Abstract

O objetivo deste estudo foi determinar o efeito citotóxico e apoptóticos de erythrocarpine E (CEB4), um limonóide extraído de

chisocheton erythrocarpus

em carcinoma de células escamosas oral humana. Baseado em brometo de dimetil-2-tiazolil-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT Os ensaios preliminares), CEB4 tratada células HSC-4 demonstraram um efeito citotóxico e inibiu a proliferação celular de um modo dependente do tempo e da dose com um IC

50 valor de 4,0 ± 1,9 ^ M em 24 horas de tratamento. CEB4 também foi encontrada para ter efeitos citotóxicos mínimos sobre a linha celular normal, NHBE com níveis de viabilidade celular mantida acima de 80% depois do tratamento. Anexina V-isotiocianato de fluoresceína (FITC), poli-ADP ribose polimerase (PARP) e fragmentação do ADN de clivagem resultados do ensaio mostraram que CEB4 induz a apoptose mediada por morte celular. resultados de transferência de Western demonstrou que a indução de apoptose por CEB4 pareceu ser mediada através da regulação da via de sinalização de p53 como havia um aumento em níveis de p53 de fosforilação. CEB4 também foi encontrada para regular a proteína pro-apoptótica, Bax, enquanto regulação negativa da proteína anti-apoptótica, Bcl-2, sugerindo o envolvimento da via intrínseca mitocondrial. Redução dos níveis de iniciador procaspase-9 e carrasco caspase-3 zymogen também foram observados após a exposição CEB4, portanto, indicando o envolvimento do citocromo c apoptose mediada. Estes resultados demonstram a capacidade citotóxica e apoptótica de erythrocarpine E, e sugerem o seu desenvolvimento potencial como um agente quimiopreventivo do câncer

Citation:. Nagoor NH, Shah Jehan Muttiah N, Soon Lim C, Na LLA, Mohammad K, Awang K (2011) Regulamento de Efeitos apoptóticos por Erythrocarpine E, um limonóide citotóxica de

chisocheton erythrocarpus

no HSC-4 células humanas cancro oral. PLoS ONE 6 (8): e23661. doi: 10.1371 /journal.pone.0023661

Autor: Paul C. Driscoll, do Instituto Nacional de MRC para a Investigação Médica, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de maio de 2011; Aceito: 22 de julho de 2011; Publicação: 17 de agosto de 2011

Direitos de autor: © 2011 Nagoor et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela Universidade de Malaya Postgraduate Research Grant (PPP) (PS166-2008B), do Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovação Fundo eScience (MOSTI) (12-02-03-2022), a Universidade de Malaya Research Grant (UMRG ) (RG0008 /09BIO), e do Centro de Produtos Naturais Research and Drug Discovery (cenar) Grant (4.911.274). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Vários phytocompounds naturais foram examinados e investigados extensivamente como potenciais agentes anti-câncer. Cerca de 74% das drogas que foram aprovados para o tratamento do cancro foram extraídos a partir de fontes naturais, ou criados por modificações estruturais ou sintetizados e personalizados com base em compostos naturais como modelo [1]. A maioria dos agentes anti-cancerígenos naturais disponíveis até o momento são derivados de plantas, animais, organismos marinhos e microorganismos. Alguns exemplos de compostos actualmente utilizados derivados de plantas com potenciais actividades anti-cancro são o acetato de 1’S-1’acetoxyeugenol e acetato 1’S-1′-acetoxychavicol [2], vincristina, irinotecano, etoposide e paclitaxel, enquanto que a doxorrubicina e bleomicina são compostos microbianas derivadas, e citarabine, derivadas de fontes marinhas [3].

