Abstract
O excluída no cancro do fígado (uma DLC1) gene supressor de tumor codifica uma proteína de activação RhoGTPase (RhoGAP). O gene DLC1 tem múltiplas isoformas de transcrição e que têm anteriormente estabelecida uma estirpe de ratinho contendo uma inserção do gene armadilha (GT), que reduz especificamente a expressão da isoforma de 6,1 kb (isoforma 2). Este gene alelo preso quando resultados homozigóticos em letalidade embrionária e os ratinhos heterozigóticos gene presas não mostrar um aumento da incidência de cancros, o que sugere que as alterações cooperando oncogénicos podem ser necessários para a transformação. No presente trabalho, estudamos o
in vivo
cooperação entre genes oncogénicos K-ras2 e DLC1 na tumorigénese. Temos observado um aumento dos cancros invasivos do timo, incluindo ambos os timomas e linfomas, resultando em uma vida significativamente reduzido se estende em camundongos heterozigotos para o alelo gt DLC1 e um inducible LSL-K-ras2
alelo G12D em comparação com o LSL-K- ras2
G12D apenas ratos. Os ratinhos heterozigóticos apresentaram um elevado grau de metástases no pulmão. Encontraram-tumoral selectiva específica hipermetilação do promotor isoforma 2 DLC1 e redução da expressão da proteína correspondente no linfoma tímico (TL) e carcinoma epitelial tímica (TCE) derivado dos tumores do timo. As linhas celulares de linfoma do timo deficientes DLC1 apresentaram maior migração celular trans-endotelial. linhas celulares de TEC também exibiram aumento da formação de fibras de stress e a actividade de Rho. Introdução das três isoformas DLC1 marcadas com GFP para estas células resultaram em diferentes alterações morfológicas. Estes resultados sugerem que a perda de expressão de apenas isoforma 2 pode ser suficiente para o desenvolvimento de tumores do timo e metástase
Citation:. Sabbir MG, Prieditis H, Ravinsky E, Mowat MRA (2012) O papel da DLC1 de isoformas 2 em K-ras2
G12D cancro induzido timo. PLoS ONE 7 (7): e40302. doi: 10.1371 /journal.pone.0040302
editor: Chun-Ming Wong, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 08 de dezembro de 2011; Aceito: 07 de junho de 2012; Publicação: 05 de julho de 2012
Direitos de autor: © 2012 Sabbir et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado com doações da Cancer Research Society Inc. (https://www.src-crs.ca/en-CA) e CancerCare Manitoba Foundation Inc. (https://www.cancercarefdn.mb.ca). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o excluída no cancro do fígado 1 (DLC1) gene supressor de tumor codifica uma proteína de activação de Rho GTPase (RhoGAP) que aumenta a hidrólise intrínseca do GTP ligado Rho ao PIB forma inactiva ligada de Rho. O gene DLC1 foi encontrado frequentemente suprimida ou, regulada negativamente por hipermetilação do promotor em cancros da mama, do pulmão, do fígado, do cólon e tumores da próstata [1] – [6]. Um estudo recente usando análise de oligonucleotídeo microarray representacional mostrou deleção heterozigótica de DLC1 lugar em ~ 50% do fígado, mama e pulmão tumores e 70% dos cancros do cólon [7].
In vitro
estudos mostraram que a transfecção do gene DLC1 pode inibir o crescimento de células [5], [7], abolir
In vivo
formação de tumor [2] e induzem a apoptose. Recentemente, experimentos usando
ex vivo
knockdown de DLC1 no nulo p53 e células progenitoras hepáticas induzidas Myc mostraram sobrevivência reduzida após injecção em ratinhos [7].
