Abstract

A evidência é apresentada para a presença nuclear de um complexo heteromérica funcional do fator de crescimento epidérmico (EGFR), src eo transdutor de sinal e ativador de transcrição (STAT) 3 proteínas em células de câncer de pâncreas. Stat3 permanece nuclear e está relacionado com Src ou EGFR, respectivamente, sobre o knockdown siRNA de EGFR ou Src, demonstrando a resistência do complexo para a modulação de EGFR ou Src sozinho. Significativamente, a imunoprecipitação da cromatina (ChIP), revelam o EGFR nuclear, Src e Stat3 complexo é ligado ao promotor de c-Myc. O knockdown siRNA de EGFR ou Src, ou a inibição farmacológica da actividade Stat3 apenas marginalmente suprimida a expressão de c-Myc. Por outro lado, a modulação simultânea da STAT3 e EGFR, ou Stat3 e Src, ou com o EGFR e Src suprimiu fortemente a expressão de c-Myc, demonstrando que o novo complexo nuclear heteromérico primorosamente regula o gene de c-Myc. A prevalência do EGFR transcrição funcional, complexo nuclear Src e Stat3 fornece um mecanismo adicional e inovador para apoiar o fenótipo câncer de pâncreas e explica em parte a insensibilidade de células de cancro do pâncreas à inibição de EGFR, Src ou Stat3 sozinho.

Citation: Jaganathan S, Yue P, Paladino DC, Bogdanovic J, Huo Q, Turkson J (2011) a funcional epidérmico Nuclear factor de Crescimento Receptor, Src e Stat3 heteromérica Complex em células de cancro do pâncreas. PLoS ONE 6 (5): e19605. doi: 10.1371 /journal.pone.0019605

editor: Marcelo G. Bonini, da Universidade de Illinois em Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de novembro de 2010; Aceite: 12 de abril de 2011; Publicado em: 05 de maio de 2011

Direitos de autor: © 2011 Jaganathan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Cancer Institute Grants CA106439 Nacional (JT) e CA128865 (JT), Departamento de Saúde Foundation Bankhead-Coley (Ponte Grant) (HQ), apoio parcial do Conselho Mundial de ouro (CRESCER Programa) (HQ) Florida, ea National Natural Science Foundation da China Overseas Young Investigator Award (20828006) (HQ). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Muitos processos bioquímicos intracelulares são acionados pelo conjunto de proteínas em complexos macromoleculares. A associação entre as proteínas ou de proteínas com outras entidades moleculares modula a conformação da proteína, proporcionando um meio para regular a miríade de processos bioquímicos que servem para administrar de forma eficiente respostas biológicas vitais. dinâmica de proteínas e tráfico, e estabilidade da proteína também são processos que podem ser modulados pela associação de proteínas com os outros. No sentido mais amplo, associações inter-moleculares permitem que proteínas especializadas, tais como receptores, adaptadores, enzimas e fatores de transcrição para modular diferencialmente eventos intracelulares, criando assim a diversidade de respostas fisiológicas e promover contexto de dependência.

Durante o indução de transdução de sinal, não há montagem de diferentes proteínas, cada uma das quais tem funções específicas importantes para a transdução de sinal e a resposta biológica que acompanha. O receptor do factor de crescimento epidérmico tradicional (EGFR) via de transdução de sinal incorpora a activação da proteína cinase cinase activada por mitogénio (MEK) -mitogen-activada proteína quinase /extracelular quinase regulada por sinal (Erk

MAPK) e promove respostas mitogénicas [ ,,,0],1], [2]. A indução de EGFR também promove a activação do transdutor de sinal e activador da transcrição (STAT) da família de proteínas, que de forma semelhante ter um papel central na resposta biológica induzida por EGF [1]. As proteínas STAT são factores de transcrição citoplasmáticos latentes que são activados em resposta à estimulação celular, citocinas e factores de crescimento [3] por meio da fosforilação de um resíduo crítico tirosil (Tyr705 para Stat3). A fosforilação da tirosina de STAT é mediada por tirosina-cinases de receptores de factores de crescimento e por tirosina-quinases citoplasmáticas, tais como Src e Janus quinase (Jaks) famílias. STAT ativados como dímeros no ligamento núcleo para elementos de resposta de ADN específicos nos promotores dos genes-alvo para induzir a transcrição do gene. O mecanismo de translocação nuclear para STAT tem sido objecto de intensa investigação recente. translocação nuclear STAT3 foi relatado para ser mediada pelo reconhecimento e transporte por importina-α e o Ran-GTPase [4], e por mecanismos que envolvem o chaperoning por MgcRacGAP [5], endocitose mediada pelo receptor de EGF [6], e pela -membrana associada plasma jangadas lipídicas tráfico [7].