Um subgrupo de compostos naturais conhecidos como limonoids, são altamente oxigenado derivados triterpeno tetracíclico e foram reconhecidos como possuindo actividades biológicas interessantes. Até à data, muitos limonoids foram isolados com uma vasta gama de implicações biológicas, incluindo insectos, anti-feedant características inibidoras de crescimento e agentes anti-inflamatórios [4]. Vários agliconas citrino limonóides tais como limonina, nomilin, obacunone, ácido isoobacunoic e ichangin foram recentemente submetidos a processos de rastreio anti-cancro, e foram encontrados para induzir significativa de glutationa-S-transferase (GST) e a actividade de quinina reductase (QR) na fígado e na mucosa intestinal de ratos e ratazanas, respectivamente, [5] – [6]. Outros relatórios incluem indicações de que misturas de agliconas limonóides com teores de glucósidos limonóides foram equipotentes ao tamoxifeno para inibir a proliferação de células de câncer de mama positivo para o RE, e uma potência ainda maior contra o cancro da mama células independente de estrógeno [7]. Limonóides do extrato etanólico de

Azadirachta indica

(casca de nim, folhas e óleo de semente) também foram encontrados para causar a morte celular das células cancerosas da próstata (PC-3) através da indução de apoptose através de uma redução Bcl-2 expressão níveis correspondentes a um aumento nos níveis de Bax [8].

Atualmente, o processo de apoptose e sua relevância no câncer como o modo preferido de morte devido ao afastamento eficaz de células em apoptose sem provocar inflamação tornou-se um dos os domínios prioritários na pesquisa do câncer [9]. Estudos recentes conduzidos sobre limonoids extraídos de

Citrus aurantifolia

mostrou que a ocorrência de apoptose foi mediada através da indução de caspase-3, impulsionado pela via intrínseca e à libertação de citocromo-C em células de cancro pancreático humano [10 ]. O limonóide natural, E erythrocarpine (CEB4) que foi utilizado no presente estudo, é um A, B, limonóide heptacyclic D-seco com um grupo cinamoílo como a cadeia lateral em C-3 extraído da casca de

chisocheton erythrocarpus

Hiern da família Meliaceae, vulgarmente conhecido como ‘Rongga’ na Malásia. Foi recentemente demonstrado que CEB4 induz a actividade citotóxica contra as células P-388 da leucemia de murino do IC

50 de 16,0 ug /ml [11]. Neste estudo, CEB4 foi investigada por seu potencial para induzir apoptose em HSC-4 carcinoma de células escamosas oral humana (SCC).

Materiais e Métodos

O material vegetal

chisocheton erythrocarpus

Hiern foi coletado de Hutan Simpan Terenas, Kedah, na Malásia. A amostra foi identificado pelo Sr. Teoh Leng Eng do Departamento de Química da Faculdade de Ciências da Universidade de Malaya. Um espécime voucher (KL 4863) foi depositada no Departamento de Química Herbário da Universidade de Malaya.

Reagentes

meio de Dulbecco modificado Eagle (DMEM) e Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI- 1640) com 4,5 g de glucose /L, 300 mg /l de L-glutamina, 2,5% (v /v) de tripsina na solução de sal equilibrada modificado de Hank (HBSS) sem cálcio ou magnésio, soro fetal de bovino (FBS) e todos os antibióticos foram adquiridos a partir de Lonza Inc., EUA. Dimetil-2-tiazolil-2,5-difenil-2H-tetrazólio (MTT) de reagente, anexina V-isotiocianato de fluoresceína (FITC), kit de detecção de apoptose, iodeto de propídio (PI), RNase e ADN SuicideTrack ™ kit Escada Isolamento foram adquiridos a partir de Calbiochem (CA, EUA).

extração e isolamento composto natural

casca do solo secas (1,3 kg) de

chisocheton erythrocarpus

foram extraídos sucessivamente com hexano, diclorometano e metanol. Cada extracto foi então seco

in vacuo

. O extracto de diclorometano seco (4,0 g) foi submetido a fraccionamento por cromatografia em coluna de gel de sílica utilizando uma mistura de solventes de hexano-acetato de etilo. A polaridade da fase móvel foi aumentada gradualmente até 100% de acetato de etilo. A fracção eluída a partir de 30% de acetato de etilo, que continha o composto alvo foi separado por cromatograf ia preparativa de camada fina (TLC) com hexano-acetato de etilo (7: 3). Para se obter erythrocarpine E (4,7 mg)

