticorpos foram adquiridos da Cell Signaling Technology. O anticorpo anti-fosfo-14-3-3 foi comprado de Abgent. anti-fosfo- (Tyr705) -STAT3 (612,356) de anticorpo foi comprado de BD Biosciences. O anticorpo anti-RPL-18A foi comprado de Abcam. O anticorpo anti-IL-6 humano neutralizante (MAB206), recombinante humana IL-6 (206-IL), e CXCL1 humana recombinante (275-CR /CF) foram adquiridos a partir de R D Systems. anticorpos CXCL1 neutralizantes anti-humano (LS-C104351) foi adquirido a partir de Longevidade Biosciences. Anti-α-enolase anticorpo (MO1) e GAPDH recombinante humana (P4547) foram adquiridos a Abnova. Anti-IgG1 de ratinho Alexa Fluor 546, anti-IgG2a de ratinho Alexa Fluor 546, e anti-IgG1 de ratinho Alexa Fluor 350 anticorpos foram adquiridos a partir de Invitrogen. Anti-E-caderina anticorpo (SHE78-7) foi comprado de Enzo Life Science.

Pequenos RNAs de interferência (siRNA) visando RPS6 foram gerados como RPS6 Si # 1, 5′-CUGCGAGCUUCUACUUCUAAG-3 ‘e RPS6 Si # 2, 5’-GACUGACUGAUACUACAGUGC-3 ‘e foram adquiridos à Sigma com ARNsi de controlo. ON-TARGETplus SmartPool siRNAs contra a E-caderina humana e RPL-18A e controle siRNA, ON-TARGETplus piscina não-alvo, foram adquiridos da Thermo Scientific. Os ARNsi foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 ou lipofectamina reagentes RNAiMAX (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante.

Scads inibidor kits de I, II, e III (cerca de 300 pequenas moléculas inibidoras) foram gentilmente cedidas pelo Comité de Triagem Droga anticâncer apoiados por Grant-in-Aid para a Investigação científica em áreas inovadoras, programas de apoio científicos para a Pesquisa do Câncer, do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia, do Japão. PD98059, U0126, MEK inibidor I, inibidor de MEK II, MEK1 /2 Inhibitor II, e MEK1 /2 Inhibitor I foram adquiridos a Merck. PGE2 foi adquirido a partir de Cayman. matrizes de tecidos de cancro gástrico humano (A209II) foram adquiridos da ISU ABIXS.

GFP transfecção

As células (2 x 10

5) foram cultivadas em placas de 6 poços em 10% de FBS -DMEM durante 2 dias. O meio foi substituído por 800 uL de meio OPTI-MEM (Invitrogen), e depois 200 mL de OPTI-MEM contendo 1 ug de pEGFP-C1 vector (BD Biosciences), 4 ul de Lipofectamina Reagent (Invitrogen) e 6 uL de PLUS Reagente (Invitrogen) foram adicionados às células. Após 3 h de incubação, 1 ml de 20% de FBS MEM-OPTI-se adicionado a cada poço e as células foram cultivadas durante 24 h. Estavelmente células transfectadas foram seleccionadas com 400? G /mL de G418 (Promega).

Preparação de lisatos celulares e Western Blotting

Os lisados ​​celulares foram preparados e aplicados directamente à Western blots ou imunoprecipitados com anticorpos como descrito [30].

imunofluorescência

As células foram cultivadas na tampa de vidro desliza numa placa de 6 poços a 1 x 10

5 células por poço em DMEM suplementado com 1% dializado -FBS (D-FBS) preparado por diálise contra solução salina tamponada com fosfato (PBS) e TIS. As células foram lavadas com PBS e fixadas com acetona fria durante 2 minutos. células Hs738 foram coradas com anticorpos de actina-SM-a anti-vimentina e como [4] descrito. células de câncer gástrico foram coradas com anti-fosfo- (Ser235 /236) -RPS6 anticorpo e depois com anti-coelho secundário IgG Alexa Fluor 546 (Invitrogen). Para GAPDH imunocoloração, as células foram fixadas com formaldeído a 4% em PBS durante 15 min para as condições nonpermeabilized ou 4% de formaldeído em PBS durante 15 min e em seguida com metanol, durante 5 min para as condições permeabilizadas. As células fixadas foram coradas com anti-FLAG, anti-GAPDH, ou anti-E-caderina e em seguida com IgG anti-ratinho

