Abstract

O receptor de andrógeno (AR) continua a ser um importante contribuinte para a evolução neoplásico do câncer de próstata (PAC). progressão PAC está ligado a várias mudanças de mutações somáticas AR que dotam sobre as propriedades AR dramáticas ganho de função. Uma das mutações somáticas mais comuns identificadas é Thr877-para-Ala (T877A), localizado no domínio de ligação ao ligando, que resulta em um receptor capaz de se ligar promíscuo e a activação por uma variedade de hormonas e ligandos esteróides incluindo estrogénios, progestinas, glucocorticóides, e vários anti-androgénios. Em uma tentativa de definir ainda mais somáticas mutado propriedades AR ganho de função, como consequência da sua ligação promíscua ligando, realizamos uma abordagem de análise proteômica /rede para caracterizar a interactome proteína do T877A-AR mutante em células LNCaP sob oito diferentes tratamentos específicos de ligando (dihidrotestosterona, mibolerona, R1881, testosterona, estradiol, progesterona, dexametasona, e acetato de ciproterona). Ao estender a análise dos nossos complexos multi-ligante do T877A-AR mutante observamos enriquecimento significativo de complexos específicos entre tumores prostáticos normais e primário, que foram ainda correlacionados com os resultados clínicos conhecidos. Uma análise mais aprofundada de certos complexos T877A-AR mutantes mostraram preferências populacionais específicos que distinguem a doença prostática primária entre brancos (não-hispânica) vs. homens afro-americanos. Além disso, estes complexos AR-de proteínas relacionadas ao câncer demonstrada preditivo de sobrevivência resultados específicos para PAC, e não para de mama, pulmão, linfoma ou cânceres de meduloblastoma. Nosso estudo, por dados de acoplamento gerados pelos nossos proteómica para análise de redes de amostras clínicas, ajudou a definir caminhos biológicos reais e inovadoras em sistemas complexos AR ganho de função complicadas

Citation:. Zaman N, Giannopoulos PN , Chowdhury S, Bonneil E, P Thibault, Wang E, et al. (2014) proteômica-Coupled-Rede Análise de T877A-receptor andrógeno interactoma pode prever Clínica Prostate Cancer Outcomes entre White (não-hispânica) e grupos afro-americanos. PLoS ONE 9 (11): e113190. doi: 10.1371 /journal.pone.0113190

editor: Mohammad Saleem, Instituto Hormel da Universidade de Minnesota, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de maio de 2014; Aceito: 04 de setembro de 2014; Publicação: 19 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zaman et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados de proteômica apresentados no manuscrito, serão carregados na nossa base de dados receptor AR (https://androgendb.mcgill.ca/) como um arquivo do Excel, em conjunto com as figuras suplementares /Mesas associados a este manuscrito.

Financiamento: Este estudo foi apoiado pelos Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde (https://www.cihr-irsc.gc.ca) subvenção de funcionamento MOP-106.477 (MT, MP, EW). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

avanços significativos na metodologia de sequenciamento genômico têm permitido uma melhor avaliação da extensão de mutações somáticas acumulados em neoplasias comuns [1], [2]. Mais importante é a constatação de que os tumores variam significativamente geneticamente a partir de um paciente para outro e dentro de um paciente singular existe extensa heterogeneidade inter-tumoral e intra-heterogeneidade tumoral [3], [4], [5]. Um número significativo dessas alterações genéticas são mutações missense que provocam novas propriedades ganho de função que prestam um determinado gene pró-ativa para a evolução tumoral e são referidas como mutações driver. Uma melhor compreensão destas novas propriedades conduziria a uma melhor interpretação dos oncogénese, mas isto é difícil devido a um grande número de mutações diferentes, a natureza imprevisível de propriedades de ganho-de-função associada a mutações somáticas, a possível grande interacção entre os diferentes mutantes somáticas e os processos de seleção que se seguiram iniciadas pelo microambiente ou pela própria terapia. Tais “sistemas” complexos exigem uma abordagem mais global “omics” e mais análise de rede, ao invés da abordagem clássica único gene, para angariar informações mais crítico relacionado com a evolução neoplásica.