linhas celulares e condições de cultura

Um conjunto de cinco linhas de células de tumor humano foram usadas neste estudo, que compreende CTH-4, HSC-2 linhas de células de tumores orais e linha celular de tumor do colo do útero Ca Ski obtido a partir do Cancer Research Fundação Initiative (CARIF, Malásia), MCF-7 de adenocarcinoma de mama e carcinoma hepatocelular HepG2 que foram obtidos a partir da Universidade de Malaya Medical Center (UMMC), e as células brônquicas humanas normais epiteliais (NHBE) (Lonza Inc., EUA), utilizado como normais controlo de células. Para a manutenção de rotina HSC-4, HSC-2, células Ca Ski e HepG2 foram cultivadas em DMEM e células MCF-7 foram cultivadas em RPMI-1640, com ambos os tipos de meio suplementado com 10% (v /v) de FBS, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. As células NHBE foram cultivadas com meio basal epitelial brônquico (BEBM) com 10% (v /v) de FBS, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. As células foram cultivadas em monocamadas a 37 ° C em atmosfera humidificada com 5% de CO

2/95% de ar.

MTT de viabilidade celular Ensaio

Os efeitos citotóxicos de CEB4 em todas as linhas celulares foram determinados utilizando o método de ensaio MTT. CEB4 foi dissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO) a uma concentração final de 10 mM. Resumidamente 1,0 × 10

4 células por 100 uL de meio foram semeadas em cada poço de uma placa de 96 poços na presença ou ausência de CEB4 em concentrações finais de 5 uM a 40 uM durante até 24 h. MTT (5 mg /ml) foi adicionado a cada poço (10 uL /​​poço) e as placas foram incubadas a 37 ° C durante 2 h. Após a incubação, o meio foi substituído por 200 ul de DMSO e a absorvância foi medida a 570 nm para cada poço utilizando um leitor de microplacas (Tecan Sunrise®, Suíça).

Anexina V-FITC /PI Análise

detecção de apoptose foi realizada utilizando o kit de detecção de anexina V-FITC /PI apoptose de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, tanto CEB4 tratadas e células HSC-4 e NHBE não tratadas foram recolhidas por tripsinização, lavadas em PBS 1x e coradas com anexina V-FITC e PI. As células foram depois analisadas por citometria de fluxo (BD FACSCalibur ™, EUA) utilizando o software de aquisição e análise BD CellQuest.

ADN A fragmentação de ensaio

O DNA total foi extraído a partir de ambos não tratadas e células tratadas com CEB4 para 12 e 24 h usando o SuicideTrack ™ Kit DNA Isolation acordo com o protocolo do fabricante. Isolado de ADN foi analisada numa base de 1% (w /v) de gel de agarose e corados com brometo de etídio. A fragmentação do ADN foi observada sob iluminação UV utilizando um sistema de documentação de gel (Alpha Inotech, EUA).

Western Blotting

CEB4 tratada células HSC-4 foram cultivadas a uma densidade celular de 80-90 % de confluência, lavou-se com gelo-frio 1x PBS e as proteínas extraídas utilizando o Kit de NE-PER® nuclear e citoplasmática da extracção (Pierce, EUA). As concentrações de proteína foram determinadas usando o ensaio de proteína Bio-Rad DC (Bio-Rad Laboratories, USA). Quantidades iguais de proteína foram sujeitos a 12% de SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose. As membranas foram subsequentemente incubadas com nove anticorpos primários contra β-actina, poli-ADP ribose polimerase (PARP), p53, fosfo-p53, murino duplo minuto 2 (MDM2), Bax, Bcl-2, pro-caspase-3 e pro-caspase-9 . Após lavagem em solução salina tamponada com Tris e Tween-20 (TBST), peroxidase de rábano (HRP) -linked foram adicionados anticorpos secundários e as proteínas ligadas foram detectadas por meio de sinais de quimioluminescência aumentada utilizando filmes de raios-x. intensidades relativas de todas as bandas foram quantificados usando software de análise de imagem (NIH ImageJ v1.43, National Institutes of Health, EUA).