1 Alexa Fluor 546, anti-IgG de ratinho

2-A 546, ou IgG anti-murganho

1 488. As células coradas foram analisadas com uma Leica DM IRB microscópio de fluorescência ou um escaneamento a laser microscópio confocal Olympus FV300 com software FluoView (Olympus).

experiências com animais

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de experiências com animais no Instituto de Microbiologia Química e realizada de acordo com as diretrizes e regulamentos para minimizar o sofrimento dos animais relevantes. ratinhos nus femininos, 6 semanas de idade, foram adquiridos de Charles River Breeding Laboratories e mantido em uma instalação específica barreira livre de patógenos de acordo com nossas diretrizes institucionais. Os ratinhos em 7 a 8 semanas de idade foram utilizados para experiências. células de cancro gástrico (8 x 10

6) foram tratadas com tripsina e ressuspensas com ou sem células Hs738 (8 x 10

6) em 0,3 mL de 10% de FBS-DMEM e em seguida combinada com 0,5 mL de factor de crescimento reduzidas Matrigel (BD Biosciences). Cem microlitros da suspensão de células (1 x 10

6 células) foram injectados subcutaneamente no flanco esquerdo dos ratinhos. Seis ratos foram usados ​​para cada conjunto experimental. O volume do tumor foi estimada utilizando a seguinte fórmula: Volume do tumor (mm

3) = (comprimento x largura

2) /2. Após os dias indicados, os tumores foram dissecados cirurgicamente. Para implante ortotópico, ratinhos fêmea foram anestesiados por injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio a 66,7 mg /kg. Depois de fazer uma pequena incisão abdominal mediana, células de cancro gástrico (1 x 10

6) em 20 mL do meio de Matrigel contendo foram inoculadas na parede meio da maior curvatura da porção glandular do estômago usando uma 30- agulha de calibre (Nipro) [31]. O estômago foi devolvido para a cavidade peritoneal, e a parede abdominal foi suturada e a pele foi fechada com um aplicador de Autoclip (Becton-Dickinson). Os ratinhos foram sacrificados nos dias indicados após a inoculação do tumor.

de crescimento celular e experiências de co-cultura

As células foram inoculadas num placas de 96 poços a 5 x 10

3 por células bem em 0,1 mL de DMEM suplementado com 1% de D-SBF e TIS. Depois da cultura durante os dias indicados, o crescimento celular foi determinada utilizando-se 3- (4,5-dimethyllythiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT, Sigma), como descrito [32] ou GFP medindo a intensidade de fluorescência (excitação a 485 nm e emissão a 538 nm), por lise das células em Tris-HCl 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl 0,9 mM

2, e 1% de Triton X-100. Para as experiências de co-cultura, as células Hs738 foram inoculados em primeiro lugar em placas de 96 poços a 5 x 10

3 células por poço em 0,1 mL de DMEM suplementado com 1% de D-SBF e TIS. As amostras de teste foram adicionados aos poços e as células foram cultivadas durante 2 dias. Em seguida, 10 ul de uma suspensão de células de cancro gástrico (5 x 10

3) em DMEM isento de soro, foram adicionados à monocamada de células Hs738 e as células foram ainda cultivadas durante 3 dias. Para monocultura de células de cancro gástrico, meio de ensaio sozinho com uma amostra de teste foi primeiro incubada durante 2 dias, e, em seguida, as células cancerosas gástricas foram adicionados como descrito acima e a cultura prosseguiu durante 3 dias. O crescimento de células de cancro gástrico foi determinada medindo a intensidade de fluorescência de GFP. Para cultura em suspensão, as células foram inoculadas numa placa de cultura de suspensão de 96 poços (MS-8096R; Sumilon) para comparação com uma placa padrão de cultura (MS-8096F; Sumilon). Para as experiências de Transwell, 0,6 ml de Hs738 células (5 x 10