De acordo com a paisagem mutacional recém-definido de tumores, cancro da próstata (CaP) também tem extensas alterações genéticas que variam de mutações missense individuais, cópia variação do número, variantes de splicing, rearranjos genéticos e alterações de ADN curtas em um grande número de genes [1], [2], [6] [7], incluindo o receptor de andrógeno (

AR)

gene. Ele não é inesperado que as mutações AR pode adicionar ao repertório da proteína de novos e poderosos funções [8], [9] e estes ganho-de-função de atributos pode permitir que a AR para funcionar de um modo aberrante. Um número de somáticas mutantes CaP AR, especialmente a ocorrência mais comum mutação CaP AR, Thr877Ala (T877A), têm propriedades únicas de ganho-de-função: eles podem ligar-se várias classes de esteróides promiscuamente (por exemplo, estrogénios, progesterona, glucocorticóides), com a transactivação subsequente , ou ser hyperactivated por ligandos normais [10]. tratamentos anti-andrógenos clássicos [por exemplo, flutamida, acetato de ciproterona (CPA) ou bicalutamida] geraram, através de pressão de seleção, mutações somáticas AR específicas, por exemplo, Trp741Cys (W741C) e His874Tyr, resultando em ARs subversivos que são totalmente ativo com estas drogas [11]. Mesmo a próxima geração de drogas anti-andrógeno exemplificadas por enzalutamida (MDV-3100) tem provocado mutações AR específicas [12], [13]. Esta observação também se correlaciona com uma diminuição dramática nos níveis de PSA subsequentes a retirada anti-andrógeno [11]. As mutações T877A-Ar, em que está também presente na linha celular de cancro da próstata LNCaP, tem sido relatada por vários indivíduos para ocorrem em 25 a 33% dos tumores resistentes castrar-ou independente de androgénios [11], [14], [15] , [16].

recentemente, o nosso próprio trabalho sugere fortemente que a função de AR se estende para além do seu papel clássico como um fator de transcrição e inclui as novas propriedades de splicing de RNA, a metilação do DNA, a interação proteossómica e tradução de proteínas no polirribossomas-se [17]. Além disso, a grande diversidade funcional dos componentes de complexos AR exemplifica a natureza complexa das interacções proteína-proteína associadas à geração da saída biológica AR apropriado. Estas funções romance AR pode mediar processos celulares e oferecer novas áreas em que os mutantes somática AR PAC possa “indulgente” e promover CaP oncogênese.

Em uma tentativa de descrever as propriedades novas ganho de função associadas a mutante CaP ARs , foi realizada uma análise de rede proteômica acoplado. Várias investigações espectroscopia proteômica em massa foram realizados a fim de caracterizar plenamente a composição de proteína de T877A-AR “complexos” (interactome) sob diferentes classes de hormona /condições ligando refletindo a promiscuidade de ligação do ligando associado com T877A. Criticamente, ARs CaP mutantes podem ter sua própria capacidade única de se submeter e definir novas interações. O acoplamento dos dados gerados pelos nossos proteômica tela para análise biologia sistema tem sido útil na definição de endpoints biológicos reais e inovadoras em sistemas complexos AR, dentro de uma perspectiva clínica da doença.

Materiais e Métodos

as linhas celulares

as linhas celulares de cancro da próstata LNCaP foi obtido a partir da American Type Culture Collection (ATCC), Rockville MD.

cultura de células, hormônios esteróides, ligantes e experiências de estimulação

a linha de células de LNCaP foi cultivada em RPMI 1640 suplementado com FBS (10%), a 37 ° C, 5% de CO

2 em frascos T-75 de cultura de plástico. Uma vez confluentes, o meio foi mudado para RPMI suplementado com 10% de carvão-dextrano despojado de FBS e incubou-se durante um adicional de 24 h. No dia seguinte, o meio foi mudado para RPMI fresco /carvão-dextrano despojado de FBS durante a noite para estudos de hormona /estimulação ligando para um período de 18 horas. Esteróides hormonas foram utilizados nas seguintes concentrações finais, 10 nM de di-hidrotestosterona (DHT), 10 nM de mibolerona (MB), 10 nM R1881, 10 nM de testosterona + 10 uM finasterida, 10 nM 17β-estradiol, 10 nM de progesterona, 10 nM de dexametasona, e 100 nM acetato de ciproterona (CPA).

