Abstract

Fundo

anaplásico linfoma quinase (ALK) positividade representa um alvo molecular romance em um subconjunto de não-pequenas células do pulmão (NSCLC). Nós exploramos fluorescência

in situ

fluorescente (FISH) e imuno-histoquímica (IHQ) como métodos de diagnóstico para os pacientes positivos ALK e descrever a sua prevalência e os resultados em uma população de pacientes com NSCLC.

Métodos

pacientes com NSCLC previamente selecionados para o Fator de Crescimento epidérmico Receptor (EGFR) em nossa instituição foram selecionados. ALK pacientes positivos foram identificados por FISH e o valor de IHC (D5F3) foi explorado.

Resultados

Foram identificados noventa e nove pacientes. idade média era de 61,5 anos (variando de 35-83), todos eram caucasianos, oitenta por cento eram adenocarcinomas, cinquenta e um por cento eram do sexo masculino e trinta e oito por cento eram fumantes. Sete (7,1%) pacientes eram ALK positivo por FISH, treze (13,1%) foram mutante EGFR, e 65 (65,6%) foram negativos /tipo selvagem (WT), tanto para ALK e EGFR. ALK positividade e EGFR mutações eram mutuamente exclusivas. pacientes positivos ALK tendem a ser mais jovens do que os pacientes EGFR mutado ou wt. pacientes positivos ALK eram predominantemente não fumantes (71,4%) e adenocarcinoma (71,4%). ALK pacientes mutantes positivos e EGFR ter um resultado melhor do que o negativo /WT. Todos os pacientes com tumores negativos ALK peixes foram negativos para ALK IHC. De 6 pacientes positivos para FISH ALK com mais tecido disponível, 5 foram positivos para ALK IHC e 1 negativo.

pacientes positivos Conclusões

ALK representam 7,1% de uma população de NSCLC selecionado. ALK positivo pacientes têm diferentes características clínicas e um resultado melhor do que o EGFR WT e alq pacientes negativos. IHC é um método promissor para a detecção de pacientes com NSCLC positivos ALK

Citation:. Martinez P, Hernández-Losa J, M

a Ángeles Montero, Cedres S, Castellví J, Martinez-Marti A, et al. (2013) de fluorescência

In Situ

hibridação e Imunohistoquímica como métodos de diagnóstico para ALK positivo não-pequenas células do pulmão pacientes com câncer. PLoS ONE 8 (1): e52261. doi: 10.1371 /journal.pone.0052261

editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Estados Unidos da América

Recebido: 25 de junho de 2012; Aceito: 31 de outubro de 2012; Publicação: 24 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Martinez et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm financiamento ou apoio ao relatório

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pulmão é a causa mais frequente de câncer. relacionada morte no mundo, sendo responsável por mais de 1 milhão de mortes por ano. [1] Embora a quimioterapia citotóxica continua a ser a base do tratamento para a maioria dos pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas avançado (CPNPC), [2], a identificação de alterações genéticas específicas que conduzem a proliferação de células cancerosas tem levado ao desenvolvimento de novo terapias-alvo em um subconjunto de doentes com NSCLC [3], [4]. Nos últimos anos, quinase de linfoma anaplásico (ALK) rearranjo, predominantemente com a proteína associada a microtúbulos Echinoderm como gene 4 (EML4), foi identificado como um evento oncogénico num subconjunto de doentes com NSCLC [4]. ALK translocação resulta na expressão constitutiva do domínio de cinase de tirosina da proteína ALK, o que resulta no desenvolvimento de tumores e o crescimento. A dependência oncogênicos desse evento é demonstrada na base de que a atividade de remoção ALK quinase inverte o padrão maligna e de crescimento [5]. Recentemente, resultados de um ensaio clínico de fase 1 avaliação de um inibidor da ALK, Crizotinibe, em pacientes com NSCLC ALK positivo demonstrado resultados encorajadores [6]. Ensaios clínicos com Crizotinibe e outros inibidores ALK nesta população subconjunto de pacientes com NSCLC positivos ALK estão em andamento.