4 células /mL) em DMEM suplementado com 1% de D-SBF e ITH foram primeiro adicionados a poços exteriores das placas Transwell com 0,4 uM membranas de dimensão de poro (3470; Corning) e 0,1 ml de meio de ensaio foi adicionada aos poços interiores. Após 2 dias de cultura, 10 mL de uma suspensão de células do cancro gástrico (5 x 10

3) em DMEM isento de soro foi adicionado às cavidades interiores e as placas foram ainda cultivadas durante 3 dias.

preparação de meio condicionado Hs738 (CM)

células Hs738 foram cultivados a 5 x 10

4 células /ml em DMEM suplementado com as concentrações indicadas de D-SBF e ITH para os dias indicados. Os sobrenadantes de cultura foram recolhidos por centrifugação. Para concentrar o meio, foram usadas Amicon Ultra-15-3K dispositivos centrífugos de filtro (Millipore) ou 2-D kit de limpeza (Amersham Biosciences). células de cancro gástrico (3 x 10

5) foram inoculadas em 1 ml de CM de células Hs738 ou meio de ensaio sozinho em pratos de 35 mm e cultivadas durante um dia. As células foram lavadas com PBS e os lisados ​​celulares foram preparados para transferência Western.

análise proteoma de CM

Para a identificação de proteínas fosforiladas partir de células de cancro gástrico, MKN-7 lisados ​​celulares foram aplicados para uma coluna de HiTrap Q FF (GE Healthcare) pré-carregado com 50 mM Tris-HCl pH 7,3. As proteínas foram eluídas por aumentos graduais de concentrações de NaCl. Após eluição, inibidores da protease e pirofosfato foram adicionados para as fracções eluídas. As fracções eluídas foram separadas por SDS-PAGE, e os géis foram corados com azul brilhante de Coomassie (CBB) e bandas idênticas às bandas de transferências de Western obtidas com anticorpo anti-fosfo-Ser /Thr foram excisadas. As bandas excisadas foram digeridas com tripsina e os péptidos digeridos foram então sujeitas a LC-MS /MS (LTQ-Orbitrap; Thermo Scientific). Para a identificação das proteínas inibidores do crescimento em Hs738 CM, CM (50 ml) foi concentrada utilizando dispositivos de filtração Amicon Ultra-centrífuga 15-3K e aplicada a uma coluna Superdex 200 10/300 GL coluna (GE Healthcare), para filtração em gel. As proteínas foram eluídas por PBS e foi determinado o efeito das proteínas fraccionados sobre o crescimento de células MKN-7. As fracções com actividade inibitória de crescimento foram reunidas e ainda separadas por electroforese em gel 2D. Manchas de interesse foram excisadas, digeridas com tripsina, e, em seguida, submetidos a análise de MALDI-TOF-MS LC-MS /MS ou (Instituto Life Science Apro).

Cytokine análise

As células foram cultivadas a 5 x 10

4 células /ml em DMEM suplementado com 1% de FBS e D-ITH durante 2 dias. O CMS foram recolhidos por centrifugação e as quantidades de IL-6, IL-6sR e CXCL1 foram determinados utilizando um IL-6 ELISA kit humano (Thermo Scientific), uma IL-6sR humano Quantikine (R D Systems) e um ser humano CXCL1 Quantikine (R D Systems). Os sobrenadantes da cultura foram também aplicadas sobre matriz de anticorpo citocina humana (série C 2000; RayBio). As quantidades de PGE2, 6-ceto PG, thromboxian B

2, e leucotrieno B4 foram determinados utilizando kits quantitativos de Cayman.

