Abstract

perda de peso involuntária em pacientes com câncer é a marca da caquexia associada ao câncer. A etiologia da caquexia é multifatorial que envolve a perda de músculo esquelético e tecido adiposo associado a altos níveis sistêmicos de proteínas de fase aguda e citocinas inflamatórias. Enquanto perda de massa muscular impactos abertamente sobre o câncer da qualidade de vida do paciente, perda de depósitos lipídicos representa um desequilíbrio energético sustentado. Neste estudo de depleção de gordura foi examinada em Colon-26 modelo de caquexia do cancro, que é um modelo de roedor amplamente utilizado desta síndroma. Nós investigamos a expressão diurna de reguladores do ritmo circadiano, bem como os principais mediadores do metabolismo energético e sinalização de citocinas. Os ratinhos portadores do tumor C26 apresentaram redução da massa adiposa, elevado a lipólise do tecido adiposo e um aumento de 5 vezes nos níveis de plasma de ácidos gordos livres. Estas alterações foram associadas a IL-6 activado sinalização em WAT através de um aumento de 3 vezes na STAT3 fosforilado e os níveis de expressão de genes de alta SOCS3. Em perturbações de adição na regulação circadiana do metabolismo lipídico também foram observados. Lipid catabolismo não pareceu ser influenciado pela via clássica de activação de PKA do HSL lipase. os níveis de proteína foram elevados ATGL duas vezes em ratinhos caquéticos, enquanto que o aumento de 4 vezes fosforilada ACC e um decréscimo de 2 vezes na 4EBP1 fosforilado foi observada indicando que o metabolismo dos lípidos é modulada pela ATGL vias AMPK /mTOR. Este estudo fornece evidência para a ativação da sinalização da citocina e alterações concomitantes no ritmo circadiano e reguladores do metabolismo lipídico em WAT de animais caquéticos

Citation:. Tsoli M, Schweiger M, Vanniasinghe AS, Painter A, Zechner R, Clarke S, et al. (2014) Exaustão de White tecido adiposo em Câncer A caquexia síndrome está associada com sinalização inflamatória e interrompeu regulação circadiana. PLoS ONE 9 (3): e92966. doi: 10.1371 /journal.pone.0092966

editor: Harpal Singh Randeva, da Universidade de Warwick – Medical School, Reino Unido

Recebido: 29 de outubro de 2013; Aceito: 27 de fevereiro de 2014; Publicação: 25 de março de 2014

Direitos de autor: © 2014 Tsoli et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa programa translacional cancer Institute NSW para o cancro colorectal. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Colon caquéticos 26 células foram gentilmente cedidas pela Amgen. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

síndrome de caquexia Câncer (CCS) é freqüentemente experimentado por pacientes com câncer avançado sendo mais prevalente na pancreáticas, gastrointestinal superior e pulmão e é responsável por quase 20% de morbidades relacionadas ao câncer [1], [2]. Actualmente não existem tratamentos eficazes ou testes de prognóstico para indicar os pacientes em risco de desenvolver caquexia. CCS é uma doença metabólica caracterizada por complexo perda involuntária de peso, tecido adiposo e exaustão muscular esquelético, anorexia e fadiga. Caquexia é frequentemente associada com inflamação sistêmica indicado pelo CRP plasma elevada e níveis reduzidos de albumina [3]. Além pacientes com câncer caquéticos muitas vezes experimentam aumento da toxicidade durante a quimioterapia /radioterapia com prejuízo para a qualidade de vida e subsequente sobrevivência pobres [4], [5]. Embora o mecanismo exacto ainda está para ser totalmente elucidada, é amplamente aceite que o aumento dos níveis de citocinas, tais como interleucina-6 (IL-6), factor de necrose tumoral (TNF) e outros factores, tais como zinco-alfa2-glicoproteína (ZAG) disparar os eventos catabólicos que promovem a depleção de lípidos de depósitos de gordura e astenia [6], [7], [8]. Em particular, a IL-6 tem sido implicada no desenvolvimento da caquexia em modelos de roedores portador de tumor e perda de tecido adiposo em doentes com cancro [9], [10], bem como directamente estimular a lipólise nos adultos [11]. A-26 do cólon (C26) o carcinoma é um modelo murino bem estabelecido de caquexia do cancro, resultando em elevados níveis sistémicos de IL-6. A administração de agentes que inibem a IL-6 sinalização evitar desperdício e outras características da caquexia em vários modelos animais de caquexia, incluindo Colon 26 [12], [13], [14].