O gene DLC1 tem pelo menos três grandes isoformas de transcrição expresso sob a influência de três promotores alternativos no ratinho [8]. Temos anteriormente estabelecida uma estirpe de ratinho contendo uma inserção de armadilha de genes, que reduz especificamente a expressão da isoforma de transcrição de 6,1 kb (isoforma 2) de DLC1, criando assim um hypomorph [8]. ratinhos homozigotos presas DLC-1 gene mostram um fenótipo letal embrionário [8], o que o rato de abate fenocópias DLC1 exão 5 de Durkin et ai. [6]. Os camundongos knockout e de genes preso heterozigotos são viáveis e não mostram qualquer aumento em tumores espontâneos [6], [8]. Isto indica que os acontecimentos oncogénicos adicionais para além DLC1 deleção são necessários para a transformação
Tem sido demonstrado que, em certas situações a activação da sinalização de Ras pathway detenções ciclo da célula, induzindo a senescência em vez de causar a proliferação de células [9] -. [12 ] através da indução de p21
WAF1 [13], [14]. Também tem sido mostrado que em células activadas Ras, um requisito para a sinalização Rho é para a supressão da p21
WAF1 [15]. Mais uma vez, em fibroblastos transformadas de Ras, a sinalização ERK MAP Quinases-sustentada favorece a selecção de níveis elevados de Rho-GTP activo para permitir a regulação negativa dos elevados níveis de p21
WAF1 [16]. Portanto, se a hipótese de que a activação da via de Rho através da perda da expressão DLC1 RhoGAP irá complementar os oncogene Ras na transformação de células
In vivo
. Também não é conhecida, o que DLC1 isoforma é crítico para a supressão do tumor. Neste estudo, relatamos alta incidência de câncer do timo metastático em DLC1 isoforma ratos preso 2 gene heterozigotos com um K-ras2
alelo G12D oncogênico. Encontramos também hipermetilação seletiva do promotor DLC1 isoforma 2 nestes tumores.
Resultados
alta incidência de câncer do timo na DLC1
p /gtLSL-K-ras2
wt /Mice G12D infectadas com AdCMV-cre
Para testar se a perda de DLC1 iria cooperar com o gene K-ras2 em transformação, que fez uso do LSL-K-ras2
G12D camundongo transgênico [17]. Para ativar o oncogénico K-ras2
alelo G12D, DLC1
p /gt; K-ras2
p /G12D (KD) e DLC1
p /p; K-ras2
p /ratinhos G12D (K
+) foram injectados com adenovírus Cre-expressando AdCMV-Cre, através da veia da cauda. A maioria dos ratinhos desenvolveram tumores primários do timo dentro de 6 a 9 meses para 52,6% (10/19) da K
+ ratinhos contra 69,5% (16/23) dos ratinhos portadores de tumores KD (Figura 1A B , Tabela 1). Os ratos foram geralmente abatidos por problemas de respiração graves devido à compressão da cavidade torácica pelos tumores do timo crescimento (Figura 1C). Após a necropsia, alguns destes ratinhos também mostraram lesões neoplásicas em outros órgãos, incluindo o rim, fígado, pulmão, testículos e dos ovários, mas, a maioria dos ratos apresentavam tumores do timo (Figura 1A, Tabela 1). A maioria dos tumores do pulmão foram células de linfoma timo metastáticas a origem (Figura 2E, Tabela 2). Para determinar a sobrevivência geral, a análise de Kaplan-Meier dos ratinhos injectados AdCMV por CRE foi realizada. Isto revelou sobrevivência significativamente menor nos ratos gene preso KD heterozigotos comparação com K
camundongos + (valor P = 0,0077, Figura 3A).
(A) Frequência de diferentes tipos de tumor primário. (B) A freqüência relativa dos diferentes tipos de cancros do timo (C) Imagem primário do timo (seta) no rato e um timo dissecado com linfoma.
Para entender o natureza dos cancros do timo, foi realizada imuno-histoquímica utilizando uma célula T específica do marcador CD3 e marcadores específicos de células epiteliais do timo, citoqueratina 5 (CK5) e citoqueratina 8 (CK8 /Troma) [18]. No ratos jovens normais (6 semanas de idade) os linfócitos T foram encontradas uniformemente distribuído nas regiões tanto córtex e medula do timo, ao passo que as células epiteliais foram fortemente medulares CK5 e células epiteliais corticais foram fortemente CK8 positivo (Figura 2A). No entanto, nos ratos adultos os linfócitos T foram predominantemente deslocado para a região medula central e as células epiteliais corticais foram fortemente CK8 positiva com manchas isoladas de células positivas CK5 (Figura 2B). Utilizando estes marcadores encontrámos um número significativamente maior de linfomas do timo de 80% (10/08) na K
+ ratinhos contra 68,7% (11/16) nos ratinhos KD (Figura 1B 2D, Tabela 3) . Uma fracção menor (20% (2/10)) eram predominantemente carcinomas epiteliais tímicas (timoma) na K
+ ratinhos contra 31,2% (5/16) nos murganhos heterozigóticos KD (Figura 1B 2C), tal como acordo com a classificação histológica de Bernatz et al. [19]. A frequência de timomas entre a K + e camundongos KD não foi estatisticamente significativa. Encontraram-se apenas um tumor num ratinho KD, que mostrou um tipo misto timoma, o qual pode ter tanto linfoma de célula T e timoma.