Imunohistoquímica

matrizes de tecido foram desparafinados em xilol e reidratados em descendente álcoois em água. Em seguida, as matrizes de tecido foram mergulhadas em 3% H

2O

2 durante 13 min e fervida em ácido cítrico a 10 mM (pH 6,0) durante 15 min. coloração imuno-histoquímica foi realizada com anti-fosfo- (Tyr705) -STAT3 (SAB43000033) usando ImmPRESS anti-Ig de coelho de peroxidase (Vector Laboratories) e o substrato DAB IMMPACT (Vector Laboratories). A intensidade visual estimado de imunocoloração fosfo-STAT3 foi graduada em uma escala de 3 pontos arbitrária:. Negativa, fracamente positiva e positiva

atividade GAPDH

atividade GAPDH foi medida como descrito [33]. Todos os reagentes foram adquiridos de Sigma.

Construção de GAPDH

recombinante

recombinante humana do tipo selvagem GAPDH e GAPDH mutante foram construídos como descrito [34], com modificações como segue. O ARN total foi isolado a partir de células Hs738 utilizando o RNeasy Minikit (Qiagen). O ADNc foi sintetizado utilizando transcriptase inversa de AMV (Promega) e o fragmento de ADNc de GAPDH humano de comprimento completo contendo

Nhe I e

Xho I

locais foi gerado por PCR usando polimerase PfxDNA (Invitrogen) e iniciador de sentido directo 1 (5′-TATGCTAGCGACTACAAGGACGACGACGACAAGATGGGGAAGGTGAAGGTCGGAG-3 ‘) e iniciador anti-sentido 2 (5′-TATCTCGAGTTACTCCTTGGAGGCCATGTGGG-3’). O

Nhe

I /

Xho

Eu fragmento de GAPDH foi inserido no vector pET-17b (Novagen). Para GAPDH mutante (C152S), um fragmento foi gerado por PCR utilizando um iniciador com sentido e anti-sentido iniciador 3 (5′-AGGGGTGCTAAGCAGTTGGTGGTGGAGGAGGCATTGCTGATGATCTTGA-3 ‘) e o fragmento 2 foi gerado por PCR usando o iniciador de sentido directo 4 (5′-TCAAGATCATCAGCAATGCCTCCTCCACCACCAACTGCTTAGCACCCCT-3’) iniciador anti-sentido e 2. O fragmento de GAPDH mutante de comprimento total foi gerado por PCR utilizando um iniciador com sentido, anti-sentido iniciador 2, e os fragmentos 1 e 2 como modelos. O

Nhe

I /

fragmento Xho

I da GAPDH mutante também foi inserido no vector pET-17b. mutantes de deleção de GAPDH foram construídos por PCR inversa utilizando um estojo de KOD-Plus-mutagénese (Toyobo) e conjuntos de iniciadores para DEL1, 5′-gcagttggtggtgcaggaggcatt-3 ‘e 5′-gacaacgaatttggctacagcaac-3′, para del2, 5’-ATCAAGTGGGGCGATGCTGGCGCTGAGTA- 3 ‘e 5′-CTTCCCCATCTTGTCGTCGTCGTCCTT-3′, e para del3, 5’-CTCCACGACGTACTCAGCGCCAG-3 ‘e 5′-accaccaactgcttagcacccctg-3’. Os vectores foram transfectados em células BL21 (DE3)

E

.

coli (Promega) ou ClearColiBL21 (Lucigen) e N-terminal do tipo selvagem humana marcado com FLAG e GAPDH mutante foram purificados utilizando anti-FLAG M2 de agarose (Sigma). A GAPDH parcialmente purificado foi adicionalmente purificada por filtração em gel (GE Healthcare) e resina de remoção de endotoxina (Thermo Scientific).

A ligação de GAPDH a membranas celulares

As membranas celulares foram preparadas utilizando o kit de ProteoExtract (Calbiochem ). As membranas celulares foram incubadas com eritrócitos de GAPDH humano a 5 U /mL ou FLAG-etiquetada em peso de GAPDH recombinante humana a 5 ug /mL durante 2 h à temperatura ambiente (TA) e imunoprecipitado pelo anti-GAPDH-proteína G de agarose ou anti-complexo FLAG M2 de agarose, respectivamente. Os imunoprecipitados foram analisados ​​por Western blotting.

