Sumário

Os fatores genéticos associados com o risco de cancros relacionados com o tabagismo tem até recentemente permaneceu uma incógnita. Desde a publicação de um estudo de associação do genoma (GWAS) sobre o cancro do pulmão novos loci genéticos foram identificados que parecem estar associados com o risco de doença. Neste estudo de replicação que genotipados 14 polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) localizados nas 5p12.3-p15.33, 6p21.3-p22.1, 6q23-q27 e loci 15q25.1 em 874 pulmão, 450 bexiga, câncer de laringe 418 casos e controles sem câncer, pareados por ano de nascimento e sexo para os casos. Nossos resultados revelaram que loci no 15q25.1 região cromossômica (rs16969968 [A], rs8034191 [G]) e 5p15 (rs402710 [T]) estão associados com o risco de câncer de pulmão na população polonesa (tabagismo OR ajustado = 1,45, 1,35 , 0,77; p≤0.0001, 0,0005, 0,002, IC 95% 1,23-1,72, 1,14-1,59, 0,66-0,91, respectivamente). Nenhuma das outras regiões aqui analisados ​​foram implicados no risco de pulmão, da bexiga ou cancro da laringe. Este estudo sustenta descobertas anteriores sobre o câncer de pulmão, mas não consegue mostrar associação de SNPs localizados em 15q25.1 e 5p15 região, com outros tipos de câncer de fumar relacionados, como câncer de bexiga e laringe

Citation:. Jaworowska E, Trubicka J, Lener MR , Masojć B, Złowocka-Perłowska E, McKay JD, et al. (2011) fumadores relacionadas câncer e Loci no cromossomas 15q25, 5p15, 6p22.1 e 6p21.33 na população polonesa. PLoS ONE 6 (9): e25057. doi: 10.1371 /journal.pone.0025057

editor: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de junho de 2011; Aceito: 23 de agosto de 2011; Publicação: 22 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Jaworowska et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo programa da Comunidade Europeia “Bolsas de acolhimento Marie Curie para a transferência de conhecimentos”, nr MTKD-CT-2004-510.114. B. M. recebe uma “Bolsa para Jovens Cientistas” do Ministério polonês da Ciência e Ensino Superior. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão continua a ser a principal causa de morte por câncer. Anualmente, mais de 1 milhão de novos casos são diagnosticados e uma proporção significativa morrer dentro de dois anos de diagnóstico [1]. O tabagismo é o principal fator de risco para o cancro do pulmão, mas há um grupo distinto de pacientes que desenvolvem a doença sem história de tabagismo. Além disso, há relatos que sugerem que uma história familiar positiva para câncer de pulmão é um importante fator de risco para esta doença [2].

Apesar de um grande número de estudos que visam identificar fatores genéticos que modificam o risco de câncer de pulmão, não imagem clara surgiu. Em 2008 genoma estudos de associação ampla (GWAS) revelou uma série de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) que ocorre em loci distintos, fortemente associada a vários aspectos do risco de doença. Um lugar em 15q25.1 cromossomo foi associado com o risco de câncer de pulmão [3] – [9], nicotina e dependência de álcool [10] – [14]. marcadores polimórficos desta região em particular estavam localizados na região do gene receptor de acetilcolina nicotínico

CHRNA5

,

CHRNA3

eo domínio aminoglicosídeo fosfotransferase contendo 1 gene

AGPHD1

. Há também evidência de que outros loci estão associados com o risco de cancro do pulmão: 5p15, que contém o gene TERT e o gene CLPTM1L [15] – [19]; 6p22.1, abrangendo a região de MHC de [3], [15]; 6p21.33 que inclui uma região onde o gene MSH5 (rs3131379) reside [3], [15], [19]; e 6q23-25 ​​lócus portador do gene RGS17 [20] – [22]

Para replicar e estender a associação identificada pelo GWASs no cancro do pulmão, optamos por uma série de marcadores do loci 5p12.3-. 15.33, 6p21.33-22.1, 6q23-27 e 15q25.1, e examinou sua associação com outras neoplasias relacionadas com o tabagismo. Um total de 874 pulmão, laringe 418, 450 doentes com cancro da bexiga foram sexo e idade pareados com controles e ensaiadas para 14 SNPs que estão localizados nas quatro regiões de interesse (Tabela 1).