Além de atuar como um isolante e lípido reservatório durante períodos de demanda metabólica, o papel de tecido adiposo branco (WAT) estende-se a neuroendócrinos controle da homeostase energética, apetite e respostas imunitárias /inflamatórias. Enquanto a mobilização de lípidos dos adipócitos para fornecer energia a outros órgãos durante o jejum /restrição calórica é a função primária de WAT, que também está envolvida na secreção de adipocinas e citocinas, com muitos adipocitoquinas exibindo variações diurnas no plasma que podem influenciar o apetite, energia despesas e reprodução [15]. Por outro lado órgãos distais controlar lipolítica vs vias lipogênicas em WAT via hormônios e citocinas para regular vias metabólicas lipídico e, assim, alcançar o equilíbrio energético do corpo inteiro. Portanto perda de massa WAT ​​durante o desenvolvimento da caquexia teria impacto sobre múltiplos sistemas orgânicos além disposição prejudicada de lípidos ricos em energia.

A secreção ea actividade dos reguladores diurnas do metabolismo estão ligados a próprio relógio endógeno do corpo para combinar nutrientes alimentação com ciclos de atividade e sugestões ambientais [16]. controle central do ritmo circadiano é mediada pelo núcleo supraquiasmático em que um mecanismo de feedback molecular regulada automaticamente envolvendo os reguladores BMAL /relógio e proteínas-alvo Per /Cry opera a exercer regulação neural em funções de relógio em órgãos periféricos. Um loop de feedback adicional envolve o receptor nuclear Rev-erbα, que também desempenha um papel essencial na adipogênese. A análise molecular de WAT descobriram que ~ 20% do transcriptoma adiposo exibe um padrão de expressão rítmica diurna [17]. Na verdade, muitos factores de transcrição nucleares, tais como os receptores de peroxissoma activados pelo proliferador (PPAR), bem como o regulador da homeostase de energia chave AMP activada proteína quinase (AMPK) e enzimas metabólicas (lipoproteína lipase-LPL) exibem perfis oscilatórios indicando interacções complexas entre circadiano relógio, balanço energético e estímulos ambientais [18]. desregulação circadiano está associado a maior risco de síndrome metabólica que inclui obesidade, resistência à insulina e doença cardiovascular [19], [20]. modelos de rato geneticamente manipulados componentes do relógio circadiano Bmal ou recursos de exibição do relógio de fenótipos da síndrome-como metabólicas ou magreza, respectivamente [21], [22]. Além disso, estudos clínicos têm demonstrado aumento do risco de obesidade e suas comorbidades em night-shift e trabalhadores jet-lag [20], [23].

Estudos anteriores descobriram que o tecido adiposo branco é um dos primeiros órgãos a ser afectada durante caquexia do cancro com depleção WAT frequentemente evidente na ausência de perda de massa corporal magra evidente [9]. A perda de tecido adiposo é mediada predominantemente pela lipólise aumentada associada com um estado de hipermetabolismo e até certo ponto reduzida deposição de gordura [24], [25], [26]. A mobilização de reservas lipídicas no tecido adiposo durante a caquexia é mediada pelo tecido adiposo lipase de triglicéridos (ATGL) e hormônio de lipase sensível (HSL) [24]. O papel fundamental que ATGL desempenha na caquexia do cancro foi realçado por não só a conservação de massa de gordura, mas também a ausência de perda de massa muscular do esqueleto, em ratinhos deficientes ATGL com carcinoma de Lewis do pulmão de indução de caquexia ou melanomas B16 [24]. Enquanto estes estudos estender a nossa compreensão da contribuição destas lipases fazer a integridade do tecido adiposo em cancro, bem como outros estados metabólicos [27], o mecanismo de sinalização que inicia a depleção de gordura na caquexia permanece pouco compreendido [28], [29]. Várias perguntas permanecem sem resposta no que diz respeito às características hipermetabólicas – especialmente aumento da lipólise – aparentes na caquexia associada ao câncer. Quais são as relações entre a lipólise aumentada e inflamação sistêmica associada a caquexia associada ao câncer? É aumentada de citocinas sinalização operatório durante a depleção de tecido adiposo? Como é a expressão diurno de master reguladores de ritmo circadiano eo metabolismo lipídico afectados durante caquexia associada ao câncer? São os níveis diurnos normais de sensores-chave e mediadores do estado nutricional eo metabolismo lipídico alterado em WAT?