a prevalência de muitas vias de transdução de sinal hiperativas que suportam o fenótipo de câncer é um grande desafio para a terapia. Para além da forma clássica de promover crosstalks entre múltiplas vias de sinalização, os conjuntos de proteínas macro-moleculares fornecer mecanismos adicionais exclusivos para induzir eventos que suportam o fenótipo maligno. Tal mecanismo de sinalização não-tradicional tem sido identificado para o EGFR, o que foi detectado no núcleo da célula e observou funcionar como um factor de transcrição [8], [9]. Estudos revelaram ainda mais os complexos EGFR nucleares com Stat3 em células de cancro da mama, e este complexo induz genes específicos, incluindo o sintase de óxido nítrico induzível (iNOS) [10]. A função do EGFR adicional seria composto o seu papel como um agente mitogénico e de um promotor da sobrevivência das células, que favorecem o cancro. A este respeito, a activação aberrante concomitante de EGFR e mediadores de sinal a jusante, incluindo Src e Stat3, que ocorrem com frequências altas em cancros humanos reflete uma complexidade de sinalização global que suporta o fenótipo câncer. Por exemplo, com referência ao cancro do pâncreas, activação aberrante de EGFR ocorre em 30-50% dos casos [11], c-Src activado é observado em mais de 70% dos casos, e frequentemente acompanha o EGFR sobre-expressão [12], enquanto aberrante activação Stat3 também é altamente prevalente [13], [14], [15]. Importante, o nosso relatório recente de que o cancro do pâncreas é mais sensível à inibição simultânea de Stat3 aberrante e EGFR ou Src [16] mostra a utilização de várias vias de sinalização aberrantes para a manutenção do fenótipo do cancro e como isso influencia a capacidade de resposta à terapia. Para estender nossos estudos anteriores [16], procurou-se investigar a interação molecular e funcional entre Stat3, EGFR e Src e os mecanismos subjacentes de apoio do fenótipo câncer pancreático. Nós aqui proporcionam provas para um EGFR funcional nuclear heteromérica, complexo de Src e Stat3 em células de cancro do pâncreas, o que promove a indução do gene c-Myc. O nosso relatório é o primeiro sobre a identificação de um EGFR nuclear, Src e Stat3 complexo heteromérica que promove a indução do gene c-Myc. Compreender a dinâmica do EGFR, Src e Stat3 interacções moleculares no câncer de pâncreas proporcionaria uma base para projetar nova terapia múltipla alvo abordagens eficazes para o câncer de pâncreas.

Materiais e Métodos

Células e Reagentes

O câncer pancreático humano, Panc-1 e Colo-357 linhas foram todas previamente descrito [16], [17]. A linhagem humana imortalizada pancreático células do ducto epitelial (HPDEC) foi um presente amável do Dr. Tsao, OCI, UHN-PMH, Toronto) [18]. HPDEC foram cultivadas em meios SFM-queratinócitos suplementado com 0,2 ng de EGF, 30 ug /mL de extracto de pituitária bovina e contendo antimycol. Todas as outras células foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 5% de soro de bovino suplementado com ferro de vitelo e 100 unidades /ml de penicilina-estreptomicina.

Síntese peptídica

O péptido de domínio SH2 Stat3 inibidor (SPI), FISKERERAILSTKPPGTFLLRFSESSK, os motivos peptídicos de EGFR, pY1068EGFR (pY1068), e o PEpYINQS pY1086EGFR (pY1086), PVpYHNQP foram adquiridos a partir do Péptido 2,0 (Fairfax, VA) em 95% de pureza

Nuclear. extrato de preparação e gel de ensaios de desvio

preparação extracto nuclear de células foi realizada como descrito anteriormente fraccionamento [17].