timo normal de rato na semana 6 (A) e 18 semanas (B) que mostra a expressão do marcador de células T (CD3) e diferentes marcadores de citoqueratina específicos para células tímicas medulares epiteliais (CK5) e células epiteliais corticais (Ck8). A imuno-histoquímica mostrando carcinoma epitelial do timo (C), linfoma de células T (D) e metástases pulmonares de linfoma de célula T (F).
Primária Tímico Tumores metástase frequentes para Lung
a imuno-histoquímica revelou também que a maioria dos tumores de linfoma timo tinha metastizado para múltiplos focos no pulmão. A maioria das metástases pulmonares foram de linfoma de células T de origem (Figura 2E, Tabela 2). Quantificação das lesões metastáticas do pulmão de cada coorte mostra significativamente mais elevada frequência de metástases em ratinhos em comparação com o KD K
+ ratinhos (Figura 3B).
(A) a sobrevivência cumulativa de heterozigotos LSL-K-ras2
G12D; DLC1
p /GT e LSL-K-ras2
G12D; DLC1
p /p ratos após Cre expressar injeção de adenovírus na veia da cauda. O tempo de sobrevida foi definido como o tempo após a injecção até a morte ou abate, devido a atingir pontos finais sem crueldade. Um total de 15 LSL-K-ras2
G12D; DLC1
p /p e 18 LSL-K-ras2
G12D; DLC1
p /gt foram utilizados ratos para o estudo de sobrevivência. Os dados censurados foram ratos que morreram de causas desconhecidas sem tumor detectável ou leucemia. (B) Freqüência de tumores de pulmão metastático. Os dados forma quadrado pontos cinzentos indicam as lesões metastáticas derivadas de ratos que eram a fonte de linhas de células T linfoma 1 e 2. valor P = 0,0257 (pelo teste de Mann-Whitney).
Primária de células T linfoma e Timoma linhas de células são deficientes em isoforma 2 DLC1 Proteínas e mostraram aumento RhoA Atividade
Nós estabelecemos 4 linfoma do timo (TL) e linhas de células de carcinoma 3 timo epitelial (TEC) (Figura 4A) do tumores primários para estudar a expressão da proteína DLC1. Estes tumores eram ou células CD3 + células-T ou CK ou CK 5 8 células epiteliais positivas (Figura 2C D). As linhas TL e celulares TEC espontaneamente imortalizada e foram cultivadas até 20 passagens, sem qualquer diminuição no potencial de crescimento. as taxas de proliferação de células, por um método de contagem celular, demonstraram que as linhas celulares do TCE 1-2 (KD) tinha um aumento da taxa de crescimento em comparação com a linha de células do TCE 3 (K +) (Figura 4A /II). As linhas celulares de TL não mostrou nenhuma diferença significativa na taxa de proliferação celular em cultura.
A (i) micrografia de campo brilhante da TEC e TL células em cultura. (Ii) a taxa de proliferação de linhas de células de TEC. As células foram plaqueadas em placas de 6 alvéolos e, em seguida, o crescimento celular foi analisado por contagem do número de células, por conseguinte, durante 7 dias. B (i) de imunofluorescência mostrando células epiteliais tímicas expressando de CK8 e CK5 e (ii) do linfoma de células T que mostra a expressão de CD3. (C) a expressão do mRNA DLC1 na TEC e linhas celulares TL. (I) Representação esquemática do locus e splicing DLC1 padrão das três principais isoformas. A estratégia e os iniciadores utilizados para a quantificação relativa do DLC1 isoformas 2 e 3, utilizando RT-PCR multiplex. (Ii) RT-PCR que mostra a intensidade relativa da isoforma 2 e 3 Expressão de ARNm em linhas de células de linfoma de células T e de timoma. (Iii) Multiplex PCR que mostra a intensidade relativa da isoforma 2 e 3 Expressão de ARNm em 5-AzaC tratada TL e TCE linhas de células (D) a expressão da proteína DLC1: (i) proteína DLC1 de linfoma de célula T e linhas de células de carcinoma epitelial do timo, bem como timo adulto normal e de tecido de fígado de ratinhos C57BL rato /6J e células T a partir de linfócitos de sangue periférico (PBL). (Ii) gráfico que mostra a intensidade relativa de DLC1 123 kDa (isoforma 2) e 127 proteínas anónimos kDa nas linhas de linfoma de células T e de células de carcinoma bem como timo adulto e tecido do fígado de C57Bl rato 6J /(* p 0,05, * * P 0,01, *** P 0,001, **** P 0,0001). a expressão da proteína E. DLC1 de 5 AzaC tratada TL e linhas celulares TEC.