Os relatórios iniciais mostraram que pacientes com NSCLC positivos ALK tendem a ser mais jovens, predominantemente não /luz fumantes com uma histologia de adenocarcinoma de o NSCLC população total pacientes [7]. Estas características clinicopatológicas também são freqüentes em pacientes com mutações EGFR, mas ambos os eventos genéticos parecem ser mutuamente exclusivas [8]. Em pacientes não selecionados com NSCLC, a prevalência do ALK gama positividade de 1% a 7% [9], mas mais de 30% em pacientes selecionados para EGFR de tipo selvagem (WT), adenocarcinoma e sem história de tabagismo [7]. A sua prevalência na população europeia de pacientes com NSCLC ainda não está bem conhecidos selecionado.

No entanto, pacientes com NSCLC ALK positivos e suas characterictics particulares foram elucidadas, mas uma definição clara de positividade ALK continua a ser uma questão desafiadora. Os primeiros relatos sobre a prevalência de rearranjos EML4-ALK utilizada RT-PCR para detectar doentes, geralmente como uma análise retrospectiva dos espécimes ressecados de pacientes com NSCLC [4], [9]. No entanto, este método é capaz de detectar variantes ou rearranjos desconhecidos EML4-ALK com outros parceiros diferentes EML4. Novas plataformas foram desenvolvidas para suprir a deficiência [10]. Para a seleção de doentes em ensaios Crizotinibe, peixes com uma sonda de ruptura para além de ALK é o método de diagnóstico. teste FISH permite a detecção de translocações ALK, não importa o parceiro ou a variante, mas a definição ALK positivo por FISH e seu uso restrito aos espécimes ressecados ou biópsia são limitações [11]. Inmunoshistochemistry (IHC) foi também explorado. As análises IHC utilizando anticorpos contra a proteína ALK usado em malignidade hematológicas mostraram pouca sensibilidade em pacientes com NSCLC, provavelmente devido aos níveis mais baixos de proteína ALK expressa em comparação com malignidade hematológica com rearranjos ALK. O novo D5F3 anticorpo monoclonal alta sensibilidade parece ter precisão suficiente na identificação de pacientes a ser reproduzido em forma em todo o mundo [12], como todos os pacientes em que houve tecido suficiente no estudo de fase 1 Crizotinibe previamente selecionados pela positividade FISH também foram positivos pela IHC , ao passo que apenas dois dos três partes desses pacientes eram positivos por RT-PCR. amostras negativas peixes e tecidos pulmonares normais não expressar a proteína ALK por IHC [6]. Recentemente, outros métodos diagnósticos foram também exploradas [13], [14].

O objetivo deste estudo é explorar a prevalência de positividade ALK em uma coorte Europeu de pacientes com NSCLC selecionados pelos peixes, para melhor definir suas características e resultados clínicos e, para explorar IHC como teste de método de diagnóstico para ALK em pacientes com NSCLC.

pacientes e métodos

os pacientes

Todos os pacientes incluídos tinham recebido tratamento ou consulta do Serviço de Oncologia médica do Hospital Universitário Vall d’Hebron. Todos os pacientes com NSCLC previamente selecionados para o estado da mutação EGFR entre maio de 2006 e janeiro de 2010 foram selecionados. análises de mutações EGFR foi realizada com base em um caso médico por indicação de caso, tendo em conta o sexo, histologia e história de fumar, mas sem parâmetros fixos. Os prontuários médicos foram revisados ​​e basais clínico-patológicas características, tratamentos e resultados gravados. Se o tecido estava disponível para análises ALK, os pacientes foram inicialmente testados por FISH e posteriormente por IHC. A Comissão de Ética Institucional analisou e aprovou este estudo.

amostras tumorais

lâminas não coradas de, (FFPE) amostras de tumor fixados em formalina e embebidos em parafina de biópsias ou blocos de células de reconstrução de citologia ou, a ausência deste, as lâminas de citologia foram então analisadas.

analisa EGFR mutacional

Extração de DNA.

as amostras obtidas por FNA e FFPE foram digeridos durante 48 horas com proteinase K e 180 ul de tampão G2 digestão a 37

aC, em seguida, o DNA foi extraído com ADN EZ1 Kit do tecido com uma estação de trabalho BioRobot EZ1 eluição das amostras em 50 uL, seguindo as instruções do fabricante. A concentração e a pureza do ADN extraído foi determinada por espectrofotometria e, em seguida, o ADN foi armazenado a -20 ° C.