Neste estudo investigou o impacto da caquéticos cólon-26 Carcinoma no adipócito branco ritmicidade e função diurna. Este modelo murino de caquexia do cancro tem sido amplamente utilizado para estudar a caquexia, uma vez que apresenta deficiências funcionais e metabólicas semelhantes para a condição clínica [30]. Foram caracterizados especificamente a expressão diurna de genes importantes para o controlo do ritmo circadiano e o metabolismo lipídico, assim como do estado de activação dos principais reguladores da homeostase energética em dois pontos de tempo opostas no ciclo diurno. Mostramos evidência de citocina por meio de componentes de a de IL-6 cascata de sinalização – STAT3 e SOCS3. Além disso, relatam que a estimulação da via lipolítica em WAT de camundongos caquéticos está associada ao aumento ATGL e perilipin em vez de via PKA /HSL. Nossos dados identifica potencial de cross-talk entre AMPK, mTOR e 4EBP1 como importantes mediadores do metabolismo lipídico alterado em caquexia associada ao câncer.

Materiais e Métodos

Cultura celular e estudos animais

as 26 células de indução de caquexia Colon (C26) é um adenocarcinoma de cólon murino e foram gentilmente cedidas como um presente pela Amgen (EUA) [31]. C26 células foram cultivadas e mantidas em meio RPMI (Invitrogen) contendo 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen) e 100 ug /ml de penicilina /estreptomicina (Invitrogen) numa co 5%

2 ambiente. isentos de organismos patogénicos, macho de 10-12 semanas de idade BALB /c * DBA2 (híbrido F1) murganhos foram adquiridos a partir de ARC, Perth (Austrália), e mantida a uma temperatura ambiente de 22 ° C sob um ciclo de luz de 12 horas (luzes acesas 06h00 – 18:00). 26 células de cólon foram inoculados subcutaneamente em 1 × 10

6 células /100 uL no flanco direito de ratinhos. Os ratinhos de controlo foram injectados com 100 uL de meio RPMI contendo antibióticos. Durante um período de 14 dias após a inoculação, peso corporal, ingestão de alimentos e tumorais dimensões foram registrados diariamente. Tumor-rolamento e os ratos de controle livre de Fed

ad libitum

acesso aos alimentos. Um grupo de ratos de controlo foi alimentado par para coincidir com a ingestão diária de alimentos do grupo C26-rolamento caquético. Par-alimentação foi conseguido dando não portadores de tumor ratinhos de controlo da ingestão de alimentos de C26-portadores de tumores animais correspondente. Os ratinhos foram euthanazed por deslocamento cervical antes de colheita tecidos adiposo epididimal que foram rapidamente congelados em azoto líquido. A experimentação animal foi realizada de acordo com o Código australiano de Prática para o Cuidado e Utilização de animais para fins científicos ao abrigo do regulamento de Pesquisa Animal (2005) de NSW. O impacto do crescimento e desenvolvimento da caquexia em bem-estar animal do tumor foram considerados, com medidas adequadas para monitorizar e aliviar o sofrimento implementado, sob o protocolo nº 2007/006 aprovado pelo Comitê de Serviço de Saúde Sydney South-West Área Animal Welfare.

Avaliação da caquexia e análise bioquímica

Catorze dias após a inoculação das células tumorais, os ratos foram anestesiados com cetamina /xilazina e euthanazed após a recolha de sangue por punção cardíaca. O peso líquido das carcaças foi medido. gordura epididimal foram recolhidos, pesados ​​e a seguir armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Alíquotas de plasma obtidas a partir de sangue de cada rato foram mantidas congeladas até análise posterior. O conteúdo não esterificado de ácido gordo no plasma de animais caquéticos foi determinada enzimaticamente utilizando o kit NEFA C (Wako Pure Chemicals /Novachem, Collingwood, VIC, Austrália). O teor de triglicéridos no plasma de indução de caquexia animais C26-rolamento foi determinada utilizando o analisador clínico Automater (Roche modular E170) seguindo as instruções do fabricante (Roche).