a purificação por afinidade e Western blot

lisados ​​de células inteiras

LNCaP foram preparadas pelo método de congelamento-descongelamento com tampão 1X PDG contendo o hormônio apropriado /ligando [18] . Os lisados ​​foram então transitam para α-AR co-imunoprecipi [ar (N20), Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA] a noite a 4 ° C. Um 50% de Proteína A-Sepharose suspensão foi adicionado a cada amostra e incubou-se à temperatura ambiente durante 90 min. As esferas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM de NaCl, 1% Tween 20) e ressuspenderam-se em 100 mL de 1X SDS tampão de carga de gel. As amostras foram desnaturadas por fervura, e resolvido num gel de 10% SDS-poliacrilamida antes de coloração com prata de acordo com as instruções do fabricante (Biorad) ou transferência para uma membrana de nitrocelulose para análises de Western blot utilizando AR anticorpo monoclonal (441) (NeoMarkers, Fremont, CA) .

a espectrometria de massa e péptido comparação

TCEP (Tris (2-carboxietil) fosfina) foi adicionado às amostras de proteína para alcançar a concentração de 5 mM. As amostras foram incubadas a 37 ° C durante 30 min. Foi adicionado um ug de tripsina e as amostras digeridas durante a noite a 37 ° C, em seguida secou-se para baixo num SpeedVac e ressolubilizado em 50 ul de ácido 5% de ACN /ácido fórmico (FA) de 0,2%.

Todos MS foram realizada utilizando um espectrómetro de massa híbrido LTQ-Orbitrap com uma fonte de nanoelectrospray ião (ThermoFisher, San Jose, CA) acoplado com uma bomba de 2D nano-LC Eksigent (Dublin, CA) equipado com um Finnigan AS amostrador automático (Thermo Fisher, San Jose, CA ). Vinte pi de cada amostra foi injectada sobre uma pré-coluna C18 (0.3 mm d.i. x 5 mm) e amostras separadas de uma coluna analítica C18 (150 um de d.i. x 100 mm) utilizando um sistema de Eksigent nanoLC-2D. Um gradiente de 76 min a partir de (A /B) 10-60% (A: ácido fórmico 0,2%, B: acetonitrilo /0,2% de ácido fórmico) foi usado para eluir os péptidos com uma taxa de fluxo fixado em 600 nL /min. O MS espectros convencional (varredura de pesquisa) foram adquiridos no modo de perfil com uma resolução de 60.000 a m /z 400. Cada espectro MS completo foi seguido por três espectros MS /MS (quatro eventos de verificação), onde as três mais abundantes íons de cargas múltiplas foram seleccionados para o MS /MS sequenciação. Tandem MS experiências foram realizadas usando a dissociação induzida por colisão na armadilha de iões linear.

As comparações de abundância de péptidos nos diferentes paradigmas experimentais foram obtidos usando proteómica quantitativos livre do rótulo [19], [20]. Resumidamente, os ficheiros de dados brutos do software Xcalibur foi convertido em ficheiros de mapas de péptidos representando todos os iões de acordo com os seus correspondentes valores de m /z, tempo de retenção, intensidade e estado de carga. Peptide abundância foi então avaliada usando o “top pico” valores de intensidade. Intensidades de péptidos que eluem em várias fracções foram somadas, e apenas um coeficiente de variação (CV), que permite a transmissão iónica máxima foi considerada para calcular a intensidade péptido. Clustering de mapas de péptidos de diferentes conjuntos de amostras foi realizada no momento da entrada associada Mascot-péptido utilizando agrupamento hierárquico com tolerâncias específicas (+/- 15 ppm de massa dos péptidos e de +/- 1 min de tempo de retenção de péptido). A normalização do tempo de retenção foi realizada no cluster de péptido inicial usando uma correcção dinâmica não linear e que limita a distribuição do tempo de retenção de menos do que 0,1 minutos, em média. mudanças de reprodutibilidade em abundância em toda condições foi determinada usando um homocedástico bicaudal