Resultados

Dentre 14 SNPs genotipados, um (rs17374971) foi excluído da análise mais aprofundada em todos os grupos devido a um desvio estatisticamente significante de Hardy-Weinberg.

Dois SNPs no cromossoma 15q25 (rs16969968 e rs8034191 ) foram fortemente associada com o câncer de pulmão (p 0,0001, p = 0,0002, respectivamente, Tabela 2) e estavam em forte desequilíbrio de ligação (D ‘= 0,958, r

2 = 0,91). Devido ao alto LD entre rs16969968 e rs8034191, apenas rs16969968 será discutido mais adiante. O odds ratio (OR) e intervalo de confiança de 95% (IC 95%) por ser heterozigotos para rs16969968 quando ajustado para tabagismo foi (IC 95%: 1,31-2,14) 1,68 e quando homozigoto foi de 1,89 (IC 95%: 1,32-2,70 ); quando incorporado no log de aditivo modelo de efeitos genético OR (IC 95%: 1,23-1,72) 1,45. Embora tenhamos observado a associação mais forte de rs16969968 e rs8034191 com o subtipo carcinoma epidermóide de câncer de pulmão (OR ajustado = 1,4 e 1,3; p = 0,002 e 0,017, respectivamente), uma associação estatisticamente significativa com o subtipo carcinoma de pequenas células (OR ajustado = 1,5 , 1,4; foram observados p = 0,017, 0,025) e uma tendência para uma associação com o subtipo de adenocarcinoma (Tabela S1). Não houve associação entre rs16969968 rs8034191 e com a idade de diagnóstico do cancro do pulmão, o sexo ou o estado de fumar pode ser identificado (dados não mostrados). Nenhuma destas SNPs foi associada com o risco de cancro da bexiga ou da laringe (Tabela S2 e S3). Em uma análise combinada de todos os grupos de controlo, a frequência de rs16969968 e rs8034191 foi semelhante nos nunca fumantes em comparação com o grupo que nunca fumaram (ajustado para idade e sexo OR = 0,96, 0,97; p = 0,74, p = 0,8, respectivamente).

a associação com o câncer de pulmão também foi observado para o SNP rs402710 localizado no cromossoma 5p15.33. Este SNP, estava em desequilíbrio de ligação com rs2736098 (D ‘= 0,89; r

2 = 0,129), mas não com rs2736100 (D’ = 0,181; r

2 = 0,014). O OR ajustado para a realização alelo raro (T) de rs402710 foi de 0,77 (95% CI 0,66-0,91; p = 0,002). Ambos os heterozigotos (TC) e homozigotos raros (TT) foram menos freqüentes no grupo de câncer de pulmão em comparação com controles pareados (OR ajustado = 0,75, 0,61; p = 0,021, 0,007, respectivamente) (Tabela 2). Além disso, foi observada uma associação de rs402710 com pulmão carcinoma de células escamosas e adenocarcioma subtipos (OR ajustado = 0,69, 0,75; p = 0,001, 0,033, respectivamente) (Tabela S1). Semelhante às observações relacionadas com os SNPs em 15q25.1 cromossomo, não houve diferença estatisticamente significativa foi detectada quando os casos de câncer de pulmão foram estratificados por sexo, idade do diagnóstico e tabagismo (dados não mostrados). Em uma análise combinada de todos os grupos de controle, rs402710 não foi associada com tabagismo (OR ajustado para sexo e idade do diagnóstico = 1,03; p = 0,66).

