Abstract

Fundo

Boa biomarcadores para a detecção precoce de chumbo câncer para melhor prognóstico. No entanto, o tecido tumoral de colheita é invasiva e não pode ser realizada rotineiramente. metilação do DNA global de DNA de leucócitos do sangue periférico foi avaliada como um biomarcador para o risco de câncer.

Métodos

Foi realizada uma meta-análise para estimar o risco de câncer em geral de acordo com os níveis globais de DNA hipometilação entre os estudos com vários tipos de câncer e métodos analíticos utilizados para medir a metilação do DNA. Os estudos foram sistemicamente procurou via PubMed sem limitação de idioma até julho de 2011. Estimativas Resumo foram calculados usando um modelo de efeitos fixos.

Resultados

O subgrupo análises por métodos experimentais para determinar o nível de metilação do DNA eram realizada devido à heterogeneidade dos estudos selecionados (p 0,001, eu

2: 80%). Heterogeneidade não foi encontrado no subgrupo de% 5-MC (p = 0,393, eu

2: 0%) e LINE-1 usado mesma sequência alvo (p = 0,097, eu

2: 49%), enquanto variação considerável permaneceu em lINE-1 (p 0,001, eu

2: 80%) e estudos de cancro da bexiga (p = 0,016, eu

2: 76%). Estes resultados sugerem que os métodos experimentais utilizados para quantificar os níveis globais de metilação do DNA são fatores importantes no estudo de associação entre os níveis de hipometilação eo risco de câncer. No geral, os riscos de câncer do grupo com os mais baixos níveis de metilação de DNA foram significativamente maiores em comparação com o grupo com os mais altos níveis de metilação [OR (IC 95%): 1,48 (1.28-1.70)].

Conclusões

hipometilação do DNA global em leucócitos do sangue periférico pode ser um biomarcador adequado para o risco de câncer. No entanto, a associação entre a metilação do DNA global e risco de câncer pode ser diferente com base em métodos experimentais e região de DNA alvo de medição dos níveis de hipometilação globais, bem como o tipo de câncer. Portanto, é importante para selecionar um marcador substituto preciso e exato para os níveis de metilação do DNA globais nos estudos de associação entre os níveis de metilação do DNA globais em leucócitos periféricos e risco de câncer

Citation:. Woo HD, Kim J (2012) a hipometilação do DNA global em periféricos leucócitos do sangue como um biomarcador para o cancro risco: uma meta-análise. PLoS ONE 7 (4): e34615. doi: 10.1371 /journal.pone.0034615

editor: Brock C. Christensen, Dartmouth College, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de novembro de 2011; Aceito: 02 de março de 2012; Publicação: 11 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Woo, Kim. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Centro Nacional do Câncer, Coreia (no. 1110300). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução processos

Epigenetic são importantes no desenvolvimento e diferenciação celular, e pode ser alterada por meio ambiente, dieta, e o envelhecimento [1], [2]. A metilação do DNA, o que é um importante mecanismo epigenético, está envolvido em vários processos biológicos, incluindo o cancro [3] – [6]. A hipometilação de DNA é um evento precoce na carcinogénese humana [7] – [9] e está associada com instabilidade genética em células de cancro [10], [11]. os níveis de metilação de ADN são mantidas por metiltransferases de ADN (DNMTs). Dnmt3a DNMT3B e são responsáveis ​​por metilação de ADN novo [12] – [14]. Assim, a inactivação do DNMTs provoca hipometilação global do genoma ou hipometilação de famílias específicas de sequências repetidas [14] – [16]. No entanto, os mecanismos de hipometilação de DNA não são completamente compreendidos. Existem vários mecanismos responsáveis ​​por desmetilação DNA. A remoção directa do grupo metilo por metilo CpG proteína do domínio de ligação 2 (MBD2) tem sido relatada [17], embora este resultado não tenha sido confirmada por outros autores [18], [19]. GADD45A (paragem do crescimento e dano-ADN-induzível, alfa) está associado com a desmetilação de ADN mediada por reparação [20]. No entanto, o trabalho de Jin et al. [21] não confirma essa associação. enzimas de reparo de DNA pode desmetilar DNA [22], ea evidência direta de reparação por excisão de bases (BER) desmetilação DNA mediada foi proposta [23]. Irmão do regulador de sítios impressos expressão (BORIS) está associada com desmetilação [24]. Woloszynska-Read et al. [25] tem sugerido que a razão entre a expressão do factor BORIS /CCCTC de ligação (CTCF) está relacionada com a desmetilação de ADN. Uma vez que a remoção directa de o grupo metilo da posição 5 ‘da citosina é desfavorável, estudos que sugerem mecanismos naturais de desmetilação de ADN têm sido inconsistentes.