A amplificação de PCR e sequenciação directa.

O PCR foi realizado em 30 volumes ul usando 50 ng de ADN molde, 0,75 U de AmpliTaq DNA ouro polimerase (Perkin-Elmer; Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ), 3 ul de tampão de PCR (Perkin-Elmer), 0,8? mol /L desoxinucleótido trifosfato (Promega), 0,5 umol /L de cada iniciador, e as concentrações de MgCl2, exões 19 e 21 foram amplificados por PCR. As sequências dos iniciadores foram obtidos como descrito em dados complementares. programa de PCR foi efectuada por 35 ciclos de desnaturação a 94 ° C durante 45 s, hibridação do iniciador a 58 ° C durante 30 s, e alongamento a 72 ° C durante 30 s. Uma extensão final a decorrer a 72 ° C durante 10 min. As bandas de produtos de PCR foram visualizados por electroforese em gel com Bret. Cada amostra foi sequenciado em duplicado, tanto para a frente e direções usando o kit Big Dye Terminator 3.1 reversa (Applied Biosystems; Foster City, CA) e um prisma ABI 310 (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. As sequências foram então comparadas com a sequência humana GenBank-arquivado para

EGFR

(número de acesso AY588246) por Chromas Pro Software.

determinação EGFR por PCR em tempo real.

Todos casos foram analisados ​​utilizando o kit de TheraScreen EGFR PCR (Qiagen. Manchester Ltd) seguindo as instruções do fabricante para detectar mutações em reacções de PCR em tempo real. PCR em tempo real foi realizada utilizando um ABI7500Fast (Applied Biosystems, Foster City, CA) sob as seguintes condições:. Os dados foram analisados ​​usando 7500 software (versão 2)

fluorescência

in situ

Hibridização (FISH)

Nós preparamos 4 mm cortes histológicos embebidos em parafina para análise FISH. O Vysis LSI

ALK comercial

Dual Color, Separar Rearranjo Probe (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados foram analisados ​​em um microscópio de fluorescência Nikon (501) utilizando o software de sistema de imagem Isis fluorescência. Um mínimo de 100 núcleos foi marcado. Um caso positivo FISH foi definida como tendo mais de 15% de células tumorais mostrando sinais verdes e vermelhos separados ou sinais vermelho único células identificadas com rearranjado

ALK

. FISH foi realizada e analisada por dois patologistas diferentes.

Immnunohistochemistry

3 secções Resumidamente um de espessura foram cortadas a partir das amostras de tecido e colocados em lâminas de vidro com poli-L-lisina-revestidas. Todas as lâminas foram coradas com anticorpo ALK (clone D5F3 Cell Signaling Technology) diluída 1:50 usando um kit de detecção Ventana Ultraview DAB em um processador BenchMark XT Ventana (Ventana Medical Systems, Inc, Tucson, AZ). A recuperação antigênica foi um padrão processo automatizado no benchmark XT Ventana a 37 ° C por 16 minutos. Todas as lâminas foram analisadas por dois patologistas diferentes e classificados. As amostras foram consideradas positivas IHC-se uma coloração específico do tumor de qualquer intensidade em ≥10% das células de tumor estavam presentes.

Análise estatística

A menos que especificado de outro modo, para as análises de marcadores clínicos e moleculares em amostras de pacientes, o teste exato de Fisher foi usado para avaliar correlação entre as variáveis ​​categóricas, eo teste t de Student foi utilizado para avaliar associação entre as distribuições de resultado do tratamento. Todos os valores p relatados são dois lados salvo indicação em contrário, e nós considerado um teste como estatisticamente significativos se p ≤ 0,05. Para comparar a correlação entre FISH e IHC para detectar ALK positivo pacientes que usaram um método de kappa.