Em nosso estudo anterior, que relataram a existência de duas isoformas diferentes pesos moleculares de proteínas DLC1 em diferentes tecidos de camundongos e em ratos fibroblastos embrionários (FAE), que presumivelmente se origina a partir das isoformas 2 e 3 ARNm ou por modificações pós-traducionais [8]. A 123 kDa DLC1 normal (isoforma 2) é expresso a um nível baixo no timo adulto. Considerando que, a proteína de reacção cruzada 127 KDa é expresso a um nível mais elevado no timo quando comparado com o fígado em transferências de Western (Figura 4D /I). Curiosamente, as linhas de células de timoma e linfoma mostraram expressão inferior da banda de proteína de 123 kDa e o ARNm correspondente isoforma 2, quando comparado com o timo normal (Figura 4C D /I-II). As linhas celulares LT4 e Tec3 de K + camundongos mostraram níveis de expressão DLC1 comparável com o tipo selvagem timo. (Fig. 4C /I-II). O TL1, 2 3 e TEC 1 2 linhas mostraram níveis mais baixos em comparação com as linhas de ratinhos K + (Figura 4D). Além disso, houve um aumento significativo na banda de proteína de 127 kDa nos tumores, em comparação com o timo (Figura 4D). No nosso estudo anterior, bem como no presente estudo, nós verificámos que o nível de expressão da proteína de 127 aumentos kDa na presença de níveis reduzidos de proteína de 123 kDa, o que é particularmente evidente no gene homozigótica rato preso células de fibroblasto embrionário ( Figura 4D). A maioria das células de linfoma e TEC também mostraram um aumento da expressão da proteína de 127 KDa (Figura 4D).
Para determinar se as bandas adicionais de peso molecular elevado são formas fosforiladas da proteína DLC1, os lisados celulares foram tratados com alcalino fosfatase. A continuação da presença da banda de 127 kDa após o tratamento fosfatase indica que ele não é uma forma fosforilada de serviços regulares de 123 kDa DLC1 (Figura 4C /i E).
Para identificar a 127 KDa reacções cruzadas de proteínas, imunoprecipitados utilizando os anticorpos DLC1 foram submetidas a espectrometria de massa. Temos sido capazes de identificar 7 peptídeos correspondentes à região de consenso de DLC1 comum a todas as isoformas e, portanto, a espectrometria de massa foi inconclusivo sobre a existência das outras isoformas DLC1 (complementar Figura S1).
A maioria dos as linhas de células de linfoma e TCE igualmente uma elevada expressão da p21
WAF1 proteína em contraste com células de fibroblastos de embrião de ratinho do gene preso homozigóticos onde p21
WAF1 expressão foi diminuída (Figura 5A /I-II). O nível de proteína p21 expressão era comparável em MEF
+ /+ e as linhas de células LT4 e Tec3, que têm tipo selvagem alelos DLC1 No entanto, os genetrap heterozigotos DLC1 alelo contendo linhas e celulares TL 2/3 da célula TEC1 /2 linhas mostraram níveis significativamente mais elevados de expressão da proteína p21, quando comparada com o tipo selvagem correspondente, e linhas celulares de LT4 TEC-3, respectivamente. Em contraste, a linha de TL1 heterozigótica, com a menor expressão DLC1, mostrou expressão de p21 comparável com o tipo selvagem MEF
+ /+ e TEC 4 células. Por conseguinte, a expressão da p21 não se correlaciona com a expressão DLC1 em linhas de células do timo, ao contrário de fibroblastos.