A ligação de GAPDH recombinante de E-caderina

Uma placa de 96 poços foi revestido com 100 ul humano recombinante de E-caderina quimera de Fc (648-CE- 100, R D Systems) /poço de 1,5 ug /ml em PBS a 37 ° C durante 1 h. A placa foi lavada com PBS 4 vezes e bloqueada por adição de 100 uL /​​poço de 1% de BSA em PBS a 37 ° C durante 30 min. Após lavagem com PBS 4 vezes, GAPDH eritrócitos humanos em PBS foi adicionado à placa a 5 U /mL, e a placa foi mantida a 37 ° C durante 1 h. A placa foi então lavada com PBS 4 vezes e 50 ul de tampão de SDS-amostra foram adicionados a cada poço. Western blotting foi realizado utilizando 30 uL do tampão de amostra SDS de cada poço.

Construção de mutantes de deleção de E-caderina

humano do tipo selvagem E-caderina e vários mutantes de eliminação foram construídos como descrita [35], com algumas modificações. O ARN total foi isolado a partir de células MKN-7 utilizando o RNeasy Minikit (Qiagen). O ADNc foi sintetizado utilizando transcriptase inversa de AMV (Promega) e um fragmento de ADNc de E-caderina humana de tamanho completo contendo

Nhe I e

Xba I

locais foi gerado por PCR usando polimerase PfxDNA (Invitrogen ) e iniciador de sentido directo (5′-TATGCTAGCatgggcccttggagc-3 ‘) e iniciador anti-sentido (5′-TATtctagaaagtcgtcctcgccgcc-3’). O

Nhe

I /

Xba

Eu fragmento da E-caderina foi inserido a /myc-His pcDNA3.1 (-) vector B (Invitrogen). Vários domínios extracelulares de E-caderina foram eliminados por PCR inversa utilizando um estojo de KOD-Plus-mutagénese (Toyobo) e conjuntos de iniciadores, como descrito [35]. A sequência de todos os vectores de expressão foi confirmada por sequenciação. A linha de células 293 foi transfectada com os vectores de expressão utilizando o reagente Lipofectamina descrito acima e seleccionadas com G418. Os extractos celulares de membranas celulares e não-membranas foram preparadas utilizando o kit de ProteoExtract.

Síntese da biotinilado MEK Inhibitor I

biotinilado MEK Inhibitor I (b-MEK INH) e acilado MEK Inhibitor I (um INH -MEK) foram sintetizados em nosso laboratório (S26 Fig.) [36].

MEK Inhibitor I ensaio de ligação

extratos de células Hs738 foram preparadas utilizando tampão IP (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, NaCl 1 M, EDTA 1 mM, e EGTA 2,5 mM) como descrito [37]. Estreptavidina UltraLink resina (Pierce) foi pré-incubada com b-MEK INH em 2,7 mM durante 1 h à TA e depois lavou-se com tampão IP. Os extractos celulares foram incubados com o b-MEK-INH tratado Estreptavidina UltraLink resina com ou sem 100 uM de inibidor MEK I ou U0126 durante 3 h à TA. Após 4 lavagens com tampão IP, as proteínas ligadas foram analisadas utilizando SDS-PAGE seguida por LC-MS /MS proteomic análise (LTQ-Orbitrap; Thermo Scientific). Ou Western blotting

em tempo real de RT-PCR

células Hs738 foram cultivadas durante 2 dias a 5 x 10

4 células /ml em DMEM suplementado com 1% de FBS e D-ITH na presença de inibidor de MEK I. o ARN total foi isolado utilizando o RNeasy Minikit ( Qiagen). Os cDNAs foram sintetizados utilizando transcriptase reversa de AMV e iniciadores aleatórios (Promega) a partir de 1 ug de ARN. em tempo real de RT-PCR foi realizada em um sistema Cycler Dados Tempo real térmica (Takara) utilizando SYBR Premix Ex TaqII (Takara). primers específicos foram adquiridos da Takara.

preparação exossomo

Os exossomas foram preparados a partir do sobrenadante de cultura de células Hs738 como descrito [38].