Sub-celular, e SDS-PAGE /Western Blot Analysis

análise de transferência de Western foi realizada como descrito anteriormente [19], [20] em lisados ​​de células inteiras, e em fracções citosólicas e de membrana, e em extractos nucleares. fracções sub-celulares foram preparadas de acordo com o protocolo padrão. Resumidamente, as células foram lavadas com PBS, ressuspensas e lisadas em tampão de baixo teor de sal (20 mM de HEPES (pH 7,9), EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 20 mM, Na 1 mM de

3VO

4, 1 de Na mM

4P

2O

7, ditiotreitol 1 mM, a TLA 1 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 0,5 mM e 0,5% de Nonidet P-40), e centrifugou-se (13.000 x

g

, 4 ° C, 30 s) para se obter a fracção citosólica. O sedimento foi lavado três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), ressuspensas em tampão de alto teor salino (NaCl a 420 mM, HEPES 20 mM (pH 7,9), EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, glicerol a 20%, 20 NaF mM, na 1 mM de

3VO

4, de na 1 mM de

4P

2O

7, ditiotreitol 1 mM, a TLA 1 mM e fluoreto de fenilmetilsulfonilo 0,5 mM), incubou-se a 4 ° C durante 30 min , com agitação, e centrifugados a (13.000 x

g

, 4 ° C, 30 min) para se obter a fracção nuclear (sobrenadante). O sedimento obtido foi lavado três vezes com PBS, ressuspensas em tampão de lise RIPA (50 mM de Tris (pH 7,4), NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 1% de Nonidet P-40, 0,1% de SDS, a TLA 1 mM e 0,5 mM fluoreto de fenilmetilsulfonilo), incubado durante 30 min a 4 ° C com agitação, e centrifugou-se (13000 xg, 4 ° C, 20 min). O sobrenadante foi recolhido como fracção de membrana. Os anticorpos primários são utilizados contra pY845EGFR (Upstate Biotech, Millipore, Billerica, MA), pY705Stat3, Stat3, pY1068EGFR, pY1086EGFR, pY1173EGFR, EGFR, pY416Src, Src, e β-Actina (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), e Tata- proteína de ligação (TBP) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Os peptídeos que bloqueiam foram adquiridos a partir das respectivas empresas.

RNA pequeno-interferência (siRNA) transfecção

sequências de siRNA para EGFR e Src foram encomendados à Dharmacon RNAi Technologies, Thermo Scientific (Lafayette, CO) . As sequências são utilizadas: EGFR de cadeia de sentido, 5′-GAAGGAAACUGAAUUCAAAUU-3 ‘; EGFR cadeia anti-sentido, 5’-pUUUGAAUUCAGUUUCCUUCUU-3 ‘; ARNsi de controlo de cadeia de sentido, 5’-AGUAAUACAACGGUAAAGAUU-3 ‘; e ARNsi de controlo cadeia anti-sentido, 5’-pUCUUUACCGUUGUAUUACUUU-3 ‘. O reagente de c-Src SmartPool siRNA (NM-005417, catálogo # M-003175-01-05) foi usada para Src. Transfecção em células foi realizada utilizando 20 nM de ARNsi de EGFR ou 25 nM de Src siRNA e 8 ul de Lipofectamina RNAiMAX (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) em meio de cultura OPTI-MEM (Gibco, Invitrogen Corporation).

A imunoprecipitação (IP), e imunoprecipitação sequencial estudos

Estes estudos foram realizados como descrito anteriormente [21], utilizando lisados ​​de células inteiras ou extractos nucleares (250 ug de proteína total) e 5 ul de anti-EGFR ou Src anti-soro policlonal anticorpo ou o anticorpo monoclonal anti-Stat3 (Cell Signaling Technology). Para especificidade, análise de imunotransf erência utilizando anticorpos anti-EGFR, anti-Src e anticorpo anti-Stat3 foi realizada na presença do respectivo péptido de bloqueio. estudos IP sequenciais foram feitas de acordo com procedimentos publicados [10], com algumas modificações como se segue: extractos nucleares, preparado tal como descrito anteriormente [21], foram submetidos a uma imunoprecipitação semelhante com respeito ao primeiro anticorpo primário, o anticorpo anti-EGFR (Cell Signaling ) ou IgG (Santa Cruz) a 4 ° C durante a noite. O immunecomplex foi, em seguida, sedimentadas com /G esferas de agarose de 20 ul de proteína A (Santa Cruz), lavou-se três vezes, utilizando tampão de lavagem A (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, 2 mM de EDTA, 20 mM de Tris-HCl, pH 8,0 ), e depois duas vezes com tampão de lavagem B (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA a 2 mM, NaCl 500 mM, Tris-HCl a 20, pH 8,0). Em seguida, as proteínas foram eluídas com tampão de eluição preparado de fresco (SDS a 1%, 100 mM de NaHCO