t

-test na amostra replica para identificar grupos de peptídeos com

p

-Valores 0,1 com mudanças vezes maior do que 7 padrão desvios. clusters de peptídeos que cumprem estes critérios de selecção foi inspecionado manualmente para validar a identificação e mudanças em abundância. análises de expressão foram realizados em proteínas identificadas por pelo menos duas sequências peptídicas diferentes. valores de expressão e desvio padrão relativo foram obtidas pela média das diferenças de intensidade e desvios-padrão dos quatro trios de peptídeos mais intensos após a remoção de grupos de peptídeos periféricas. dados de proteômica normalizados podem ser encontrados na Tabela S1.

Os conjuntos de dados para a construção de rede e análise de expressão gênica

Todos os interagentes AR foram dadas IDs de genes NCBI. informações de interação proteína humana foi compilado a partir de diversas fontes de dados e bancos de dados de anotação como a interação biomolecular banco de dados de rede (BIND), o banco de dados de proteínas que interagem (DIP), proteína humana Banco de Dados de Referência (HPRD), intacto, e banco de dados de interação molecular (MINT), a maioria dos quais contêm curadoria dados de interação e dados de alto rendimento. Geramos um metadados de interações proteína através da fusão destes dados com a nossa própria rede de sinalização humana curadoria manualmente contendo 4.000 proteínas e 22.000 relações de sinalização [21], [22], [23].

A rede de interação proteína foi construído para cada hormona usando nossa rede de interação da rede de sinalização humana e proteína e proteína curadoria manualmente. Nós apenas proteínas consideraram que eram ≥2.5 vezes a abundância condição hormonal (sinal) vs. a abundância de controle do veículo a partir do conjunto de dados MS, para ser considerado significativamente presente. Na rede, um nó de ligação e representam a interacção proteína e, respectivamente. Para encontrar as regiões altamente interligados da rede, para cada hormona, que teve cada par de interacção com base no número de nódulos vizinhos que têm em comum. Isso nos deu uma matriz com todas as pontuações entre todos os pares de interação. agrupamento hierárquico foi aplicada à matriz e uma pontuação limiar calculado com base na densidade partição que nos permite identificar as regiões altamente interconectadas (clusters) para cada uma das redes hormonais.

Em seguida, usamos esses aglomerados de proteína e identificados GO-termos (https://www.geneontology.org/) que estão significativamente associados com cada um dos conjuntos de proteínas (p-valor 0,05, hiper-geométrica). Nós também utilizado Gene Set Análise de Enriquecimento (GSEA) percursos definidos e executados GSEA se 25% dos genes do cluster da proteína estavam na via. Para os caminhos e ir-termos que foram significativos a partir dos resultados GSEA (valor-p 0,05), que também fez a análise de sobrevivência. Usamos genes associados a estes go-termos e realizou GSEA usando GSE21034 [24].

extrações de RNA e análise de microarray

células LNCaP foram estimulados com o painel de ligantes como descrito acima, e RNA total extraiu-se utilizando TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA). As amostras de RNA foram então processados ​​por Genome Quebec Innovation Centre (Universidade McGill, em Montreal, Canadá), para a análise microarray com Illumina Humano HT-12 Expressão Beadchip v4 (Illumina, San Diego, CA). Os dados em bruto foi processado usando R [22], [25].

Dois heatmaps globais foram feitas. O primeiro mapa de calor inclui o gene mais diferencialmente expressos para cada hormona usando o teste t (p-valor 0,05), em que cada hormona é comparado com todos os outros. A segunda heatmap inclui os top 10, 20, 50 e 100 genes com maior variância. O teste t encontra os genes mais diferencialmente expressos que são específicos para cada hormona, enquanto que a variação nos ajuda a observar genes que são diferencialmente expressos em vários hormônios. análise GSEA foi realizada utilizando GSE21034 [24], dos 10, 20, 50 e 100 genes que apresentaram maior variação.