Resultados

Entre maio de 2006 e janeiro de 2010, um total de 99 pacientes previamente selecionados para mutações EGFR com o tecido ALK disponível para análises por FISH foram identificados. A disponibilidade de tecidos de peixes e análises IHC foi avaliada como positiva pela existência de um bloco FFPE ou lâminas de citologia nos arquivos da nossa instituição. Após procedimentos do estudo, não houve tecido suficiente para realizar um ensaio de FISH válida em 14 pacientes. Para a análise IHC este número foi maior, em 19 pacientes.

características basais dos doentes estão resumidos na Tabela 1 (Tabela 1). Os pacientes eram predominantemente adenocarcinomas (80%) e nunca /ex-fumantes (62%), com igual distribuição por sexo.

Das amostras de 99 tumores rastreados, 13 pacientes (13,1%), continham uma mutação EGFR activação , 7 pacientes (7,1%) foram ALK positivo e 65 pacientes (65,7%) eram EGFR WT e ALK negativo, e em 14 pacientes (14,1%) não houve tecido suficiente para realizar um ensaio de FISH válido para ALK (tabela 2). mutação EGFR e positividade ALK eram mutuamente exclusivas. pacientes positivos

ALK tendem a ser mais jovens (56 anos) do que mutante EGFR (63 anos) ou pacientes EFGR WT /ALK negativo (62 anos), mas essas diferenças não foram estatisticamente diferentes. Não houve qualquer prevalência de sexo claro aos pacientes positivos ALK (4 fêmeas e 3 machos). Cinco deles nunca eram fumantes (71%) e 2 eram fumantes no momento do diagnóstico. Todos os pacientes positivos ALK teve uma histologia não escamosa, 5 de 7 pacientes eram adenocarcinoma e os outros 2 pacientes tiveram Sem Outra Especificação (NOS) NSCLC. Quatro dos 5 pacientes positivos adenocarcinoma ALK mostrou um padrão sólido e crescimento acinar e, além disso, quatro dos cinco apresentaram um padrão com células anel assinados estava presente. (Figura 1)

análise de FISH usando uma sonda de quebrar. As células positivas mostram uma fusão dos sinais vermelho e verde correspondente ao cromossoma intacto, e os sinais indicativos de divisão do rearranjo ALK (setas). Imuno-histoquímica para ALK em um NSCLC utilizando anticorpo D5F3. show de células tumorais expressão citoplasmática da proteína, enquanto o resto das células são completamente negativo (20 ×).

pacientes mutantes EGFR teve também um predominantemente adenocarcinoma histologia (100%) e eram predominantemente nunca fumaram (71 %), mas com uma predisposição clara de gênero para as mulheres (77%).

a /grupo negativo ALK EGFR peso ea /grupo desconhecido ALK EGFR peso não diferem em suas características basais e foram comparáveis ​​com as características de toda a coorte de 99 pacientes.

Nós também explorou a melhor resposta clínica com um TKI EGFR ou regime de quimioterapia à base de platina em pacientes metastizado ou recorrente em função do estado EGFR e ALK. Como esperado, os pacientes positivos de ALK tratados com erlotinib não tinham respostas objectivas; No entanto, apenas dois doentes positivos de LFA foram tratados com TKI EGFR de. Não há respostas para wt EGFR /pacientes negativos ALK foram vistos foram tratados com um EGFR TKI. Por outro lado, um 75% de respostas foram observadas entre o grupo de pacientes mutantes do EGFR. As respostas a primeira linha de quimioterapia baseada em platina foi de 29% para os doentes positivos de ALK, 60% para os pacientes mutantes EGFR e 40% para EGFR WT /ALK negativo. (Tabela 3)

No momento da análise, acompanhamento médio dos 65 pacientes com avançado /recaída NSCLC foi de 9,5 meses entre os pacientes ainda vivos; Naquele tempo, 57 pacientes haviam morrido. Analisamos a sobrevida global (OS) de pacientes de acordo com a ALK e EGFR genótipo. O OS mediana para doentes negativos EGFR p /ALK foram 4,5 meses, para pacientes mutantes EGFR foram 15,7 meses (p = 0,018) e tinha sido não chegou para pacientes positivos ALK (p = 0,103). No grupo positiva ALK havia quatro pacientes (de um total de sete) que tinha recebido crizotinib como parte de seu tratamento em algum momento no curso de sua doença. (Figura 2)