Tecido Adiposo Histologia e Microscopia

WAT amostras foram fixadas em formalina a 10% tamponada neutra a solução (Sigma-Aldrich), embebido em cera de parafina, e 5 uM secções cortadas e montadas em lâminas de vidro. Após a desidratação, os cortes foram corados com hematoxilina-eosina (H /E) para exame histológico por microscopia óptica e software grade CAST (Olympus Corp., Albertslund, Dinamarca). A análise morfológica foi realizada tecido obtido a partir de 4 animais por grupo (controle, ratos e par-fed C26-rolamento). área de superfície e do perímetro foram estimadas de cerca de 5-8 diferentes campos de visão por imagem que dá um total de dar 250 por ie animais 1000 adipócitos por grupo experimental.

lipólise das Culturas órgão isolado WAT

gonadais almofadas de gordura foram cirurgicamente removidos e lavados várias vezes com PBS. pedaços de tecido (-15 mg) foram pré-incubadas durante 2 h em DMEM, na presença ou na ausência de 25 uM Hi-76-0079 (Novo Nordisk) em C37 ° C, 5% de CO

2, 95% atmosfera humidificada. A partir daí, o meio foi substituído por DMEM contendo 2% de BSA (isento de ácidos gordos), quer na presença ou na ausência de forscolina 10 uM e 25 uM Hi-76-0079 e incubou-se durante mais 60 minutos a 37 ° C. As aliquotas do meio foram removidas e analisadas para o conteúdo de glicerol e FFA utilizando kits comerciais (HR Série NEFA-RH (2), WAKO Diagnostics). Para as determinações de proteína, almofadas de gordura foram extensamente lavadas com PBS e lisadas em NaOH 0,3 N /SDS a 0,1%. medições de proteína foram realizadas utilizando o reagente BCA (Pierce).

Análise quantitativa PCR em Tempo Real

O ARN total foi isolado utilizando Trizol (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado a partir de ARN total utilizando SuperScript III com iniciadores aleatórios (Invitrogen) e oligo (dT) 12-14 (Invitrogen). Todas as sequências de iniciadores foram explodido no banco de dados sequência genómica do rato NCBI para garantir a especificidade para o gene correspondente. As sequências dos iniciadores são fornecidos na Tabela S1. reacções qPCR continha 1,25 ng de ADNc, 300 os iniciadores específicos do gene nM e 12 ul SybrGreen (Invitrogen). Todas as reacções foram realizadas utilizando o Corbett Rotor Gene 6000 (Corbett Life Science). níveis de mRNA relativos foram calculados pelo método de ciclo limite comparativa usando

36B4

,

TFRC

e

HMBS

genes como os controles de limpeza.

Western Blotting

extractos de células completas a partir tecidos adiposos foram obtidos utilizando um tampão de lise RIPA suplementado com inibidores de fosfatase e protease (Roche) utilizando um homogeneizador de vidro e concentrou-se com unidades de filtro de centrífuga de acordo com os protocolos do fabricante (Cell Signaling Technologies, Millipore) e foram subsequentemente quantificados pelo kit de ensaio de proteína BCA ácido (Pierce). Proteínas (20 ug) foram resolvidas em géis de 10% Tris-HCl (Bio-Rad), e colocados a hibridar (iBlot, Invitrogen) tal como descrito pelos fabricantes. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​com os seguintes anticorpos primários: anticorpo de coelho anti-fosfo-p44 /42-mitogen-activated protein kinase (MAPK) -Thr202 /Tyr204, coelho anti-p44 /42 MAPK-, coelho anti-fosfo-MAPK p38-Thr180 /Tyr182, MAPK coelho anti-p38, transdutor de sinal anti-coelho e ativador de transcrição 3 (STAT3), de coelho anti-fosfo-STAT3-Ser727, coelho anti-ATGL coelho anti-hormonal sensitive- lipase (HSL), anti coelho fosfo-HSL-Ser563, coelho anti-acetil-CoA carboxilase (ACC), de coelho anti-perilipin, coelho-AMP-activated anti α da proteína quinase (AMPKα), de coelho anti-fosfo-AMPKα-Thr172, coelho anti-raptor , alvo de coelho anti-da rapamicina em mamíferos (mTOR), de coelho anti-fosfo-mTOR-Ser2481, coelho anti-eucariótica fator de iniciação da tradução de proteínas 4E de ligação 1 (4EBP1), de coelho anti fosfo-4EBP1-Thr37-/46, anti coelho fosfo-4EBP1-Thr70, coelho anti-fosfo-4EBP1-Ser65, coelho desidrogenase anti-3-hidroxiacil CoA (EHHADH /PBE) e coelho anti-beta actina. Todos os anticorpos primários anti-fosfo foram diluídas 1:500 enquanto os restantes anticorpos foram diluídos 1:1000. As proteínas foram visualizadas utilizando o anticorpo de cabra anti-coelho-HRP secundário (1:2000) e kit de femto-oeste (Pierce). Além de EHHADH (Abcam) o resto dos anticorpos foram obtidas a partir de Cell Signaling Technology.