Inicialmente outra associação de câncer de pulmão e rs3131379 (não ajustados OR = observou 1,47, p = 0,003), mas após o ajuste para tabagismo tornou-se estatisticamente insignificante (Tabela S2 e S3). Nenhuma associação de câncer de pulmão com os restantes 10 SNPs genotipados foram observados neste estudo (Tabela S2 e S3).

análise de 13 marcadores polimórficos entre os casos da laringe e da bexiga revelou que nenhum deles foi associado a estes tipos de câncer (Tabela S2 e S3).

cálculos de energia retrospectivos foram realizadas com pequenas Frequência dos alelos (MAF) variando 0,06-0,48 para assegurar que o estudado foi suficientemente alimentado para identificar quaisquer associações. Este estudo teve um poder de 80% em um nível alfa = 0,05 para detectar rácios mínimos de probabilidades no intervalo de 1,3-1,5 para câncer de pulmão, 1,5-1,8 para o câncer de bexiga e câncer de laringe. O limite de detecção aumentada para 1,4-1,7 (cancro do pulmão) e 1,7-2,1 (bexiga e câncer de laringe) com correção de Bonferroni (nível alfa = 0,0038).

Discussão

Este estudo demonstrou que a replicação SNPs no 15q25.1 cromossomo (rs16969968 e rs8034191) e 5p15 (rs402710) estão associados com câncer de pulmão na população polonesa replicando assim, os achados anteriores [3] – [9], [15] – [19]. Não, no entanto, confirmar qualquer associação entre SNPs localizados em 15q25.1 e 5p15 região com bexiga e câncer de laringe.

O locus no cromossomo 15q25.1 contém três genes que codificam receptor nicotínico (nAChR) subunidades (CHRNA3, CHRNA5, CHRNB4) cujo envolvimento na dependência do tabaco foi sugerido a partir de estudos realizados em populações maiores de câncer de pulmão [5], [10] – [12]. A região de associação contém a não sinónima CHRNA5 SNP, rs16969968, que apresenta uma substituição de ácido aspártico (D) por asparagina (N) na posição de aminoácido 398 (D398N) da proteína CHRNA5 (α5 subunidade nAChR). A subunidade nAChR α5 está localizado na volta citoplasmática entre os domínios transmembranares e não está envolvido na ligação ao receptor. A região da proteína CHRNA5 onde a substituição do ácido aspártico na posição 398 ocorre é altamente conservada entre as espécies de vertebrados, sugerindo que as alterações nesta posição são muito susceptíveis de ser de significância funcional.

In vitro

estudos indicam que a asparagina na posi�o 398 da α5 nAChR subunidade diminui função de receptores colinérgicos [13]. Os receptores nicotínicos que contêm α5 são encontrados em neurónios dopaminérgicos e GABAérgicos no estriado e ventral tegmental área, uma região do cérebro envolvida na via de recompensa [13], [23]. Os indivíduos que abrigam a variante de CHRNA5 (que diminui a actividade do receptor colinérgico) podem ter um risco aumentado de dependência da nicotina como os níveis mais elevados de nicotina são necessários para atingir a activação semelhante da via dopaminérgica [13]. Uma vez expostos ao fumo, heterozigotos e homozigotos raros de rs16969968 têm, respectivamente, um 1,3 vezes e quase 2 vezes maior risco de desenvolver dependência de nicotina [24]. Observações independentes confirmaram a associação de SNPs nesta região, com o risco de neoplasias relacionadas com o tabaco, como do pulmão, da bexiga e cancros do tracto aeordigestive superiores (VADS) [3] – [9], [25] – [27]. Em apoio destes resultados de outros estudos demonstraram que este locus é implicados no risco de doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC) e doença arterial periférica, ambos os quais têm sido associados com o tabagismo [5], [28]. Tomadas em conjunto estas observações levantam a questão de saber se a região 15q25.1 está associada a um efeito direto sobre o tabagismo doenças relacionadas ou podem ser explicados apenas por uma influência genética sobre o vício de fumar. Estudos adicionais realizados em diferentes populações apoiou a associação do locus 15q25.1 com câncer de pulmão em não fumantes que fornecem evidência de um papel direto deste lócus no desenvolvimento da doença [3], [6]. Em apoio disto, tem sido mostrado que as células neuroendócrinas pulmonares, células epiteliais alveolares, células neuroendócrinas pulmonares e linhas celulares de cancro de pulmão, expressam receptores de nicotina, substâncias que se ligam de potencial carcinogénico que incluem