Finalmente, foi realizada uma ALK IHC com o anticorpo D5F8 nos 80 pacientes em que houve material ainda disponível após EGFR e análises de peixe (Figura 3). Todos os 73 pacientes negativas para ALK por FISH também foram negativas para IHC. Dos seis pacientes positivos PEIXES ALK testados para IHC, 5 foram positivas e uma negativa. Isto resulta em um valor preditivo positivo para IHC com anticorpo D5F8 de 100% e uma boa concordância global (Kappa 0,783, intervalo 0,642-0,924) (Tabela 4).

Discussão

activação ALK tem sido identificada como uma alteração oncogénica condutor em um subconjunto de doentes com NSCLC. Rearranjos envolvendo gene ALK é um exemplo de dependência oncogénica. ALK pacientes positivos mostrar predominantemente uma histologia de adenocarcinoma, não fumar história luz /e menor idade no momento do diagnóstico. Developement de novas drogas que alvejam essa alteração levou a respostas tumorais impressionantes neste subgrupo de pacientes. Recentemente, crizotinibe, uma pequena molécula que inibe a actividade de quinase tirosina do ALK, foi aprovado para o tratamento de doentes com NSCLC avançado ALK positivo depois imprimindo resultados em ensaios precoces [6]. Ao mesmo tempo, um teste de diagnóstico molecular FISH foi aprovado pela Food and Drug Administration para detecção de doentes positivos de ALK. Tomados em conjunto, estes dois fatos, mostrar o quão importante é na era de terapias-alvo para identificar e validar um biomarcador para selecionar os pacientes mais adequados para alcançar um benefício, mesmo desde o início do desenvolvimento.

No nosso relatório, vamos selecionar um subgrupo de pacientes com base no que anteriormente determinação da condição de EGFR vamos para identificar uma população de pacientes mais adequados para abrigar uma alteração ALK. Este critério, utilizando um biomarcador, deixava-nos a identificar uma população enriquecida de pacientes com NSCLC em que as características moleculares foram consideradas clinicamente relevantes. Nesta coorte, a prevalência de mutações EGFR foram de 13,1%, que é próxima da frequência relatado pelo Grupo Cancer Espanhol Lung em uma população semelhante [15], o que indica indiretamente que a nossa população selecionada representa o montante global de pacientes que estão selecionando para o rastreio EGFR na prática rotineira. ALK pacientes positivos por FISH representa em nosso estudo a 7,1% do total, o que é concordante com as publicações de outros investigadores nesta população de pacientes [7] – [9], [16] e ser o primeiro relatório prevalência ALK em uma coorte pacientes com NSCLC europeus predominantemente metastático.

Como relatado anteriormente, os pacientes positivos ALK eram predominantemente adenocarcinomas, com baixa história de tabagismo anterior e tendem a ser mais jovens do que a quantidade de pacientes com NSCLC. Portanto, os pacientes positivos ALK não apresentaram respostas ao EGFR TKI de mas um benefício semelhante da quimioterapia do que os pacientes negativos ALK. Embora os relatórios anteriores têm sugerem que o pemetrexed pode ser o agente quimioterapêutico preferido para doentes positivos de ALK [17], [18], devido ao pequeno tamanho da nossa população positiva ALK que não eram capazes de realizar esta análise. Curiosamente, dois dos pacientes positivos ALK em nossa serie eram fumantes atuais no momento do diagnóstico.