3) e submetidas ao segundo imunoprecipitação por incubação com anticorpo anti-Src ou IgG (Santa Cruz). Os complexos foram então precipitados, lavou-se, eluiu-se com tampão de lamelli e depois sujeitos a SDS-PAGE e análise de transferência de Western de sondagem para Stat3.

imunocoloração com laser de varrimento de imagem confocal

células

Panc-1 crescer em lamelas em placas de 12 poços foram tratadas com ou sem inibidores de 1 ou 24 h e submetida a imunocoloração e fluorescência ou laser de varrimento de microscopia confocal, como descrito anteriormente [21]. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 15 minutos, lavadas três vezes com PBS, permeabilizadas com 0,25% de Triton X-100 durante 10 min, e lavou-se três vezes com PBS. As amostras foram, em seguida, bloqueadas em BSA a 0,1% em PBST, durante 30 minutos e incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo monoclonal de rato anti-EGFR (Santa Cruz), anticorpo monoclonal anti-Src (Cell Signaling), e anticorpos policlonais de coelho anti Stat3-(Cell Signaling ) anticorpos a diluição 1:50 (em 0,1% de BSA). Subsequentemente, as células foram lavadas três vezes em PBST, incubadas durante 1 h à temperatura ambiente no escuro com 1:1000 diluições dos três anticorpos secundários AlexFluor, ALexaFLuor405 (anti-rato de cabra), AlexaFluor488 (de burro anti-coelho) e AlexaFluor546 (cabra anti -rat) (Molecular Probes, Invitrogen) para EGFR, Src e detecção Stat3, respectivamente. As amostras foram, em seguida, lavou-se três com PBST. Subsequentemente, lamelas foram removidas e montadas em lâminas com Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL) e impedido de secagem por meio de selagem com as arestas tinta unha. As lâminas foram armazenadas no escuro a 4 ° C, até as imagens foram captadas. Para coloração negativa, anticorpos secundários foram adicionados sem os anticorpos primários. análise confocal foi realizada por meio do exame de lâminas no Leica TCS SP5 microscópio confocal (Alemanha) em comprimentos de onda adequados. As imagens foram capturadas e processadas utilizando o software Leica TCS SP 5.

Cromatina imunoprecipitação (CHIP) e Análise ChIP sequenciais

Para o ensaio ChIP, células em cultura foram tratados com formaldeído com uma concentração final de 1%, durante 10 minutos à temperatura ambiente seguido por tratamento com glicina numa concentração final de 0,125 M durante 5 min à temperatura ambiente durante a reticulação. Subsequentemente, as células foram lavadas com PBS gelado e ressuspensas em e lisadas com tampão de lise (20 mM de HEPES, pH 7,4, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, NaF 1 mM, Na 1 mM de

3VO

4, Na 1 mM de

4P

2O

7, ditiotreitol 1 mM), 1X TLA, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 5% de Nonidet P-40, e centrifugou-se. Então sedimento nuclear foi ressuspenso em tampão de lise núcleos (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, EDTA 10 mM, SDS a 1% e inibidores de protease) (Roche, Indianapolis, IN). Os lisados ​​nucleares foram sonicadas (Omni International, Kennesaw, GA) com potência de 30% para 3 pulsos para intervalos de 10s no gelo Para distorcer DNA. A solução da cromatina foi pré-limpo com proteína A /G agarose (Santa Cruz) durante 1 h a 4 ° C com agitação. Em seguida, os lisados ​​pré-apagada foram imunoprecipitadas por incubação com o anti-EGFR, anti-Src, ou anticorpos anti-STAT3 ou com IgG (sem anticorpo) (Santa Cruz) a 4 ° C durante a noite com agitação. Os complexos foram recolhidos com /G esferas de agarose de 20 ul de proteína A (Santa Cruz), lavou-se três vezes, utilizando tampão de lavagem A (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA 2 mM, Tris-HCl a 20, pH 8,0) e duas vezes com tampão de lavagem B (0,1% de SDS, 1% de Triton X-100, EDTA a 2 mM, NaCl 500 mM, Tris-HCl a 20, pH 8,0). Em seguida, os complexos foram eluídas com tampão de eluição preparado de fresco (SDS a 1%, 100 mM de NaHCO