Progression e Análise de Sobrevivência

perfis de expressão gênica, os dados de sobrevida do paciente, e informações demográficas para as 267 amostras de próstata clínicos (29 normal, 181 primária e 37 tumores metastáticos) foram obtidos a partir GSE21034 [24]. conjuntos de dados mama, pulmão, linfoma e meduloblastoma foram obtidos do Instituto Broad (https://www.broadinstitute.org/cgi-bin/cancer/datasets.cgi) [26]. Foram examinados os valores prognósticos pós-prostatectomia radical de uma sub-rede baseada em perfis de tumores primários de expressão gênica, e realizada análise de Kaplan-Meier através da aplicação do teste de Cox-Mantel-rank login usando R, como descrito anteriormente [22], [25]. Se o valor p é menor que 0,05, a sub-rede foi tratada como estatisticamente significativo para classificar os tumores em tumores metastáticos e não metastáticos. Nós estratificada recorrente contra o câncer CaP não recorrente com base nos seguintes critérios: PSA (≥4 ng /mL), Gleason (≥7), Tumor Stage (≥3) e combinado (PSA + Gleason + Tumor)

.

Preparação estrutura para a simulação MD

a estrutura de cristal de DHT (1I38) e CPA (2OZ7) ligado a T877A mutante AR-LBD e testosterona (2AM9) e R1881 (1E3K) vinculado ao tipo selvagem AR LBD estão disponíveis na Protein Data Bank (PDB). Os complexos de diferentes ligandos ligados ao mutante T877A AR-DNV foram preparadas de outro modo para simulações MD utilizando Xleap [27] em AMBER10 [28]. O campo de força AMBER generalizada (GAFF) e ff99SB [29] parâmetros foram utilizados por oito ligantes diferentes. O complexo foi solvatado em uma caixa de água TIP3P [30] octaedro truncado. A distância entre a parede da caixa e o átomo mais próximo do soluto foi de 12,0 Á, e a distância mais próxima entre os átomos de soluto e de solvente foi de 0,8 Å. Os contra-iões (Cl

-) foram adicionados para manter a electroneutralidade do sistema. Cada sistema foi minimizada, em primeiro lugar através da aplicação de restrições harmônicas com constantes de força de 10 kcal /mol /A

2 para todos os átomos de soluto; segundo, por aquecimento 100-300 K mais de 25 ps em conjunto canónico (NVT); e, finalmente, equilibrando para ajustar a densidade do solvente sob pressão 1 atm mais de 25 ps na simulação isotérmica-isobaric conjunto (TNP). Os apoios de harmônicas foram então gradualmente reduzido a zero, com quatro rodadas de 25 ps simulações NPT. Após a simulação de 25 ps adicional, a 15 ns corrida de produção foi obtida com instantâneos recolhidos a cada 1 ps. Para todas as simulações, foram utilizados 2 fs passo de tempo e 9 um não-ligado cut-off. A partícula de malha Ewald método [31] foi usado para tratar a eletrostática de longo alcance e vínculo comprimentos envolvendo ligações a átomos de hidrogênio foram constrangidos pela trepidação [32].

Resultados

rede comparativo caracterização de T877A complexos -ar: estudos interactome e expressão gênica

a nossa capacidade de capturar ambos e full-length unliganded do tipo selvagem AR por cromatografia de afinidade em condições fisiológicas anteriormente nos permitiram seguir uma abordagem proteômica, a fim de ligando ligado- caracterizar os componentes de complexos AR de tipo selvagem. Isto foi feito por sujeição destes complexos para a digestão tríptica seguido por espectrometria de massa (MS) para atribuir a identificação de proteínas, na criação de efeito interactoma AR iniciados pela ligação do ligando [33]. Para os nossos dados MS, um método quantitativo sem etiqueta já foi aplicada através dos diferentes paradigmas experimentais (ver Materiais e Métodos) [19], [20], o que nos permitiu obter dados relacionados com a identificação de proteínas, juntamente com abundância, assim, permitindo comparações directas entre condições de estimulação.