A (i) p21
WAF1 proteínas em linhas de linfoma de células T e de células de carcinoma, (ii) Lote mostrando o intensidade relativa de p21
WAF1 proteínas em linhas de linfoma de células T e de células de carcinoma em relação à actina. As médias e erro padrão da média foram determinadas a partir de, pelo menos, cinco experiências independentes. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, **** P 0,0001). (B) A medição da RhoGTP activo em linhas celulares. (I) RhoGTP puxar para baixo ensaio mostrando os níveis induzidos constitutivos e LPA de RhoGTP ativo no linfoma de célula T e linhas de células de carcinoma epiteliais do timo. (Ii) Plot mostrando a RhoGTP para totalizar relação proteína Rho por digitalizar a intensidade relativa das bandas de proteínas na não-tratada e LPA induzida em TEC, TL, linhas de células MEF. As médias e erro padrão da média determinada a partir de quatro experiências independentes. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 e **** P ., 0001 pelo teste t de Student e teste de ANOVA
Todo o timoma e . linhas celulares de linfoma mostraram vários graus de RhoA activada quando tratados com ácido lisofosfatídico (LPA) (Figura 5B /i-ii) A indução de LPA de RhoA activa foi significativamente maior em duas linfoma (TL-1 -2) e duas linhas de TEC (TEC-1 -2), que também apresentou os menores Dlc uma isoforma 2 níveis, quando comparado com as correspondentes linhas de células de tipo selvagem (Figura 5B /i-ii) Isto era semelhante ao homozigoto DLC1
GT /GT. células, indicando que estas linhas podem ter desativado o alelo selvagem DLC1.
tumores ter activado K-ras2 G12D Mutation
para determinar que os tumores foram devido à ativação de K-ras2
alelo G12D, que extraiu o ARN celular a partir dos tumores primários e linhas celulares tumorais e, em seguida, realizada a análise de mutações pyrosequencing baseado em K-ras2
mutação G12D (Figura 6). Todos os tumores primários mostrou expressão do mutante K- alelo ras2 (Figura 6F). No entanto, a expressão do alelo mutante foi inferior a 50% nos tumores primários, tal como revelado pelo pyrogram, presumivelmente devido à infiltração de células normais (Figura 6D E). Nas linhas de células de tumor do alelo de tipo selvagem e mutante foram expressas em níveis iguais indicando ausência de contaminação de células normais (Figura 6F).
(A) Representação esquemática da estratégia de PCR para amplificar ADNc de K-ras2. (B) sequência K-ras2 mostrando a localização das mutações e os iniciadores pyrosequencing posições relativas. (C) picos de referência do programa mostrando a ordem dispensação e sequência. (D) Um pyrogram de alelo de tipo selvagem K-ras2 mostrando nenhuma mutação, (E) um alelo mutante em uma linha de células de tumor que mostra a presença do mutante assim como o tipo selvagem alelos e (F) do alelo mutante em um micro-dissecadas primária tumor. Na Figura E, a diferença na intensidade relativa entre a base nucleotídica específica de alelos normais e mutantes indica a presença de células normais no tumor.
DLC1 isoforma 2 metilação do promotor em timomas e linfomas
a fim de compreender o mecanismo para a redução da expressão da proteína DLC1 em linhas celulares tumorais, foram estudados o estado de metilação de DLC1 isoforma 2 e 3 promotores pelo tratamento com bissulfito de ADN seguido de PCR e pyrosequencing (Figura 7). Nós identificamos fortes ilhas CpG nos promotores de isoformas DLC1 2 e 3 usando o Metil Primer Expresso Software versão v1.0 (Applied Biosystems) (Figura 7A). Uma análise mais aprofundada destas ilhas CpG usando MatInspector (suite software Genomatix) revelou dois locais adequados para bisulfite sequenciamento perto de um local de ligação promotor SP1 em DLC1 isoforma 2 e 3 promotores. Temos alvo cinco ilhas CpG localizado 502 pb a montante do codão de iniciação para a isoforma 2 e quatro ilhas CpG localizado 851 pb a montante do codão de iniciação da isoforma 3 (Figura 7B). ADN a partir de tumores microdissecados primários, bem como linha de células de tumor derivado de ADN revelou extensa metilação do promotor DLC1 isoforma 2 (30-70%) em todas as 5 ilhas CpG em comparação com ADN de timo normal (Figura 7F). O promotor da isoforma DLC1 3 foi encontrado para ser altamente metilada (40-100%) em tecidos normais e em tumores primários para todas as 4 ilhas CpG analisadas (Figura 7F). A frequência de metilação no tumor primário também combinado com o padrão de metilação observado no ADN da linha celular.