N

‘e -nitrosonornicotine nitrosaminas. Assim carcinogéneos podem promover a transformação neoplásica por estimular o crescimento tumoral e angiogénese [29], [30]. Além disso, os resultados de um estudo conduzido recentemente na modulação da actividade CHRNA5 em células bronquiais e em linhas celulares de cancro de pulmão sugeriu uma influência potencial de CHRNA5 sobre a adesão celular, bem como a motilidade celular e a regulação de p63, uma proteína homóloga para o supressor de tumor p53 [31]. Estudos em grandes populações de etnia mista mostrou que esse lugar está implicado em todos os subtipos histológicos de câncer de pulmão, no estudo atual também replicado desta associação na população polaca, embora a nossa análise dos alelos de risco entre os casos de adenocarcinoma do subtipo mostrou apenas um fraco tendência para uma associação (Tabela S1) [3] – [9]. Não fomos capazes de mostrar qualquer associação entre SNPs na 15q25 região e tabagismo entre os controles, enquanto que outros estudos maiores Analisando apenas a dependência da nicotina e relativas a diferentes medidas de fumar exposição, claramente provado esta associação [10] – [13]. Nossos resultados foram baseados em números menores de nunca ter fumado pacientes com câncer de pulmão e, portanto, não tinha qualquer poder para detectar essa associação. Nossos resultados foram, no entanto, de acordo com um grande estudo de replicação conduzida dentro do Câncer Consórcio Internacional de pulmão usando 11 645 pacientes de casos de câncer de pulmão e 14 954 indivíduos de controle, onde nenhuma associação de rs16969968, rs8034191 com câncer de pulmão entre não fumantes foi observada [9 ]. Somando-se a isto, uma meta-análise publicada recentemente de 5 estudos anteriores sobre nunca ter fumado pacientes com câncer de pulmão não encontraram associação entre 15q25 e risco de câncer de pulmão [32]. Isso coloca em questão a noção pleiotropic da região 15q25 e sugere um efeito mais indirecto sobre o risco de câncer de pulmão.

A associação de cancro da bexiga com o 15q25 lócus foi demonstrado em um estudo caso-controle de pacientes de Los Angeles County, EUA e Xangai, China. Neste rs8034191 estudo foi associada a 1,26 vezes maior risco de cancro da bexiga entre os brancos não-hispânicos, embora os autores não conseguiu replicar a associação na população chinesa porque a freqüência do alelo raro era muito baixo [25]. Em contraste, nossos dados e que a partir de um estudo de 790 nunca fumar bexiga e casos de câncer renal de origem caucasiana indicaram nenhuma associação entre o câncer de bexiga e do 15q25 região [33].

A região do cromossomo 5p15.33 contém dois genes,

CLPTM1L viajantes – lábio leporino e fenda palatina transmembrana 1 como gene e

TERT viajantes – telomerase humana reverter gene da transcriptase. A enzima TERT é um componente proteico de telomerase, uma polimerase de ribonucleoproteína que regenera dos telómeros termina pela adição de sequências de nucleótidos de repetição. O componente de ARN da telomerase serve como um modelo para a repetição dos telómeros. Telomerase desempenha um papel crucial para garantir a estabilidade dos cromossomas e impedindo as células normais se tornam malignos. A região de codificação de TERT é altamente conservada entre espécies [34]. As mutações na sequência de codificação deste gene são raras e têm sido associados com disqueratose congita, fibrose pulmonar idiopática e um aumento do risco de alguns tipos de cancro [35], [36].