3). Ligações cruzadas foram invertidos por meio de aquecimento a 65 ° C na presença de NaCl, seguido por tratamento com proteinase K (20 uL de uma solução 20 mg /ml) durante 6 h. O DNA foi recuperado e purificado utilizando o kit de purificação de ADN da Qiagen (Valencia, CA). A cromatina imunoprecipitada purificado de DNA foi em seguida utilizada como molde para a amplificação por reacção em cadeia da polimerase (PCR) do promotor de c-Myc, utilizando os iniciadores, para a frente, 5’AAAAGGGGAAAGAGGACCTGG-3 ‘, e reverso, 5′-TAAAAGGGGCAAGTGGAGAGC-3′ ou o promotor TWIST utilizando os primers, Atacante, 5’- AGTCTCCTCCGACCGCTTCCTG -3 ‘

Reverso:. 5′- CTCCGTGCAGGCGGAAAGTTTGG -3′ (Invitrogen). Os produtos de PCR, 133 pb para c-Myc e 332 pb para TWIST [22] foram resolvidos em gel de agarose a 2%. Foram realizados os estudos ChIP sequenciais como relatado anteriormente [10], e seguindo os estudos de imunoprecipitação sequenciais descritas, utilizando-se o primeiro anticorpo primário (anti-EGFR) e o segundo anticorpo primário (anti-Src). Os complexos recuperados após a imunoprecipitação secundário foram eluidos com o tampão de eluição e, em seguida, submetido a ensaio de chip, como descrito.

Gel de cromatografia de filtração em

A 200 10/30 GL coluna de vidro pré-embalado Superdex foi comprado de GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ). O sistema de cromatografia usado no estudo foi o Duoflow sistema BioLogic (Bio-Rad, Hercules, CA). A análise de cromatografia foi realizada seguindo as instruções do fabricante com uma sequência geral de equilibração, carga, eluição, regeneração e armazenamento de execução. Tampão RIPA (Tris 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, 0,1% de SDS, 1% de Nonidet P-40) foi utilizado como o tampão da fase móvel. As amostras (Panc-1 lisado celular, 2 mg de proteína total num volume de 250 ul) foram carregadas até à coluna, em seguida, o caudal foi ajustado para 0,25 ml /min, e, em seguida, a fracção (500 ul) de recolha foi iniciado logo após a amostra carga e monitorada pela absorvância eluente a 280 nm. De acordo com os picos de absorvância, as fracções 21-34 foram seleccionados e sujeitos a imunotransf erência usando análise de anticorpos contra o EGFR, Stat3, e Src (Cell Signaling), e contra ARN helicase A (RHA) (Abcam, Cambridge, MA). Para o ensaio de imunoprecipitação, 100 ul de cada uma das fracções 23-27 foram reunidas, a partir do qual foi precipitado immunecomplex EGFR usando anticorpo anti-EGFR (Cell Signaling) e submetido a análise de imunotransferência para Stat3, Src e EGFR.

Preparação de sondas anti-EGFR e mouse IgG1-PNB

As nanopartículas de ouro (PNB), 0,1 nM, com um diâmetro de 40 nm foram adquiridos de Ted Pella Inc. (Redding, CA). anticorpo monoclonal de rato anti-EGFR [F4] foi adquirido a partir de Abcam (cat. no. Ab62, HCl cone. 1,2 mg /ml), e IgG1 monoclonal de rato não específica foi adquirido a partir de Sigma (Cat. no. M9629, HCl cone. 1 mg /ml). Policlonal anti-Stat3 (cone. 0,2 mg /ml), anticorpos policlonais anti-Src (0,1 mg /ml), anticorpo policlonal anti-EGFR (0,2 mg /ml) e IgG de coelho não-específica (0,4 mg /mL) foram adquiridos a partir de Santa Cruz. Todos os outros produtos químicos e os ingredientes de tampões para o desenvolvimento do ensaio foram adquiridos a partir de Sigma. A sonda anti-EGFR-PNB foi preparada por adição de 10 uL de anticorpo monoclonal de murganho anti-EGFR de 1 ml de PNB. Após incubação durante 15 min à temperatura ambiente, a sonda foi bloqueada com 2,5 mg de BSA durante 30 min. Após a centrifugação a 10.000 rpm durante 5 min, o sobrenadante foi eliminado e o resíduo de nanopartículas foi redisperso em 0,5 ml de 0,25% de BSA em tampão fosfato 10 mM (PB). A sonda foi então utilizada no ensaio. O ratinho de controlo da sonda de IgG1-PNB negativo foi preparada por adição de 10 ul de anticorpo monoclonal IgG1 de ratinho a 1 ml PNB, e seguindo o procedimento idêntico ao utilizado para a preparação da sonda de EGFR. IgG1 de ratinho foi usada aqui para preparar a sonda de controlo, porque o anticorpo monoclonal anti-EGFR é um anticorpo de ratinho tipo IgG1.