(A) Representação esquemática das ilhas CpG (rosa barra horizontal), o sítio de ligação do promotor Sp1 (barra vertical amarela ), tradução códon de iniciação (barra vertical vermelha perto da extremidade 3 ‘), e as ilhas de CpG selecionados para análise de metilação (escuro barra vertical verde) na região promotora de DLC1 isoformas 2 e 3. (B sequência) DNA ea localização do iniciadores de sequenciação para pyrosequencing (sublinhado vermelho e verde – frente e verso, iniciador de PCR, respectivamente, itálico-sequenciação). (C) a fim Dispensação e pyrogram referência de isoformas 2 (i) e (ii). Pyrogram do normal (D) e do tecido tumoral (E) para as isoformas 2 (i) e 3 (ii). F: Lote mostrando o percentual médio de metilação nos diferentes locais de CpG nas isoformas DLC1 2 e 3 promotores de tumores e timo normal,
Supressão de DLC1 lócus foi relatado para ser responsável pela perda de. a expressão da proteína em diferentes tumores humanos. Portanto, para examinar a perda alélica no locus DLC1, utilizou-se a perda de microssatélite polimórficos base de heterozigosidade análise (LOH) em torno do locus do gene DLC1 (Figura 8). A análise LOH revelou nenhuma perda significativa no locus DLC1 na maioria dos tumores; No entanto, encontrámos tamanho microssatélite alteração para o marcador D8Mit293 em um tumor, bem como a linha celular correspondente ADN (Figura 8C). Descobrimos também perda de heterozigotos D8Mit174 marcador numa lesão pulmonar metastático (Figura 8C).
(A) Representação esquemática da posição relativa dos diferentes marcadores microssatélites utilizadas para a perda de heterozigosidade análise. (B) autorradiografias representativa mostrando os alelos específicos para os diferentes marcadores microssatélites. A seta indica a LOH de um alelo e o asterisco indica alteração de tamanho microssatélites (MA) de um alelo, N-normal, o estado do t-Tumor (C) alelo dos marcadores cromossoma 8qA4 nos tumores do timo e do TCE e linhas de células de LT bem como correspondente tumores primários e metastáticos; RH – Retenção de homozigose. Tumores 1-7 são tumores do timo primárias correspondentes às linhas de células TL e TEC. A subcategoria a e b sob tumor 1-7 representa DNA obtido a partir de duas lesões metastáticas do pulmão independentes do tumor primário correspondente, respectivamente.
A fim de descobrir se a metilação do promotor DLC1 foi responsável pela diminuição a expressão de ARNm e proteína DLC1, que trataram os derivados de tumor linhas de células com um agente de desmetilação de ADN 5′-azacitidina (5 AzaC) e, em seguida, estudou a expressão de ARNm e proteína DLC1. Curiosamente, o tratamento com 5 AzaC aumentou a expressão da isoforma DLC1 2, em comparação com as linhas celulares de tumor de controlo (Figura 4C-/III E). O RT-PCR em multiplex utilizando ADNc derivado a partir de 5 AzaC tratados linhas celulares também mostrou uniformemente uma expressão elevada de isoforma DLC1 2 e 3 ARNm em todas as linhas de células tratadas.