Análise estatística

Os dados são apresentados como média ± S.E.M. As análises estatísticas foram realizadas com o teste t de Student não pareado. Análise entre os 3 grupos (controle, cólon-26 e par-fed) foi realizada utilizando o One-way Anova Post Hoc Turquia. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a P . 0,05

Resultados

Impacto do C26 Carcinoma no Epidydimal Branco tecido adiposo

O carcinoma Colon26 é um modelo bem estabelecido de caquexia associada ao câncer em ratinhos que exibem uma perda significativa de peso, perda de massa muscular, depleção de gordura e diminuição gradual da ingestão de alimentos de 14 dias após o implante do tumor. De acordo com relatórios anteriores, a massa de WAT epididymal foi consideravelmente reduzido em comparação aos controles livres alimentados e alimentados-par (Figura 1A). Nós examinar se essa redução dramática na massa de tecido adiposo era aparente no nível microscópico. Hematoxilina /eosina mostrou alterações morfológicas significativas. adipócitos brancos a partir de ratinhos de controlo exibida vacúolos lipídicos hexagonal individuais que eram menores nos animais alimentados com pares e apareceram mais esférica em ratinhos caquéticos (Figura 1B-D). A análise morfométrica mostrou ainda uma diminuição significativa na área de secção eo perímetro de adipócitos brancos de ratos caquéticos C26 em comparação com

ad lib controle camundongos portadores de tumor não-par-fed Comprar e (Figura 1E-1F). A redução no peso WAT foi acompanhado por um aumento em ácidos gordos não esterificados no plasma (NEFA) em ratos caquéticos (Figura 1G) e uma diminuição dos níveis de triglicéridos no plasma (Figura 1H). Para examinar a contribuição de lipases para a mobilização de triglicerídeos do tecido adiposo, determinou-se a actividade de mobilização de lipídios de explantes Wat. A taxa de libertação de ácidos gordos livres (FFA) foi 5 vezes superior em WAT de ratinhos C26 caquéticos, em comparação com ratinhos de controlo que não produz tumorais (Figura 1-I) com um aumento correspondente na libertação de glicerol (Figura 1J). A adição do inibidor específico da HSL (Oi 76-0079) apenas marginalmente reduzida libertação de FFA indicando que ATGL é a lipase predominante responsável pela lipólise do tecido adiposo (Figura 1I). Para avaliar o impacto de caquexia na capacidade hidrolítica lípido total após a estimulação hormonal, WAT tecido foi tratado com forscolina. Um novo aumento na liberação de AGL foi evidente para ambos os ratinhos controlo e C26 caquéticos, com camundongos caquéticos atingiram uma taxa máxima de produção de FFA de /hr * proteína de 250 nmol mg em comparação com 100 nmol /h * mg em ratinhos de controlo (Fig. 1K) . liberação de glicerol também mostrou uma taxa máxima mais elevada em C26 contra ratos de controle após a estimulação de explantes WAT com forscolina (Figura 1D), indicando uma capacidade lipolítica mais elevada de explantes WAT de camundongos caquéticos C26.

pesos tecido adiposo (A) Epidídimo de animais caquéticos no dia 14 após a inoculação do tumor (