O segundo gene em 5p15.33 é

CLPTM1L

, que está implicado na susceptibilidade à fissura palatina. Este gene é expresso em vários tecidos, incluindo tecido de pulmão e sobre-expresso em linhas resistentes à cisplatina celulares de cancro do ovário, em que foi demonstrado o seu papel na indução de apoptose em células sensíveis a cisplatina [37]. Alguns autores sugerem que, com base nestas observações

CLPTM1L

poderia estar associada com a indução de apoptose em células de pulmão após a exposição a agentes genotóxicos, tais como carcinogénios do tabaco [16].

Neste estudo temos investigaram dois SNPs (rs2736100, rs2736098) que estão situadas na região de TERT e na região de CLPTM1L (rs402710). Actualmente, não existe qualquer evidência que sugira que qualquer desses SNPs têm um papel funcional ou é um alelo causador da doença. A região 5p15.33 tem sido claramente associada com câncer de pulmão [15] – [19]. Neste estudo foram replicadas a associação de rs402710 com o risco de câncer de pulmão na população polonesa, mas foram incapazes de mostrar uma associação de dois outros SNPs, um dos quais (rs2736100) foi sugerida para ser um fator de risco independente para o câncer de pulmão [16] . A estratificação dos nossos dados por subtipo histopatológico revelou que foi observada uma forte associação entre os pacientes de carcinoma de células escamosas e uma associação mais fraca para o subtipo de adenocarcinoma, o que está em contraste com os resultados obtidos a partir de um GWAS, onde foi observada a relação inversa [17], [ ,,,0],18]. A região 5p15.33 foi associado a cancro da bexiga em um estudo realizado pela deCODE Genetics sobre uma população europeia, composta por 4.147 casos de câncer de 10 países ou regiões [38]. Neste grande estudo rs401681 e rs2736098 foram associados com um risco aumentado de cancro da bexiga (OR = 1,12, 1,16, p = 5,7 × 10

-5, 1,3 × 10

-4, 5,7 × 10

– 5, respectivamente). Um estudo realizado em brancos não-hispânicos de Los Angeles County, EUA e uma população chinesa mostrou associação estatisticamente significativa do cancro de bexiga com rs2736100 em ambos os grupos étnicos [25]. Em nosso conjunto de dados que não poderia mostrar a associação dos três SNPs na região do 5p15.33, provavelmente devido a diferenças populacionais, que também foi visto no estudo de deCODE Genetics, onde a associação rs2736098 quando estratificados por país ou região, ap alcançado value≤0.05 em apenas quatro dos países e regiões que contribuem [38].

a análise do poder retrospectiva realizada em nosso estudo sugerem que uma das possíveis razões que não podia replicados os resultados reportados anteriormente para o câncer de bexiga e laringe grupos poderia ser devido ao pequeno tamanho da amostra desses grupos em nosso estudo. Este problema poderia ser resolvido aumentando o caso para controlar rácio de 1:01 – 1:03. Neste estudo não foi possível para corresponder casos e controles com rácios mais elevados devido ao não ser capaz de recrutar mais controles que aderiram aos nossos critérios de correspondência.

Em resumo, este estudo confirmou ainda mais a GWAS descobrindo que as regiões 15q25 0,1 e 5p15.33 contribuir para o risco de câncer de pulmão, mas não conseguiu mostrar uma associação destes loci com bexiga e câncer de laringe na população polonesa.

Materiais e Métodos

Entre os anos de 2000 e 2007 um total de 1742 doentes com cancro consecutivamente da rede de hospitais clínicos em Szczecin, Polónia foram incluídos neste estudo. O estudo incluiu 874 casos de câncer de pulmão, 450 pacientes diagnosticados com câncer de bexiga e 418 pacientes com câncer de laringe. Todos os casos foram confirmados histologicamente ou citologicamente. Os pacientes foram convidados a participar neste estudo, quando participou de um ambulatório de oncologia em seus respectivos hospitais regionais ou o Centro Internacional Hereditárias Câncer (IHCC) em Szczecin. taxa de participação do paciente superior a 80%. Os dados sobre tabagismo foi disponível a partir de 91% de todos os pacientes com câncer, coletadas no momento da inscrição. Para aqueles pacientes onde o status de fumar não foi coletada no momento do registro foi adquirido, quer em visitas de acompanhamento ou por comunicação pessoal (telefone, carta). tabagismo foi classificado em duas categorias:. nunca e nunca fumantes