Análise Estatística

Todos os resultados foram expressos como média ± D.P.. dos dados obtidos a partir de três experiências independentes. A significância estatística entre vários grupos foi determinada utilizando-se ANOVA. Diferenças significativas foram considerados como p≤0.05.

Resultados

Isolamento e Caracterização de Erythrocarpine E (CEB4)

CEB4 (erythrocarpin E) foi isolado como um pó branco amorfo. A fórmula molecular foi de C

36H

40O

10, que foi determinada a partir da [M + H]

+ pico a m /z 633,2703 na espectrometria de massa de bombardeamento atómico rápido de alta resolução (HRFABMS) . As absorções de infravermelhos em 3413 cm

-1 e 1700-1730 cm

-1 indicou a presença de hidroxilo e vários grupos carbonila. Na

espectro de 1H NMR, foram identificados picos típicos associados com esqueleto limonóide. A cadeia lateral furano em δ 7,64 (

s

), δ 6,29 (

br s

), e δ 7,30 (

d

, J = 1,5 Hz) foram atribuídos a H-21, H-22 e H-23, respectivamente. Sinais decorrentes de prótons metino oxigenados de H-3 em δ 4,91 (

d

, J = 10,2 Hz) e H-17 no δ 5,46 (

s

) foram facilmente diferenciado e atribuída com base em a multiplicidade de sinais. Por outro lado, a ocorrência de uma ponte de oxigénio que liga o C-1 a C-29 foi considerada rara [11]. Os protões de metileno diasterotopic isolados de H

2-29 foram detectados como um par de dupletos a 3,46 e δ δ 3,88, com uma constante de acoplamento de 9,3 Hz. Na subestrutura álcool alílico, o sinal olefínica foi encontrada em δ 5,53 (dd, J = 1,7, 7,1 Hz). A cadeia lateral de cinamato em C-3 foi confirmada pela presença de cinco protões aromáticos em 7,10-ô 7,20 e a característica sinais dupletos na região δ de H-2 ‘e H-3’ em δ 6,25 (

d

, J = 16,0 Hz) e 7,58 δ (

d

, J = 15,7 Hz). O stereostructure relativa de erythrocarpin E foi estabelecida através de espectroscopia de efeito Overhauser nuclear (NOESY). A estrutura química do CEB4 é mostrado na Figura 1.

CEB4 inibe a proliferação de HSC-4 Células

ensaios MTT foram conduzidos para avaliar os atributos citotóxicas e concentração inibitória (IC

50) de CEB4 em cinco tumores humanos e linhas celulares normais NHBE. Os resultados indicaram que CEB4 induz citotoxicidade de uma forma dependente da dose e do tempo ao longo de um regime de tratamento de 40,0 uM e 24 h de exposição (Fig. 2A e 2B). efeitos citotóxicos mínimas foram observadas em células NHBE, onde, aproximadamente, 20,0% de morte foi observado em condições de tratamento semelhantes, em oposição a 95% de morte em HSC-4 células com o menor IC

50 valor registado de 4,0 ± 1,9 uM entre todas as células linhas testadas (Tabela 1). A viabilidade das células tratadas com DMSO sem CEB4 foram insignificantemente afectada ( 1,0%) (Fig. 2A e 2B) excluindo assim o envolvimento de citotoxicidade induzida por solvente. Ambos os ensaios dependentes do tempo e doses apoiou a necessidade de investigar mais profundamente os efeitos apoptóticos de CEB4 e seu potencial como uma droga anti-tumor para o tratamento de câncer oral. Todas as seguintes experiências foram realizadas com base em IC

50 valores obtidos como dos seus dados de MTT presentes, e estão resumidos na Tabela 1.

(a) Dose gráfico de ensaio de MTT dependente de 24 h de CEB4 exposição. gráfico MTT dependente (B) Tempo depois do tratamento com 40,0 mM CEB4. Todos os resultados foram expressos como a percentagem total de células viáveis ​​com DP ± média de três determinações independentes. controlos do solvente utilizando DMSO foi realizada em HSC-4 células como representante de todas as outras linhas celulares.