Altered Estrutura citoesqueleto e aumento da motilidade celular em células tumorais
Uma vez que o aumento da actividade de Rho associada com a formação de fibras de stress e a motilidade celular, examinámos a frequência de formação de fibras de stress e de adesão focal nas linhas de células cultivadas e TCE em comparação com as células normais epiteliais do timo. As células tumorais contidas número significativamente maior de fibras de stress (26 ± 11/1000 mm
2) e adesões focais (28 ± 18/1000 mm
2) em comparação com as células normais com 8 ± 9/1000 mm
2 e 7 ± 15/1000? M
2 respectivamente frequência (valor de P 0,0001) (Figura 9). O tamanho médio das células de tumor (8-12 × 10
3? M
2) também foi significativamente maior do que a sua contrapartida normal (6-8 × 10
3? M
2) (valor de p = 0,016). Além disso, as células tumorais apresentaram mais fibras de stress ventrais [20] que, em células normais epiteliais do timo salientar fibras foram organizadas principalmente como arcos transversais [21] (Figura 9 A-C). Observamos, também, fibras de stress organizados em malha triangular como redes abrangente do núcleo na superfície da célula dorsal nas células de timoma (Figura 9C).
(A) do timo de células epiteliais que mostra a formação de fibras de tensão normal na forma de um arco transversal anelar. (B) de células epiteliais de carcinoma tímico (Z pilha-1) que mostra extensa formação de fibras de stress ventral e aumento da frequência de adesões focais, (C) a mesma célula de tumor que mostra uma organização estrutural diferente de vinculina e actina em pilha Z -7 sobre o dorso superfície da célula. (D) mancha de Western mostrando a expressão transiente de DLC1 isoforma 2 3 proteínas marcadas com GFP C terminal na linhagem de células do TCE. células de carcinoma epiteliais do timo transfectadas com (E) pEGFP C1 vetor, (F) DLC1 isoforma 2 GFP construir; (L) DLC1 isoforma 3 GFP. diagrama (H) Bar representando o número relativo de células que estão mostrando neurite como extensões expressa em percentagem de células que expressam GFP transgene totais.
As fibras de stress foram abolidas quando as células do TCE foram transfectadas com GFP marcado comprimento total DLC1 isoforma 2 (Figura 9E-G). A expressão das proteínas de fusão GFP-DLC1 também foram verificados num Western blot utilizando anticorpo anti GFP (Figura 9D). A proteína de fusão GFP-DLC1 isoforma 2 foi encontrada localizada para adesões focais (Figura 9F). Nós também ter notado que as células do tumor mostrou a formação profusa de “neurite como” extensão citoplasmática ou estruturas filipodial juntamente com destruição do conjunto de fibras stress quando transfectadas com GFP marcado DLC1 isoforma 3 (Figura 9H). Todas as células transfectadas DLC1, eventualmente morreram 3-4 dias após a transfecção.
Para determinar se as células T-linfoma com níveis mais baixos DLC1 mostraram um aumento da migração e extravasamento, um ensaio de migração transendothalial foi realizado (Figura 10). A taxa de invasão das células de linfoma T foram encontrados significativamente mais elevado em linha celular de linfoma de 1 e 2 em comparação com o sangue periférico normal (PBL) derivada de linha de células T (valor de p = 0,0007 e 0,021, respectivamente, Figura 10C). No entanto, as restantes linhas celulares 2 de linfoma, com comparativamente maior expressão DLC1, não apresentaram diferenças significativas na invasão (p valor = 0,068). Todas as linhas celulares de linfoma também mostraram significativamente maior taxa de estrutura conduzindo pseudopodal vantagem quando comparado com as células T normais (PBL valor de P 0,04) (Figura 10D). O aumento da formação de borda levando pseudópode e migração transendotelial na linha celular de linfoma 1 e 2 combinados com o aumento da metástase na coorte de ratos correspondente (Figura 3).
(A) Descrito são duas células TL que tinham invadido entre a endotelial células. As células LT foram coradas com anticorpos anti-CD3 específicos de marcadores do receptor de células T e as células endoteliais foram coradas com DAPI e TRITC-faloidina. O painel superior mostra imagens Z pilha representativos da fatia superior (acima das células endoteliais) e a seta indica a formação pseudopod (B) ensaio de migração transendotelial de células de linfoma T. Reconstrução tridimensional, mostrando duas células TL que tinham invadido a monocamada endotelial confluentes. Z empilhados imagens tiradas em intervalos de 0,5 m foram usados para a reconstrução da imagem 3D. (C) A percentagem de trans-endotelial migrado linhas de células T-linfoma. A média eo desvio-padrão são mostrados por 5 experimentos (D) Percentagem de células que mostraram uma estrutura de ponta pseudopod sob as células bEnd.3. A média e o erro padrão da média são mostrados para 4 experiências, em que mais do que 200 células foram analisadas por experiência. (* P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001 e **** P 0,0001 por teste t de Student).