A população controle consistiu de 1061 pacientes adultos saudáveis ​​que tinham visitado seus médicos de família localizadas na cidade de Szczecin ou concelhos circundantes. As taxas de participação para a população de controle ultrapassou 71%. Casos e controles foram então combinados aleatoriamente pelo ano de nascimento (+/- 3 anos) e sexo, resultando em 874, 450, 418 pares com pulmão, bexiga e câncer de laringe casos, respectivamente. Os dados sobre tabagismo foi disponível a partir de 83% de todos os controles. As características de casos e grupos de controle são apresentados na Tabela 3.

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Pomeranian Médica de Szczecin. Todos os indivíduos incluídos no estudo só foram admitidos depois de fornecer consentimento informado por escrito para participar.

O DNA para análise foi extraído a partir de linfócitos de sangue periférico de indivíduos que utilizam a não enzimática, método de salga-out rápida sem modificações como descrito anteriormente [39]. A análise da genotipagem de 14 SNP foi realizada utilizando o ensaio 5’exonuclease (TaqMan, Applied Biosystems, Foster City, CA, E.U.A) na Agência Internacional de Investigação do Cancro. Amostras de DNA de casos de cancro e de controlo foram distribuídos aleatoriamente números de ensaio durante o processo de genotipagem, a fim de evitar qualquer viés genotipagem; pessoal de laboratório estavam cegos para o status de caso /controle. 7% do número total de indivíduos neste estudo (derivada de ambos os casos e controlos) foram seleccionados aleatoriamente para ser re-genotipados para cada SNP para controlar a reprodutibilidade dos ensaios de genotipagem. concordância duplicado interna foi taxa de 99,9% e sucesso genotipagem foi 91%. De 14 analisados ​​SNPs, as distribuições de genótipos de 13 SNPs não se afastou da Hardy-Weinberg (HWE) em qualquer grupo de controles. Um SNP (rs17374971) que teve desvio significativo do HWE foi excluído da análise mais aprofundada em todos os grupos. Cada um dos SNPs foi analisada individualmente por alelo (sob o modelo log-aditivo) e por genótipo calculando odds ratio (OR), intervalo de confiança de 95% (IC 95%), valores p usando um modelo de regressão logística. Ou ajuste foi realizado através da incorporação de tabagismo como um parâmetro adicional no modelo de regressão logística. Pacientes com dados perdidos em tabagismo foram excluídos do cálculo do OR ajustado. Alelos para todos os SNPs foram distribuídos de acordo com a base de dados de Single Nucleotide Polymorphism (dbSNP, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP) [40]. Todos os cálculos foram realizados utilizando o alelo principal de cada SNP como a referência (Quadro 1). teste de Bonferroni foi utilizado para ajustar para o teste múltiplo de tal modo que todos os resultados que obtiveram um p value≤0,0038 foram considerados significativos. LD (D ‘e r

2) foi calculado usando haploview [41]. A análise do poder retrospectiva foi realizada por meio de alimentação para software Genetic Association Versão 2.0 com o nível alfa de 0,05 e 0,0038 sob modelo de co-dominante, com dois graus de liberdade [42].

Informações de Apoio

Tabela S1 . As estimativas de risco

por alelo por histopatologia para rs16969968, rs803419 e rs402710 no grupo de câncer de pulmão

doi: 10.1371. /journal.pone.0025057.s001

(XLS)

Tabela S2. estimativas

de risco por alelo para 13 SNPs no pulmão, bexiga e grupo câncer de laringe

DOI: 10.1371. /journal.pone.0025057.s002

(XLS)

Tabela S3. As estimativas de risco

por genótipo para 13 SNPs no pulmão, bexiga e laringe cancro grupo

doi: 10.1371. /journal.pone.0025057.s003

(XLS)