CEB4 induz a apoptose morte celular mediada no HSC-4 Células

próxima determinar se os efeitos citotóxicos CEB4 foram mediadas por apoptose. Um aumento na coloração celular com FITC-conjugado anexina-V serve como um marcador precoce de apoptose. As células foram coradas com PI, simultaneamente, para investigar a perda de integridade da membrana celular. Este procedimento de coloração dupla distingue células em apoptose estágio inicial (anexina V-positivo) a partir de células em apoptose fase tardia (anexina V-positivo, PI positivo). O tratamento de células SH-4 do IC

50 concentrações de CEB4 foi encontrada para induzir a morte celular por apoptose por meio da observação de uma mudança na população de células viáveis ​​a partir do início de fase tardia de apoptose, seguida de necrose secundária (Fig. 3B). A percentagem de células viáveis ​​diminuiu de 99% para 51%, enquanto que as células apoptóticas fase inicial e final aumentou para 21% e 45%, respectivamente. A percentagem total de células apoptóticas HSC-4 foi de 63% após 12 h. Não foram observadas mudanças populacionais nas células NHBE após o tratamento CEB4 semelhante (Fig. 3A).

células não tratadas (painel superior) e células tratadas (painel inferior) após o tratamento CEB4 no IC

50 concentrações para 12 h. Quadrantes foram concebidos como se segue, I: células não-coradas indicando células viáveis; II: anexina V-FITC células indicando apoptose precoce coradas; III: anexina V-FITC e PI, indicando células coradas tarde apoptose; e IV: PI células indicando necrose secundária coradas. Todos os gráficos de pontos são uma representação de populações de células iguais (n = 10.000).

CEB4 Induz Endonuclease- e Caspase-Mediated clivagem de DNA e PARP Respectivamente

Devido à maneira diversa e marcas, em que o processo de apoptose pode ser manifestada, também examinámos a indução de apoptose em células SH-4 através da ocorrência de fragmentação do DNA e de clivagem de proteínas de PARP. Observou-se que o ADN extraído de células HSC-4 não tratados não mostrou nenhuma fragmentação, enquanto o ADN a partir de células tratadas com CEB4 HSC-4 (12 e 24 h) mostrou DNA laddering com intervalos de aproximadamente 200 pb, presumivelmente como o resultado de uma acção de endonuclease nos locais entre nucleossomas (Fig. 4A). O suposto envolvimento de ativação da caspase-3 na apoptose induzida por CEB4 também foi validado através da expressão e da degradação de uma proteína nuclear, PARP. A clivagem proteolítica da PARP de comprimento completo a partir de um polipéptido de 116 kDa para um fragmento de 85 kDa é um marcador típico para o início da apoptose, e foi observada de um modo dependente do tempo em HSC-4 células tratadas com CEB4 (Fig. 4B). Por conseguinte, foi confirmado o efeito de indução de apoptose em células de CEB4 HSC-4.

No entanto, não há fragmentações distintas foram observadas na pista 1, indicando a ausência de apoptose, por oposição a linhas 2 (12 h) e 3 ( 24 h). degradação (B) PARP foi observada em diferentes períodos de incubação CEB4. Quantidades iguais de proteínas celulares foram sujeitos a SDS-PAGE, e a degradação de PARP a partir da sua forma nativa (116 kDa) para a forma clivada (89 kDa) foi detectado por análise de Western blot.