A análise estatística

Todos os dados são representativos de pelo menos 3 experiências independentes, com resultados semelhantes. A análise estatística foi realizada por meio de Student

t

-teste.

Resultados

células estromais gástricos modular o crescimento das células cancerosas gástricas

Nós estabelecidos gástrico humano linhas celulares de cancro que expressam verde proteína fluorescente (GFP) (S1A Fig.). Definindo o mesmo órgão, utilizou-se células humanas gástricas do estroma (células Hs738) que eram uma mistura de miofibroblastos (vimentina (+) e SM-α-actina (+)) e fibroblastos (vimentina (+) e SM-α-actina ( -)) (Fig S1B) que se assemelhava a outras células estromais [4, 24].. Todos os 5 linhas celulares de cancro gástrico tumores formados quando injectado subcutaneamente em ratinhos nus (Fig. 1A), mas a co-injecção de células Hs738 suprimiu significativamente os tumores de MKN-1, MKN-7 células, e células MKN-28 (Fig. 1A ). Em contraste, o crescimento de tumores formados por MKN-45 e MKN-74 células foi aumentado pela presença de células Hs738 (Fig. 1A). Nós não conseguimos detectar metástases das células cancerosas seguintes inoculação subcutânea, mas todas as linhas celulares de cancro exibiram metástases na cavidade peritoneal quando injectados para dentro do estômago ortotopicamente (S2 Fig.). Os tamanhos dos tumores primários iniciados pelas linhas celulares de cancro injectados por si só para o estômago não diferiram significativamente. No entanto, os números e as frequências de focos metastáticos tendeu a ser maior com células MKN-45 e MKN-74 (células mal ou moderadamente diferenciados) e menor no MKN-1, MKN-7 e células MKN-28 (linhas celulares bem diferenciados [39]) (S2 Fig.). Estes resultados mostraram que o crescimento das linhas celulares de cancro gástrico bem diferenciados foi suprimida por células do estroma gástrico e o crescimento de linhas celulares de cancro gástrico indiferenciadas com elevadas capacidades metastáticos foi aumentada em células do estroma gástrico. Desde sugere-se que existem diferentes mecanismos nas interações celulares tumorais-estromal de câncer gástrico, temos tentado elucidá-los neste estudo.

células cancerosas gástricas (A) foram injectados por via subcutânea com ou sem estromal gástrico Hs738 células em ratinhos nus do sexo feminino. Os ratos foram sacrificados 37, 35, 34, 22, e 33 dias após a injecção de MKN-1, 7, 28, 45, 74 e células de cancro gástrico, respectivamente, e os tumores foram excisados. Os valores são médias ± S.D. (N = 6). (B) MKN-74 As células de cancro gástrico MKN-7 e foram cultivados sozinhos (Mono) ou co-cultivada com células Hs738 em proporções (cancro gástrico: Hs738) 1: 1 e 1: 2 de acordo com as concentrações indicadas de D-SBF. O crescimento das células cancerosas foi determinada de medição da intensidade de fluorescência da GFP. Os valores são médias ± S.D. (N = 3). fotomicrografias representativas em 1% D-FBS sob microscopia de fluorescência. Verde; GFP. barra de escala é de 200 mm.