Dados recentes parecem indicar que, na ausência de agentes ALK alvo ALK positividade é um fator prognóstico negativo para pacientes com NSCLC [19 ]. No entanto, em doentes com doença avançada, NSCLC ALK-positivos, a terapia crizotinibe está associada com a sobrevivência melhorada em comparação com a dos controlos Crizotinibe-naive [20]. Em nosso estudo, analisados ​​sobrevivência em função do estado molecular, independentemente de serem tratados com crizotinib ou outro inibidor da ALK e descobrir que os pacientes com NSCLC ALK positivos tendem a viver mais do que os pacientes negativos EGFR p /ALK. Nós não realizar uma análise de sobrevivência para pacientes positivos ALK ajuste para o tratamento crizotinib devido ao pequeno tamanho da coorte. No entanto, quatro dos pacientes positivos de ALK tinham sido tratados com crizotinibe no momento da análise de sobrevivência. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que, na era das terapias-alvo ALK, os pacientes positivos NSCLC ALK ter um resultado melhor do que pacientes negativos EGFR WT /ALK. No entanto, estes resultados devem ser analisados ​​com cautela, uma das viés de seleção neste estudo é que os pacientes com um nível de desempenho pior do que pacientes com câncer de pulmão em geral tinham sido incluídos. A principal razão para que o viés é que pacientes com melhor desempenho tinham sido recrutados para ensaios clínicos e EGFR não foi testado em nosso laboratório local. Outro possível viés é que, em pacientes com mau desempenho o mais comorbidades do estado mutacional EGFR foi analisada como esses pacientes não eram adequadas para receber outro tipo de tratamento de EGFR TKI de se uma mutação EGFR foi demonstrada. Ambos os preconceitos podem enriqueceu a nossa coorte de pacientes com resultados mais pobres e, por isso, apenas 15 dos pacientes em peso EGFR /pacientes negativos ALK foram tratados com uma quimioterapia baseada platinun.

Uma questão importante para os médicos é identificar os pacientes adequados para o tratamento com crizotinib. análise FISH é o método padrão. No entanto, IHC tem sido explorada por diferentes grupos na tentativa de identificar um método mais em todo o mundo adequado para triagem e diagnóstico de pacientes positivos de ALK. Primeiros anticorpos, anteriormente utilizados para o diagnóstico de malignidade haemathological, mostraram ter sensibilidade não o suficiente para ser aplicada em pacientes positivos ALK [12]. Desde então, duas estratégias de alta sensibilidade têm sido exploradas. Um deles é o de melhorar a sensibilidade do teste e desenvolver uma pontuação IHC para a seleção de pacientes para análise FISH [21], [22]. Outra abordagem, consiste em anticorpos de sensibilidade e especificidade elevados ALK desenvolvido que conduziu identificar pacientes positivos de ALK, por si só [23], [24]. Em nosso estudo, foi utilizada uma nova alta sensibilidade e especificidade monoclonal D5F3 anticorpo em uma coorte de pacientes selecionados com NSCLC em paralelo com os peixes para identificar ALK pacientes positivos. Descobrimos que todos os pacientes positivos ALK por IHC também foram positivos por FISH. No entanto, um paciente positivo FISH resultou negativo em IHC. Esse paciente falso negativo não tinha mais tecido disponível para repetir a análise, mas já havia sido recrutado em um julgamento crizotinib com outra análise positiva FISH no laboratório central do estudo. Tomados em conjunto, poderíamos concluir que uma análise IHC positiva com o anticorpo monoclonal D5F3 deve ser suficiente para selecionar um paciente para receber o tratamento com um inibidor da ALK como nenhuma positivo para IHC paciente foi foi considerado negativo por FISH. Quando um médico deve considerar a possibilidade de realizar uma análise de FISH em um paciente com um resultado negativo pela IHQ, ou vice-versa, é uma questão que deve ser abordada no futuro. Ainda mais, o que é o significado de uma positividade do teste FISH em menos de 15% das células ou o que deve ser feito com esses pacientes sem resultados concordantes com IHC e peixe são algumas das relativas a questões a ser padronizado no futuro.

Para concluir, no nosso estudo mostrou que a prevalência de pacientes positivos Alk é 7,1% em um caucasiano população selecionada de NSCLC por FISH. Na era da ALK tratamentos direcionados ALK positivo pacientes têm diferentes características clínicas e um melhor prognóstico do que o EGFR WT e alq pacientes negativos. IHC com anticorpo monoclonal D5F3 contra ALK é um método preciso para detectar pacientes com NSCLC positivos de ALK.