A expressão de p53 e outros p53-relacionados apoptóticos proteínas

a análise Western blot de CEB4 trataram células HSC-4 foi realizado para examinar o estado de p53 e proteínas de apoptose relacionada com o p53. Os resultados mostraram que após o tratamento CEB4, p53 fosforilada foi elevada, enquanto o nível do inibidor de p53, MDM2, diminuiu ao longo de 12 h (Fig. 5a). O nível total p53 foi consistente em células HSC-4 e manteve-se inalterada após a exposição CEB4. os níveis da proteína Bax pró-apoptótica de proteínas de expressão aumentada após 12 horas de tratamento CEB4. Por outro lado, o nível de proteína anti-apoptótica de Bcl-2 foi encontrada para reduzir concomitantemente com a mudança de Bax (Fig. 5B). Investigou-se também as caspases a jusante, e descobriu que a quantidade de iniciador procaspase-9 e executor da caspase-3 zimogénio diminuiu simultaneamente após exposição CEB4, indicando a clivagem activado de pro-caspase-9 e o zimogénio da caspase-3 (Fig. 5C).

As células foram incubadas com CEB4 durante 6 e 12 horas, colhidas em tampão de lise e sujeita a SDS-PAGE. Os níveis de expressão das proteínas foram analisados ​​por análise de Western blot e quantificada utilizando o software ImageJ empregando β-actina como um controlo de normalização. (A) A análise dos níveis de p53 e MDM2 de inibidor. (B) Análise de Bcl-2 e pró-apoptóticas níveis de proteína Bax anti-apoptóticas. (C) Análise de iniciador procaspase-9 e caspase-3 efectora zimogénio níveis. A quantificação dos níveis de proteína normalizados contra β-actina são mostrados em painéis à direita.

Discussão

O processo de apoptose tornou-se a rota desejada para as células cancerosas a morrer, e é normalmente caracterizada por alterações morfológicas e bioquímicas, tais como formação de bolhas de membrana, retracção celular, condensação de cromatina, a activação de cascatas de proteases tais como caspases e endonucleases, a clivagem de PARP [12] e fragmentação de ADN genómico [13]. A morte celular apoptótica é favorecida porque não envolve a libertação repentina de mediadores pró-inflamatórios, tal como no processo de necrose [14]. A indução de apoptose e inibição da proliferação de células cancerígenas foram utilizadas como referência na avaliação das actividades anti-cancro fitoquímicos, onde, no passado, muitos agentes quimioterapêuticos têm sido encontrados para efectuar a perturbação na progressão do ciclo celular ou a indução de apoptose em células tumorais [15].

neste estudo, a partir de provas dos ensaios de viabilidade celular baseado em MTT mostraram que erythrocarpine e (CEB4) induz tanto tempo e efeitos citotóxicos dependentes da dose em todas as linhas celulares de tumores humanos testadas, sendo essa eficácia mais elevada em células HSC-4. Esta observação convida posterior investigação dos efeitos apoptóticos de CEB4 e o seu potencial como uma droga anti-tumoral para o tratamento de cancros orais. Nesta fase, a origem epitelial-like de NHBE que mantém semelhanças com o HSC-4 serve apenas como uma inicial

in vitro

controle para fins de rastreio de drogas, enquanto os efeitos colaterais fisiológicos reais de CEB4 só pode ser avaliada através

in vivo

estudos. Os efeitos citotóxicos mínimas de CEB4 em células NHBE (onde os níveis de viabilidade celular permaneceu acima de 80% após tratamento) fornecer uma indicação preliminar de segurança para o seu desenvolvimento como um agente quimioterapêutico. Foram também realizados três tipos de ensaios para confirmar o mecanismo de morte celular em células de CEB4 HSC-4: anexina V-FITC, a clivagem de PARP e ensaios de fragmentação de DNA. Os resultados combinados destes testes indicam que a citotoxicidade induzida por resultados CEB4 da indução de apoptose.