Para estudar as interações entre células tumorais-estromal, desenvolvemos pela primeira vez um

in vitro sistema

co-cultura de linhas celulares de cancro gástrico e células Hs738 como descrito antes [22]. Para medir o crescimento de células de cancro selectivamente em co-cultura com células estromais, utilizou-se linhas celulares de cancro gástrico transfectadas com GFP (S1A Fig.). intensidades de fluorescência de GFP nas células lisadas bem correlacionados com o número de células, bem como ensaios de MTT (Fig. S1C). Para reduzir a influência de factores de crescimento em FBS, usamos FBS dialisado (D-FBS). Quando as linhas de células de cancro gástrico foram co-cultivadas com células Hs738, o crescimento de MKN-1, MKN-7, e células MKN-28 foi suprimida pela presença de células Hs738 (Fig. 1B e S3 Fig.). Embora o crescimento de células MKN-45 não foi alterada pela co-cultura, de células MKN-74 foi aumentada por co-cultura com células Hs738 especialmente a concentrações mais baixas de D-SBF (Fig. 1B e Fig S3A.). Embora a magnitude da influência dependia das concentrações de D-FBS, estes resultados de

experimentos in vitro

co-cultura foi semelhante ao

in vivo

resultados (Fig. 1A e S3 Fig. ).

factores segregados a partir de células do estroma gástricas regular a síntese de proteínas em células de cancro gástrico

Uma das características das células cancerosas é independente de ancoragem de crescimento [40]. Dado que as células de cancro gástrico foram inoculadas numa monocamada de células Hs738, a mudança do crescimento em co-cultura poderiam ter sido atribuível ao crescimento independente de ancoragem. Quando se comparou o crescimento em condições de suspensão com a condição aderente normal, o crescimento de todas as linhas celulares de cancro gástrico tendiam a ser suprimida, em condições de suspensão (S3B Fig.). Por outro lado, Transwell experiências revelaram que o crescimento de MKN-1, MKN-7, e MKN-28 células foi reduzida por co-cultura com células Hs738, enquanto que o crescimento de células MKN-74 foi aumentada e que de MKN- 45 células manteve-se inalterada (S3C Fig.). Estes resultados eram consistentes com

In vitro

experiências de co-cultura (Fig. 1B e Fig S3A.) E indicou que os factores segregados a partir de células Hs738, em vez de crescimento independente de ancoragem estavam envolvidos na regulação do crescimento.

desde factores secretados foram possivelmente envolvida na regulação do crescimento, que, em seguida, adicionou-se meio condicionado (CM) a partir de células Hs738 às células cancerosas gástricas e descobriu que a fosforilação de Ser /resíduos Thr das proteínas, em especial ~ 30 kDa, foi marcadamente alterada (Fig. 2A). A fosforilação de ~ 30 kDa em MKN-1, MKN-7, e células MKN-28 foi significativamente reduzida pelo MC, mas que em MKN-45 e células MKN-74 não foi afectado (Fig. 2A e S4 fig. ). proteomic análise das proteínas de 30 kDa ~ mostraram que um dos candidatos foi proteína ribossomal S6 (RPS6) (S4B Fig.). ARNsi contra RPS6 diminuiu a fosforilação das proteínas de 30 kDa ~ bem como RPS6 fosforilada (S4C Fig.). Além disso, os imunoprecipitados gerados pelo anticorpo anti-RPS6 foram detectados por anticorpos anti-fosfo-Ser /Tre, assim como anticorpos anti-RPS6 fosforilada (S4C Fig.). Assim, a proteína de ~ 30 kDa foi de facto RPS6. Na verdade Hs738 CM diminuiu a fosforilação de RPS6 em MKN-1, MKN-7, e MKN-28 de células, mas não a da proteína 14-3-3, outro candidato da proteína fosforilada (Fig. 2B e Fig S4B.). Além disso, RPS6 fosforilado em células MKN-7 foi encontrada para diminuir quando co-cultivadas com células Hs738 (Fig. 2C). A fosforilação de RPS6 é bem conhecida por desempenhar um papel crítico na regulação da síntese de proteínas [41]. Assim, nossos resultados indicaram que as células Hs738 pelo menos regulados negativamente a síntese de proteínas e suprimiu o crescimento da MKN-1, MKN-7, e MKN-28 células por meio de fatores secretados.

células cancerosas gástricas (A) foram cultivadas (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). (N = 3). hexafluorophosphate.

doi:10.1371/journal.pone.0119415.s026

(PDF)

Acknowledgments

We