Discussão
A gene DLC1 como outros genes supressores de tumores, por exemplo TP53, a APC e BRCA1, utiliza promotores alternativos para produzir, pelo menos, três isoformas de corpo inteiro em ratinhos [22] – [25]. Existe uma evidência crescente de utilização selectiva de promotores alternativos, que regula a transcrição diferencial, pode estar envolvido na iniciação e progressão do cancro [26]. A utilização aberrante de um promotor sobre a outra em genes, tais como TGFB3, LEF1 e CYP19A1, está directamente ligada ao crescimento celular canceroso (revisto em [26]). Os promotores alternativos utilizados pelo gene DLC1 são evolutivamente conservadas e comum entre os outros membros da família DLC [27], [28]. O gene DLC1 tem três principais transcritos alternativos que foram previamente descritos como 7,4, 6,1 e 6,2 Kb transcrição por Sabbir et ai. [8]. Estas isoformas foram designados como isoforma 1, 2 e 3, respectivamente, no navegador UCSC Genome no rato de Julho de 2007 (NCBI37 /MM9) Assembly. Para esta discussão, vamos usar a nomenclatura UCSC das isoformas. Anteriormente, foi demonstrado que todas as três isoformas de transcrição de gene DLC1 são expressas em graus variados em diferentes tecidos de ratinho, mas o seu papel na tumorigénese indivíduo é ainda desconhecido [8]. A expressão espaço-temporal das isoformas DLC1 humanos equivalentes ao rato DLC1 ainda está faltando. Recentemente, Low et al. identificaram um novo DLC1 isoforma 4 em seres humanos, o que corresponde a 3 a isoforma DLC1 no ratinho e que foi encontrado em várias linhas silenciados por hipermetilação do promotor de carcinoma [29]. O mouse genetrap que temos utilizado em nosso estudo foi previamente mostrado para interceptar DLC1 isoforma 2 e reduz a sua expressão, mas, não isoformas 1 e 3 [8]. O promotor isoforma 3 mostrou um elevado grau de metilação constitutiva em tecido do timo normal e células tumorais do timo. Ambos estes tipos de células ainda apresentaram expressão da isoforma 3 ARNm. Alta metilação do promotor DLC1 com a expressão contínua do gene também tem sido relatado para dois isoforma no linfoma canina [30]. Estes resultados indicam que o estado de metilação por si só pode não ser suficiente para prever a expressão da isoforma 3 DLC1, pelo menos no timo e linfócitos T. Estes resultados também sugerem que a perda seleccionado de DLC1 isoforma 2 de expressão pode ser suficiente para a progressão do tumor.
O genetrap DLC1 sozinho não é capaz de induzir tumores no entanto, na presença de K-ras2
mutação G12D, aumenta frequências de tumores e metástases em comparação com K-ras2
mutação G12D apenas ratos, indicando um efeito aditivo. O K-ras2
rato G12D condicional utilizada neste estudo foi previamente relatado para desenvolver adenocarcinoma no pulmão após a entrega intranasal de vírus AdenoCre [17]. Um outro modelo de ratinho transgénico, LA1-K-ras2, em que o K-ras2
alelo G12D pode ser activada por um acontecimento de recombinação intracromossómica somática, mostrou elevada incidência de tumores do pulmão, mas, também uma incidência de 30% de linfoma do timo e outros tumores tipos [31]. Em nosso estudo, encontramos tumores predominantemente do timo, juntamente com lesões neoplásicas em muitos outros órgãos utilizando injecção na veia da cauda de AdenoCre. Estudos anteriores demonstraram que a injecção na veia da cauda de AdenoCre principalmente como alvo o fígado, o baço e os rins e para prolongar a um timo, coração e pulmão de tecido [32], [33].
A frequência global menor de lesões neoplásicas e tumores do timo foi significativamente maior em ratos KD sugerindo que aprisionando DLC1 isoforma 2 pode ter proporcionado uma vantagem para a iniciação da tumorigénese. O KD ratinhos também mostraram uma redução significativa na sobrevivência global. O aumento nas metástases de linfoma nos pulmões dos ratinhos KD pode ser a causa de sobrevivência reduzido nestes ratinhos.