A próxima pergunta pertinente seria a de determinar como é a apoptose dependente de CEB4 mediada no nível molecular? Dois principais vias de morte celular programada pode ser distinguidos: a vias intrínseca e extrínseca. A acção da p53 é indirectamente relacionada com a via de morte celular intrínseca onde estimula uma vasta rede de sinais, que actua em parte, através da cascata de sinalização da família Bcl-2 [16]. Relatos anteriores indicaram que as mutações em p53 desempenham um papel essencial na iniciação do cancro e são muito proeminente na sua ligação aos cancros, tais como cólon, pulmão, esófago, da mama, fígado, cérebro, tecidos reticuloendoteliais e tecidos hematopoiéticos [17].

os resultados de Western blotting demonstrar um aumento no nível de p53 fosforilada e uma redução do seu inibidor, MDM2 sugerindo que o modo de indução de apoptose por CEB4 é mediado através da via intrínseca. Isto é ainda reforçado por observações sobre proteínas mitocondriais, onde um aumento dos níveis de proteína pró-apoptóticos, Bax e redução dos níveis de proteína anti-apoptóticos, Bcl-2 foi visto. A relação entre a Bcl-2 e Bax regulada a indução de apoptose por dimerização com o outro, provocando assim a libertação de citocromo c das mitocôndrias [18] – [19]. Além CEB4, outros compostos naturais que foram exibidos efeitos sobre a indução da apoptose mediada por p53 foram curcumina, resveratrol, antocianinas e capsaicina [20]. Estudos anteriores sobre compostos limonóides à base de

Citrus aurantifolia

também foram mostrados para induzir a apoptose através de p53 inactivação [10], [20].

O mecanismo de ação de drogas citotóxicas não unicamente incluem funcionalidades tais como encolhimento celular e fragmentação do ADN, mas também a activação de moléculas de p53 de sinalização que conduzem à activação de uma cascata de caspase acção [21]. cascatas de caspase pode ser acionado por meio de dois ramos principais, através de receptores de morte de FNT-superfamília da superfície celular e a proteína fulcral do adaptador Fas activado domínio de morte (FADD), levando à activação de caspase-8 e, finalmente, caspase-3, ou através da libertação de citocromo c (CYTC) das mitocôndrias, resultando em caspase-9 actividade e acção subsequente, de caspase-3. Caspase-3, representa um ponto de convergência entre as duas rotas, e por sua vez induz clivagem PARP, as quebras de DNA cromossômico e, finalmente, a ruptura da célula em corpos apoptóticos [22]. Os nossos resultados sugerem que CEB4 exerce os seus efeitos apoptóticos, agindo sobre as caspases-9 e -3, onde o nível de comprimento completo pro-caspase-9 e caspase-3 zimogénio é diminuída por exposição CEB4, resultando em formas clivadas, activados de caspase-9 ( 37 kDa e 10 kDa) da caspase-3 (17 kDa e 12 kDa). No entanto, a transdução do sinal apoptótico que envolve a sinalização do receptor de morte resultante de iniciador activado caspase-8, que por sua vez activa o zimogénio da caspase-3 não pode ser excluída. A mediação da morte celular através deste percurso poderia explicar a observação de uma diminuição precoce ( 6 h) na procaspase-3 níveis antes de qualquer modificação em Bcl-2 e Bax que ocorrem em 12 h (Fig 5b e 5c.). Isso também pode significar que o envolvimento da via intrínseca serve como um passo de amplificação para a morte inicial sinalização através da via extrínseca após a exposição CEB4.

Nós concluímos que CEB4 induz citotoxicidade através da morte celular por apoptose no HSC-4 câncer bucal células, e que a indução de apoptose é provocada pela activação do p53, o que desencadeia a via intrínseca através de Bcl-2 e Bax, e, finalmente, através de caspase-9 e -3 activação. Nossos dados indicam o potencial para o desenvolvimento de CEB4 como um novo potencial da droga anti-câncer contra o cancro oral humana, embora novos trabalhos sobre

in vivo

efeitos de segurança e farmacocinética é necessária antes CEB4 pode ser completamente avaliada em uma clínica definição.

Reconhecimentos

gostaríamos de reconhecer Datuk Prof. Dr. A. Hamid A. Hadi, do Centro de Pesquisa Produto Natural e Drug Discovery, Universidade da Malásia por sua contribuição para o a descoberta do composto CEB4. Além disso, a Sra Norahayu Othman e Ms. Yap Seow Hui, do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade de Malaya por suas contribuições durante a análise de triagem de citotoxicidade e caminho desta investigação.