A detecção e estudo de ligação cinética de EGFR a partir de extracto nuclear com as sondas PNB

O Panc-1 amostra extracto nuclear foi diluída em tampão de fosfato (PB) para 1 mg /ml de proteína total. Em uma célula de amostra de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) de medição (Hellma QS cuvete 3 mm), 20 ul de sonda anti-EGFR-PNB foi misturada com 2 ul da amostra, e o aumento do tamanho das partículas foi lida com um instrumento de DLS (sistema Zetasizer Nano ZS90 DLS, Malvern Instruments Ltd., Inglaterra) em exactamente 1, 6, 11, 16, e 30 minutos após a mistura. O mesmo experimento também foi realizada utilizando a sonda IgG1 no PNB. A fim de confirmar a especificidade da sonda anti-EGFR-PNB na detecção de EGFR a partir de extracto nuclear, uma experiência de inibição foi realizado por tratamento de 5 ul da amostra com 1 ml de anticorpo anti-EGFR monoclonal à temperatura ambiente durante 7 min e 24 min antes da utilização da amostra no ensaio. Após esta incubação, 20 ul de sonda anti-EGFR-PNB foi misturada com 2 ul da amostra tratada, e o tamanho de partícula foi lida a 1, 6 e 11 minutos após a mistura.

proteína de ligação estudo parceiro usando policlonal

anticorpo

Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, 80 ul de sonda anti-EGFRGNP foi misturado com 8 ul de amostra. Após incubação durante 30 min à temperatura ambiente, esta solução foi dividida em quatro porções de 20 ul. Depois de transferir para a célula de amostra, o tamanho das partículas de cada uma destas porções foi lida com um instrumento de DLS. Após esta leitura, a solução foi enriquecida com um anticorpo policlonal: ou com 1 uL de anti-Stat3 ou 2 uL de anti-Src ou 1 uL de anti-EGFR ou 0,5 ul de IgG de coelho. O aumento do tamanho das partículas foi lida a exactamente 5 min e 10 min após o início da primeira leitura.

dinâmica de espalhamento de luz (DLS) medições

As medidas de DLS de todas as soluções de amostras foram realizadas utilizando um sistema Zetasizer Nano ZS90 DLS equipado com um laser vermelho (633 nm) e um detector de fotodiodo de avalanche (APD) (eficiência quântica 50% a 633 nm) (Malvern Instruments Ltd). aplicações DTS 5.10 software foi utilizado para analisar os dados. O tamanho médio de partícula (média Z) de a solução foi obtida através de um método cumulant. Para cada amostra, dez medições DLS foram realizados com uma corrida, e cada execução durou 10 segundos. Todas as medições foram feitas em um ângulo de 90 ° a detecção.

Resultados

Detecção de EGFR nuclear, Src e Stat3 heterocomplexo

Nós procuramos investigar o conjunto complexo de sinalização e as dinâmicas das interacções da STAT3 hiperactivo, EGFR e Src [14], [16], [23] no contexto do fenótipo do cancro pancreático humano. Co-imunoprecipitação (co-IP) com análise mostra imunotransferência, immunecomplex EGFR de Panc-1 ou Colo-357 lisados ​​de célula inteira continham ambos Src e Stat3 (Fig. 1A (i)), Src immunecomplex continha ambos o EGFR e Stat3 (Fig . 1A (II)), enquanto Stat3 imunoprecipitado continha EGFR e Src (Fig. 1A (iii)). Para a especificidade, a IgG de coelho não-específica na imunoprecipitação e análise de imunotransferência por Src, Stat3 ou EGFR não mostrou qualquer proteína detectável (Fig. 1A, IgG, e dados não mostrados), e a análise de imunotransferência realizada na imune precipita na presença dos seus respectivos péptidos de bloqueio (BP) mostrou um bloco completa ou quase completa da detecção imunológica de Stat3, Src ou EGFR, em comparação com os níveis detectados na ausência de péptidos bloqueadores (Fig 1B (i) -. (iii), comparar + BP, painéis inferiores a – BP, painéis superiores). Determinou-se o efeito de ARNsi knockdown de EGFR ou Src na formação do complexo. Co-imunoprecipitação com estudos de imunotransferência de lisados ​​de células inteiras a partir de células Panc-1 mostrou que, quando o EGFR é knockdown por siRNA (Figura 1C (I), banda superior), Src immunecomplex permanece associado com Stat3 (Fig. 1C (i), IP: Src), e vice-versa (Fig 1C (i.), IP: Stat3). Da mesma forma, quando Src está knockdown por siRNA (Fig. 1C (II), banda superior), immunecomplex EGFR permanece associado com Stat3 (Fig 1C (II), IP:. EGFR)., E vice-versa (Fig 1C (II) , IP: Stat3). Mexidos (con) siRNA não tem efeito. Estes resultados indicam que, com respeito ao EGFR, Src e Stat3 complexo heteromérico, proteínas STAT3 permanece associado com Src ou EGFR, respectivamente, sobre o knockdown siRNA de EGFR ou Src.