o objetivo condições de estimulação hormonal diferenciais nos permitirá determinar se a doença etiologia da mutação T877A-AR é dependente de estado ligando e co-fator. Portanto, utilizou-se células LNCaP que expressam endogenamente a mutação T877A-AR para caracterizar os complexos de proteína de interactoma promíscuos ligandos, sob diferentes condições hormonais, a fim de realçar os possíveis complexos distintos que podem ser ligados a progressão da doença. As células LNCaP foram estimuladas com os seguintes hormonas, quatro andrógenos: DHT, mibolerona (MB), R1881, ou testosterona (na presença de finasterida (para prevenir a conversão de testosterona em DHT), ou 17β-estradiol, progesterona, dexametasona, ou o actetate anti-androgénio de ciproterona (CPA), isoladamente ou com controlo sem ligando /álcool-veículo. hormona estimulada complexos T877A-AR foram imunopurificada com um anticorpo AR específica N-terminal, que não interfira com a ligação da hormona ao ligando RA liga�o ao domínio. os eluatos a partir de todas as condições experimentais foram analisados ​​por LC-MS /MS. a fim de aumentar a frequência de amostragem para a detecção de péptidos no nosso análise MS, cada condição experimental foi realizada quatro vezes. os nossos dados proteómica é uma compilação de apenas totalmente proteínas identificados, sendo ontologia gene completo e função.

os dados quantitativos MS, para cada uma das oito condições de estimulação hormonal, foi usada para criar um mapa de interação de proteínas (Figura 1A). O mapa de rede de interação de proteínas, permite uma análise visual da relação da interacção de cada proteína mutante com a AR. É mais provável que nem todas as proteínas interagem directamente com o AR mutante, mas pode através de proteínas intermediárias. Além disso classificação função ontológica (ver Materiais e Métodos) baseia-se nesta interacção mapa de rede, por discernir aglomerados significativas de proteínas que interagem com base no número de ligações de interacção proteína-proteína. Das listas de proteína T877A-AR oito estimulação hormonal, que, em seguida, sistemicamente aplicada análise de agrupamento hierárquico com as condições experimentais. Hierárquicos de agrupamento de calor-mapas que representam o agrupamento de entre o conjunto agonista T877A-AR e tratamentos experimentais antagonistas foram então gerados (Figura 1B). Entre as diferentes condições experimentais (tratamentos hormonais), a análise de rede comparativa foi aplicado [21], [22], [23] e, embora quatro andrógenos diferentes foram utilizadas (DHT, testosterona, MB e R1881), os perfis de proteómica destas ligantes andrógenos não segregar juntos, e observou-se que os complexos de progesterona e AR dexametasona têm perfis proteômicas que se parecem com R1881 e MB, respectivamente. Além disso, o complexo proteína de interacção de complexos estimuladas AR-estradiol era mais semelhante ao da interactoma resposta AR-DHT.

. Quantificada rede de interação de proteínas de DHT estimulado células LNCaP. O valor de cada proteína, definida pelos nossos MS quantitativos sem rótulo, distingue-se pela cor e tamanho, e as interações proteína-proteína sub-sequentes. A AR é designado pelo círculo preto. Para determinar a relação entre a interação de proteínas e padrões de expressão gênica, agrupamento hierárquico de células LNCaP estimuladas-hormonais multi-painel foi realizado. B. Interagir proteínas identificadas por espectrometria de massa. C. A maioria expressa variavelmente genes após estimulação ligando. Embora tenha sido sugerido que todas as hormonas utilizadas são capazes de activar a transcrição de genes dependente de androgénio com o receptor mutante T877A-AR, existem diferenças entre complexos de proteína AR e padrões de expressão do gene de AR. Esta análise de agrupamento ilustra que mesmo os androgénios sintéticos como Mibolerone (MB) e R1881, têm perfis de expressão de genes semelhantes, os complexos proteína de interacção são mais semelhantes a dexametasona (DEX) e progesterona (PGR), respectivamente, do que com a androgénios naturais testosterona e DHT. Além disso, mesmo os androgénios naturais (DHT) e testosterona pode ser segregados pelos seus complexos de proteínas. Isto sugere que há funções para a AR além de transativação de gene. Os valores de proteína e de expressão de genes são dadas como uma proporção de proteína quantificada de cada estimulação vs. estimulação controle do veículo.