*** P 0,001,

¥¥¥ P 0,001 vs par-alimentados); (C-E) Hematoxilina-eosina e (B-F) quantificação do tamanho dos adipócitos a partir caquéticos e ratos alimentados com pares. (G) os níveis circulantes de ácidos gordos não esterificados livre no plasma de animais caquéticos (* P 0,05; vs controlo); (H, I) de ácido gordo livre (FFA) e a libertação de glicerol a partir de explantes WAT obtidos a partir de murganhos portadores de tumores de controlo e de C26 sob condições basais na presença e na ausência do inibidor de HSL Oi 76-0079; (J, K) ácido gordo livre (FFA) e a libertação de glicerol a partir de explantes WAT sob condições estimulada por forscolina na presença ou na ausência de Oi- 76-0079. Para A, os valores são apresentados como média ± S.E.M. para 8-10 animais por grupo. Para B, C e D imagens representativas são mostradas a partir de H E de imagens obtidos a partir de 4 animais por grupo. Para os valores de E e F são apresentados como média ± S.E.M. quanto para 4 animais por grupo. Aproximadamente 250 adipócitos foram contadas por doação de animais no total de 1000 adipócitos de cada grupo. valores G e H estão apresentados como média ± S.E.M. para 4 animais por grupo. Para valores de I-K estão apresentados como média ± S.E.M. para 5 animais por grupo.

Ativação da IL-6 via de sinalização em C26 caquexia

As citocinas como IL-6 parecem ser os principais elementos do processo de perda de massa neste caquexia associada ao câncer modelo [12]. Para determinar se a sinalização de citocina activa está presente nos adipócitos a partir de ratinhos caquéticos foi investigada a expressão de ARNm diurna SOCS3, e a fosforilação da STAT3 (Figura 2). níveis de transcrição de mRNA SOCS3 foram significativamente aumentados em todos os momentos em camundongos caquéticos. Há também foi melhorada a fosforilação da proteína STAT3 (Ser727) na presença do tumor C26. Estes dados demonstram activa a sinalização a jusante do receptor de IL-6 em ratinhos de WAT caquéticos que podem influenciar as vias metabólicas de lípidos em murganhos com caquexia.

expressão de ARNm diurno de ARNm SOCS3 no tecido adiposo branco a partir de ratinhos de controlo (círculos a branco) e camundongos caquéticos (quadrado preto) (

* P 0,05,

** P 0,01,

*** P 0,001 vs controle). 6 valores am são duplicados no gráfico para ilustrar ritmicidade diurna. valores de expressão de ARNm são média ± S.E.M. em relação aos controlos de 4-6 animais por grupo. Western blot e análise densitométrica de proteína STAT3 e fosfo-STAT3 (Ser727), no tecido adiposo branco de caquéticos e de controlo animais.

Effect of Cancer A caquexia no padrão de expressão diurno de Lipogênese Pathway

Para analisar o impacto da caquexia associada ao câncer em

de novo

síntese de ácidos graxos no WAT investigamos o perfil de expressão diurno de genes metabólicos e fatores de transcrição nucleares envolvidos na lipogênese. Lipoproteína lipase (LPL) é uma enzima chave envolvida no TG hidrólise de lipoproteínas para libertar os ácidos gordos para a absorção em células. Em ratinhos de controlo os níveis de transcritos não exibiram ritmo diurno enquanto que em ratos caquéticos níveis de expressão foram significativamente atenuada na maioria dos pontos de tempo (Figura 3). Juntamente com

LPL

, a expressão de

Ap2

foi reduzida, enquanto

CD36

não foi alterada em WAT de camundongos caquéticos indicando algum grau de repressão na captação ou manuseio intracelular de gordo ácidos (Figura S1). PPAR é o factor de transcrição nuclear predominante regulação do metabolismo lipídico em adipócitos. Em camundongos de controle,

PPAR

e de destino associada genes

Fas

e

Dgat2

atingiu o pico durante o ciclo de luz, enquanto nos animais caquéticos ritmicidade portador de tumor estava perdido e níveis de mRNA eram marcadamente diminuída na maioria dos pontos de tempo. Similarmente

SCD1

exibiram expressão de ARNm reduzida em ratinhos com caquexia. C /EBPα é importante para a adipogênese e função dos adipócitos normal. Em ratinhos de controlo

C /ebpα

não exibiram um padrão de expressão diurno enquanto em ratinhos caquéticos níveis de transcrição foram significativamente reduzida ao longo do dia. comparações Curiosamente diretos nos níveis de expressão do gene de

Fas

e

C /ebpα

entre ratos alimentados com pares e camundongos caquéticos indicaram diferença significativa a ponto de tempo 02:00, indicando que a síntese de lipídios pode ser afetada, principalmente, durante a caquexia e não tanto durante a restrição calórica.

análise de mRNA de

PPAR

,

C /ebpα

,

LPL

,

Fas

,

SCD1

,

Dgat2

, isolado do WAT do controle (círculo branco) e camundongos C26-rolamentos (quadrado preto); Os valores são a média ± S.E.M. apresentados como percentagens em relação aos controlos durante 4-5 animais por grupo (* P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001 vs controlo C26). 6 valores am são duplicados em cada gráfico para ilustrar uma completa ciclo de 24 h.