análises de imunotransferência de imunocomplexos de EGFR (IP : EGFR), Src (IP: Src), e Stat3 (IP: Stat3), ou de não-específica de IgG não-imunoprecipitado preparado a partir de lisados ​​de células inteiras de Panc-1 ou Colo-357 células não transf ectadas (A e B) ou transfectada com o EGFR siRNA, Src ARNsi, ou de controlo (cON) siRNA (C) e sondagem por Src, Stat3 e EGFR na ausência (a e C) ou na presença (B) de Stat3 péptido de bloqueio (Stat3 BP), Src péptido bloqueando (Src BP) ou EGFR péptido de bloqueio (EGFR BP). As bandas correspondentes às proteínas no gel encontram-se; entrada: Excepto quando indicado, representa a imunomancha para a respectiva proteína imunoprecipitada na mesma quantidade de lisado utilizado no ensaio; Os dados são representativos de 3 estudos independentes.

Fizemos a pergunta se o EGFR, Src e Stat3 complexo heteromérica observada estava presente no núcleo. Co-imunoprecipitação com análise de imunotransferência de extractos nucleares mostra que o EGFR immunecomplex continha tanto Stat3 e Src (Fig 2A (i), IP:. EGFR), Src immunecomplex continha tanto Stat3 e EGFR (figura 2A (ii), IP:. Src) , enquanto Stat3 immunecomplex continha ambos o EGFR e Src (Fig 2A (III), IP:. Stat3). Estes dados demonstraram a presença de EGFR, Src e complexo heteromérico Stat3 no núcleo. Para especificidade dos imunorreagentes, as amostras de pull-down IgG de coelho não específicos que foram coradas imunologicamente semelhante não mostrou EGFR detectável, Src ou Stat3 (Fig. 2A, IgG e dados não mostrados). Immunoblotting análise de sondagem para a proteína de ligação a Tata (TBP) confirmou que os extractos utilizados nestes estudos são de origem nuclear (Fig. 2A (iv)). O complexo heteromérico foi validado através da realização de análise de imunoprecipitação sequencial, em que o EGFR immunecomplex (IP: EGFR) foi ainda submetido a uma imunoprecipitação secundário utilizando anticorpo anti-Src (IP: EGFR /IP: Src) e, em seguida, imunotransferidas para EGFR e Stat3. Os resultados destes estudos mostraram a presença de EGFR e Stat3 nos imunoprecipitados sequenciais (figura 2B, IP:. EGFR /IP: Src). Em contraste, IgG de pull-down que foi submetida a imunotransf erência para EGFR ou Stat3 não apresentaram níveis detectáveis ​​(Fig. 2B, IgG), o que confirma adicionalmente a especificidade dos imunorreagentes utilizados.

analisa (A e B) de imunotransferência de imunocomplexos de EGFR (IP: EGFR), Src (IP: Src), Stat3 (IP: Stat3), EGFR /Src (IP: EGFR /IP: Src), ou de não-específico IgG não immuneprecpitate preparadas a partir de extractos nucleares de Panc-1 ou Colo-357 células e sondagem para Stat3, EGFR, Src, ou a proteína Tata de ligação (TBP); e (C), análise de imunotransf erência de membrana (MEM) e as fracções citosólicas (cito) e de Nuclear (Nuc) extractos de células Panc-1 de sondagem para (i) o EGFR, (ii) Stat3 e (iii) de Src. As bandas correspondentes às proteínas no gel encontram-se; entrada: Excepto quando indicado, representa a imunomancha para a respectiva proteína imunoprecipitada na mesma quantidade do extracto nuclear usado no ensaio; IP: EGFR /IP: Src, imunoprecipitação sequencial com anticorpo anti-EGFR e, em seguida, anticorpo anti-Src; Os dados são representativos de 3 estudos independentes.