Nós também passou a caracterizar os padrões do multi-painel de hormônio estimulado células LNCaP de expressão gênica. Análise dos genes expressos mais variável entre as condições hormonais deu um padrão de agrupamento hierárquica que era muito diferente para o T877A-AR perfil proteína de interacção (Figura 1C). Muito claramente, que novamente observado que os diferentes andrógenos utilizados nestes perfis de estimulação não se segregam em conjunto, e que os androgénios sintéticos, como R1881 e MB, não têm o mesmo perfil de transactivação estimulada-Ar tal como os ligandos naturais como a testosterona e DHT. Além disso, as propriedades ontológicas funcionais entre proteína de interação vs. perfis de nossa ligando diferencial de expressão gênica células estimuladas também parecem ser muito diferente. Discernir o impacto sobre a progressão da doença a partir destes perfis foi de particular interesse.

Para estabelecer funções biológicas estatisticamente significativas, implementamos a incorporação de Gene Ontológico (GO) /caminhos termos usando DAVID (banco de dados para anotação, visualização e Integrada descoberta, https://david.abcc.ncifcrf.gov/). Utilizando os dados de interacção proteína a partir de todas as condições de estimulação do ligando, as principais funções ontológicas são: transcrição do RNA pol II-dependente, a biossíntese de proteínas, com os componentes da maquinaria de tradução (de iniciação da tradução, factores de alongamento, proteínas ribossomais e outras proteínas reguladoras), ARN metabolismo (especificamente o splicing de ARN), a reparação do ADN (através de uma interacção com os membros do complexo de reparação do ADN), e as vias de proteassoma /ubiquitinação (ver Tabela S2). Em contraste, as classes ontológicas dependente do ligando padrão de expressão do gene incluído vias envolvidas na replicação do ADN, biossíntese de esteróides /esterol, e a apoptose (ver Tabela S3). Assim, embora o AR é classicamente descrita como um factor de transcrição, o seu perfil de proteoma sugeriria que a AR é capaz de funções para além do que foi inicialmente descrito como um activador de gene.

A análise estrutural da hormona de ligação ao T877A -AR

para explorar os possíveis mecanismos pelos quais os ligandos de ligação ao AR mutante criar diferentes conjuntos de AR interagindo proteínas, obteve-se a conformação detalhada do receptor, utilizando 15 ns dinâmica molecular (MD) estudos de simulação (veja materiais e Métodos) das oito diferentes ligandos utilizados. Utilizando o programa de ancoragem WILMA (Figura 2), obteve-se os dados estruturais da AR mutante ligados com progesterona, estrogénio, dexametasona e MB. Os dados estruturais da AR mutante com a testosterona, DHT, R1881 e acetato de ciproterona já estão disponíveis e, como tal, estas estruturas serviram como pontos de partida para os estudos de simulação MD.

programa de acoplamento foi utilizado para examinar WILMA estrutural modificações do domínio de ligação ao ligando da mutação T877A, após ligação ao ligando de ligação. Illustrated é a estrutura média de T877A-AR mutação ligando domínio de ligação com oito ligantes diferentes. A. testosterona, B. DHT, C. R1881, D. MB, E. estrogênio (EST), F. progesterona (PGR), G. CPA, H. dexametasona (DEX). Uma caixa vermelha destaca as mudanças na hélice α 11 circuito na ligação a cada ligante da hormona.