Pathway Lipolytic induzida PKA não é reforçada no cancro da caquexia

A estimulação da liberação FFA de triglicéridos foi pensado para ser mediada principalmente por via da proteína quinase a (PKA), que fosforila diretamente lipase sensível perilipin e hormonal (HSL) e também influencia adiposo lipase de triglicéridos (ATGL), ainda que indirectamente. No entanto, estudos recentes identificaram fosforilação mediada por AMPK de ATGL e interacções com CGI-58 como crucial para a actividade máxima de hidrolase ATGL [27]. Foi avaliado se a lipólise é mediada através da via PKA durante esgotamento de Wat em caquexia associada ao câncer. Como mostrado na figura 4A, observou-se uma ligeira diminuição da fosforilada PKA e os níveis totais de PKA às 2 da manhã, enquanto em 14:00 sem alterações aparentes foram observadas entre o controle e os animais caquéticos (Figura S2). Os níveis de expressão de mRNA apareceu reduzida, enquanto os níveis de proteína total e fosfo-HSL ficaram inalterados em qualquer ponto do tempo durante a caquexia associada ao câncer. Curiosamente, a nível de expressão gênica não foram observadas alterações significativas entre o controle e os ratos alimentados com par (Figura S3), enquanto que ao nível da proteína, observamos aumento da fosforilação em ambos os PKA e HSL às 2 da manhã (Figura S3). Perilipin é uma proteína de revestimento lipídico crucial para a formação de gotículas de gordura e é directamente influenciado pela PKA. Investigou-se se a caquexia do cancro influenciada os níveis de mRNA e proteína de perilipin e não encontrou ritmo diurno aparente nos níveis de transcrição de perilipin em ratinhos de controlo, enquanto que a expressão foi reduzido em animais de caquexia (Figura 4B). No entanto análise de Western apresentaram níveis aumentados de proteínas perilipin em ambos os pontos de tempo (Figura 4C, Figura S2). ATGL é a lipase crítico que inicia o primeiro passo para a degradação de triglicéridos. Não se observou ritmicidade circadiana na expressão deste gene e não houve impacto sobre ARNm ATGL durante caquexia do cancro. No entanto, análise de Western revelou aumento do nível de proteína ATGL para ambos os pontos de tempo em WAT de animais portadores de tumores C26 (Figura 4, Figura S2). Semelhante à aparente discordância em proteínas perilipin e os níveis de ARNm, parece que é predominantemente ATGL regulada a um nível pós-transcricional em caquexia. Estes dados indicam que, durante a fase tardia da caquexia, a mobilização de gordura a partir de ratinhos C26 WAT não é induzida pela via PKA para estimular a lipólise mediada por HSL, mas está associada com o aumento da proteína ATGL.

(A) análise de ARNm

Hsl

expressão de genes e análise Western blot de fosfo-PKA (Thr197), o total de PKA, fosfo-HSL e proteínas totais HSL em 02:00 e 14:00; (B) Análise de mRNA de

ATGL

e

perilipin

expressão do gene de Wat do controle (círculo branco), e ratos portadores de tumores C26 (quadrado preto); Os valores são a média ± S.E.M. apresentados como percentagens em relação aos controlos durante 4-5 animais por grupo (* P 0,05; ** P 0,01; *** P 0,001, C26 vs controlo). 6 valores am são duplicados em cada gráfico para ilustrar uma completa ciclo de 24 h; (C) Análise de Western blot de ATGL e proteínas perilipin às 2 pm e 2:00.

expressão diurna Perturbada da via de utilização de ácidos graxos em camundongos caquéticos.