A presença de EGFR, complexo de Src e Stat3 no núcleo de células de cancro do pâncreas foi adicionalmente investigada por sujeição preparações extracto nuclear para análise de cromatograf ia em coluna de filtração em gel (Superdex200 , limitar a exclusão de 200 kD), como descrito em “Materiais e Métodos”, em conjunto com a análise de imunotransferência. As fracções recolhidas, que mostraram pico de absorvância a 280 nm (dados não mostrados) foram immunoprobed. Os resultados mostraram que a proteína EGFR aparece em primeiro lugar na fracção 23 e está presente em conjunto com Src e Stat3, e as três proteínas são simultaneamente detectados nas fracções 23-29 (Fig. S1A). Os resultados também mostraram proteínas detectáveis ​​STAT3 e Src em fracções 30 a 32 bem após o EGFR foi completamente eluído (Fig. S1A). Análise do parceiro proteína EGFR previamente relatado, RNA helicase A (RHA) [24] também mostraram níveis detectáveis ​​que eram predominantemente nas frações 23 e 24 (Fig. S1A, RHA). Estas fracções foram ainda submetidos a análise de co-imunoprecipitação para validar a presença do complexo. A análise de imunotransferência de EGFR immunecomplex preparados a partir das fracções reunidas 23-27 mostrou ainda a presença de Src e Stat3 (Fig. S1B). O início e a eluição simultânea de EGFR, Src e Stat3 levantam a possibilidade de que cada uma das proteínas é parte de um complexo de proteínas de peso molecular mais elevado, e também que as três proteínas associadas como parte do mesmo complexo, tal como sugerido pela formação immunecomplex . Houve um relatório anterior sobre nuclear EGFR /Stat3 complexo sob condições de estimulação celular por EGF [10]. Por conseguinte, investigado se o EGFR nuclear, Src, Stat3 complexo estava presente constitutivamente (sem estimulação ligante) em células tumorais. análise immunoblotting não detectou níveis apreciáveis ​​de Stat3 ou Src em immunecomplex EGFR ou de Src ou EGFR em Stat3 immunoprecipitate a partir dos extractos nucleares preparados a partir de câncer de mama humano, o cancro do pulmão de células não pequenas humano MDA-MB-231 e, linhas A549 (Fig. S1C), o que sugere uma possibilidade mínima da existência de um EGFR nuclear constitutiva, Src, complexo Stat3 nos dois tipos de células de cancro. Estes estudos mostram em conjunto pela primeira vez que o EGFR, Src e Stat3 formar um complexo heteromérico no núcleo de células de cancro do pâncreas.

Dada a detecção do EGFR, Src e Stat3 complexo em conjunto de células e lisatos nucleares , estávamos interessados ​​para determinar os níveis relativos e os tamanhos de EGFR, Src e Stat3 nas diferentes fracções sub-celulares. Membrana e frações citosólica e nucleares extratos foram preparados a partir de células Panc-1 de acordo com protocolos estabelecidos e que envolvia o uso de 10% de Nonidet P-40 lise e um baixo teor de sal HEPES extração de buffer para extracto citosólico, um alto-sal HEPES extração tampão para extractos nucleares (18, 22), e 0,5% de tampão de SDS para a fracção de membrana. Immunoblotting análise de amostras de proteína total igual a partir das fracções sub-celulares mostra que, com respeito a cada um de a proteína EGFR, Src, ou Stat3, o tamanho é a mesma em que a membrana (MEM), citosólica (Cyto), ou fracção nuclear (Nuc) (Fig. 2C). Os resultados mostram ainda que o nível da proteína total de EGFR é mais alta na membrana, e é maior na fracção citosólica do que no extracto nuclear (Fig. 2C (i)). Em contraste, os resultados mostram que os níveis de STAT3 são mais elevadas na fracção citosólica, e maior no extracto nuclear, em comparação com os níveis associados com a membrana celular (Fig. 2C (ii)). Os resultados para o Src também mostraram diferenças notáveis, com os níveis mais elevados associados à membrana do que ambos o citosólicas e nucleares, os níveis que eram quase idênticos (Fig. 2C (iii)). S2.