simulações Mutant AR MD foram realizados mais de 15 ns corridas de produção. Para inspecionar a flexibilidade local de cada complexo de proteína /hormonal, foram calculadas as flutuações desvio-root-mean squared (RSMD) de átomos da estrutura de cada resíduo de aminoácido para cada complexo AR mutante. No estudo de conformações de proteínas globulares, mede-se habitualmente a semelhança na estrutura tridimensional pelo RMSD dos átomos de carbono central em aminoácidos, depois de sobreposição óptima corpo rígido. As flutuações mais significativos correspondem a regiões de ansa entre α3 /α4, α9, α10 /α11 e α11 /α12 e as hélices α11 e α12-se do LBD de AR (Figura 3). Pode ser visto que o circuito entre α9, α10 e α11 é a região mais flexíveis em todos os complexos (Figura 3B). Entre as oito complexos ligando ligado AR diferentes, o testosterone- e complexos ligados ao estradiol demonstrar a flexibilidade mais elevada, com alguns resíduos de loop tendo flutuações RMSD tão elevadas como 2,4 Å. Embora estes loops são distantes do bolso de ligação à hormona, eles estão expostos à superfície e pode servir como um papel de potenciais locais de ligação a outros parceiros proteicos.

. estruturas médias sobrepostas de todos os complexos de receptor ligadas oito ligando. B. Regiões do circuito T877A AR-LBD entre Helixα9 e Helixα10 mostrou a máxima flexibilidade. C. visão expandida da Helix α11 e α12 Helix regiões do T877A AR-LBD obrigado a oito ligantes diferentes estudados neste estudo. Resíduos de α11 e α12 e loop entre eles apresentaram maior flexibilidade em comparação com outras regiões do receptor, onde está localizado T877A. Cor corresponde aos seguintes ligantes:. Green – testosterona, Cyan- DHT, Amarelo-R1881, Pink- MB, Rose- EST, Grey-PGR, Orange-CPA, Purple-DEX

O outros grandes diferenças observadas entre os complexos AR mutantes são as posições de α11 e 12, que são conhecidos por ser crítico para ditar as interacções de ligação de hormona e co-activador. Resíduos de α11 e α12 e o circuito entre eles apresentaram maior flexibilidade (Figura 3C). A mutação T877A-AR localizado em α11 permite um bolso mais espaçoso de ligação à hormona e irá acomodar esteróides com extensões diferentes dentro do anel D.

O exame da natureza e tamanho do solvente área de superfície acessível (SASA ) de proteínas é uma ferramenta importante para medir o potencial propensão interação com proteínas vizinhas. Calculou-se a SASA média de cada complexo AR do 15 ns MD trajetória. Não foram observadas grandes diferenças entre os Sasas calculados de diferentes complexos mutantes AR, que variou de 12.124 a 12.390 Å

2. Estes resultados mostram que as diferenças são geralmente associada com as regiões α11-α12 do AR-LBD, em que a mutação está localizada T877A. Portanto, decidimos comparar a dinâmica entre as oito diferentes complexos, especificamente nesta região, utilizando matrizes RMSD (Tabela 1). As matrizes, que, essencialmente, captura os movimentos extremos, revelam regiões de elevada flexibilidade, especialmente para CPA e dexametasona, em comparação com outros complexos AR-ligando.

modelação computacional também tem sido efectuada por um número de outros AR mutações somáticas no domínio de ligação ao ligando (LBD), e mostram sensibilidade para uma ampla gama de ligandos hormonais, incluindo, AR-W741L [34], -L701H [35], [36], [37], [38] , -H874Y [39], [40], [41] e -F876L [13]. Determinação da estrutura LBD entre AR-WT e -H874Y (presente em células 22Rv1), quando ligados a testosterona na presença do péptido FXXLF motivo N-terminal ou o péptido coativador TIF2, descobriram que todas as estruturas conformados com o receptor nuclear canónica LBD vezes [41]. Além disso, os DHT e R1881 estruturas -H874Y conformados com -T877A e -W741L LBD obrigado a esteróides e ligantes nosteroid [34], [42]. As linhas de células AR-mutante duplo MDA-PCa-2a e MDA-PCa-2b, possuem mutações somáticas o L701H e T877A, estas células mostram a transactivação semelhante AR e propriedades estruturais LBD para o único mutante AR-T877A células LNCaP com um espectro amplo de ligantes esteróides e anti-andrógenos, mas também mostram um aumento da sensibilidade esteróides cortisol [35], [36].