Uma função importante da WAT é o consumo de lípido através da activação do ácido gordo β-oxidação na mitocôndria e peroxissomas. Para compreender o papel de WAT na geração de ácidos gordos livres como fonte de combustível durante a caquexia do cancro, foi investigada a expressão diurna de factores de transcrição envolvidos na regulação do catabolismo de ácido gordo e genes alvo correspondente (Figura 5A). De acordo com relatórios anteriores,

PPARa

exibiu oscilação circadiano, enquanto

PPARô

não apresentou ritmicidade em camundongos de controle. Não houve alteração significativa aparente para qualquer um

PPARa

ou

PPARô

entre controle e ratos caquéticos. Do mesmo modo

Pgc1α

tinha um padrão diurno distintivo de expressão, mas permaneceu inalterada em WAT de camundongos caquéticos.

Nrf1

, um regulador chave de genes metabólicos envolvidos na respiração mitocondrial, não apresentou oscilação circadiana, no entanto, foi significativamente aumentada em determinados momentos durante o período de 24 horas. TFAM é um regulador mestre da biogênese mitocondrial. Seus níveis de transcrição não apresentam ritmicidade e mudanças significativas não foram evidentes durante a caquexia associada ao câncer. Da mesma forma que

TFAM

, expressão da carnitina palmitoil transferase 1α (

Cpt1α)

necessário para a absorção de ácidos graxos de cadeia longa para dentro da mitocôndria foi mantida em C26 animais portadores de tumor. O gene alvo PPAR, enzima bifuncional peroxissomal (

PBE

) envolvidos na peroxissomal de ácidos graxos β-oxidação, exibe um pico diurna às 10 horas no ciclo escuro em ratos saudáveis. WAT de camundongos caquéticos apresentou maior abundância de

PBE

mRNA na maioria das vezes, bem como um significativo avanço de fase de 12 horas, com pico às 10 horas (Figura 6A). Além disso foram observadas alterações significativas entre os camundongos caquéticos e camundongos alimentados com par de 2 pm (Figura S4). Mais uma prova da reforçada β-oxidação peroxissomal é o nível mais elevado de proteína de PBE em animais caquéticos, tanto 02:00 e 14:00 (Figura 5B, Figura S4). No entanto, parece que outros componentes da utilização de ácidos gordos, tais como AOX, HADHA e HADHB permanecem inalterados (Figura S5).

(A) análise de mRNA de

PPARa, Pgc1α, PPARô

,

Nrf1, TFAM, Cpt1α

e

PBE

de Wat do controle (círculo branco) e C26 ratos -bearing tumorais (quadrado preto); Os valores são a média ± S.E.M. apresentados como percentagens em relação aos controlos durante 4-5 animais por grupo (* P 0,05; ** P 0,01; C26 vs controlo). 6 valores am são duplicados em cada gráfico para ilustrar uma completa ciclo de 24 h; (B) Análise Western blot da proteína PBE às 2 pm e 2 pm pontos de tempo.

(A) análise de mRNA de

Ampkα1, Ampkα2

e

Prec

de Wat do controle (círculo branco) e ratos (quadrado preto) C26-rolamento; (B) Análise de Western blot de fosfo-AMPK (Thr192) e AMPK total a 2:00 e 02:00; A análise de imunotransferência de Phospho-ACC e ACC total para amostras WAT 2 pm. (C) Análise de mRNA de

mTOR

e

4Ebp1;

de Wat do controle (círculo branco) e ratos (quadrado preto) C26-rolamento; (D) Análise de Western blot de fosfo-mTOR (Ser2448) mTOR total, a fosfo-4EBP1 (Ser65), fosfo-4EBP1 (Thr37 /46) e 4EBP1 total a 2:00 e 02:00. Os valores são a média ± S.E.M. apresentados como percentagens em relação aos controlos durante 4-5 animais por grupo (* P 0,05; ** P 0,01; C26 vs controlo). 6 valores am são duplicados em cada gráfico para ilustrar uma completa ciclo de 24 h.

A ativação da AMPK Caminho no C26-bearing animais

proteína quinase ativada por AMP (AMPK) é um importante regulador da homeostase de energia, de responder a um aumento do AMP: rácios de ATP, estimulando a oxidação dos ácidos gordos e aumento da absorção de glucose [32]. Uma das funções primárias da AMPK é a fosforilação e a consequente inibição da acetil-CoA carboxilase (ACC), a enzima limitante da velocidade na síntese dos ácidos gordos.