As sequências de CG da região do promotor são normalmente não metilado para permitir a expressão do gene, Considerando repetições de ADN de mamíferos estão altamente metilados em tecidos somáticos [12], [26]. hipermetilação DNA no gene supressor de tumor (TSG) promotores causa repressão da ETG. A hipometilação de sequências de DNA únicas ou repetidas podem afectar a estrutura da cromatina e a instabilidade genómica, levar à activação da transcrição, e aumentar a expressão de genes de promoção de cancro [26]. Ambos hipometilação do ADN e hipermetilação foram observados em câncer humano, mas hipometilação do DNA, especialmente em elementos repetitivos, são mais frequentemente associada com o câncer, resultando em perdas líquidas de 5-metilcitosina (5-MC) [26].

A associação entre a hipometilação do ADN do tumor mundial e o risco de cancro tem sido demonstrada em vários tumores humanos [27] – [30]. Além disso, a hipometilação do ADN mundial em várias cancerosas adjacentes e tecidos normais foi detectada [31], [32]. Portanto, muitos investigadores têm estudado a metilação do DNA, como um biomarcador para o rastreio do cancro. A detecção precoce do cancro resulta em melhor prognóstico. No entanto, o tecido tumoral de colheita é invasiva e não pode ser realizada rotineiramente. Portanto, a associação entre o risco de câncer e os níveis de hipometilação do DNA globais em leucócitos do sangue tem sido investigada. Foi realizada uma meta-análise para estimar o risco de câncer em geral de acordo com os níveis de DNA hipometilação globais entre os estudos com vários tipos de câncer e métodos analíticos utilizados para medir a metilação do DNA.

Métodos

selecção Estudo

Nós sistemicamente procurou estudos através dos bancos de dados eletrônicos utilizando PubMed com os termos “risco de câncer e (metilação ou hipometilação) e (sangue ou leucócitos)” com nenhuma limitação linguagem até julho de 2011. a pesquisa manual com uma lista de referência de revistas seleccionados foi realizada. No entanto, não foram identificados novos artigos que satisfazem os critérios de inclusão. Os critérios de exclusão /inclusão foram os seguintes: (1) o artigo original com caso-controle ou coorte projetos; (2) leucócitos do sangue periférico foram usadas para medir os níveis globais de metilação do DNA; (3) pacientes que foram diagnosticadas com câncer em estudos caso-controle, eo sangue foi coletado em participantes que estavam livres de cancros na linha de base em estudos de coorte; (4) Foram excluídos os estudos com metilação de ADN específico do gene; e (5) o estudo relatou 95% intervalos de confiança (IC) de índices ajustados chances (RC) ou os riscos relativos (RR) para o risco de câncer em indivíduos com o menor nível de metilação do DNA global, comparada com a de pacientes com o mais alto nível de metilação global do DNA. Se a célula de referência continha o menor nível de metilação do DNA global, invertido OR e foi usado IC 95%.

A coleta de dados

estudos Procurado foram revisados ​​independentemente por dois investigadores (H.D.W e J. K.). Estudos com dados elegíveis para meta-análise continha informações sobre autores, ano de publicação, métodos experimentais para medir os níveis globais de metilação do DNA, locais de câncer e tipos, país onde o estudo foi realizado, período de estudo, o número de casos e controles, categorias de DNA mundial níveis de metilação, ajustado ou /RR e IC 95%, p-valores para as tendências e variáveis ​​de confusão foram considerados. OR ajustado /RR e IC 95% foram selecionados para excluir efeitos de confusão e incluir os estudos que não informaram o número de casos e controles para cada categoria.

A análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o pacote de software STATA (versão 10, College Station, TX). Log estimativas de efeito de ponto e os correspondentes erros padrão foram calculados utilizando estimativas de efeito de ponto ajustado pela co-variáveis ​​e IC 95% dos estudos selecionados e ponderados pela variância inversa para calcular estimativas de síntese [33]. O teste de heterogeneidade entre os estudos foi medido utilizando o Q-teste com base no χ

2 estatística, considerando a heterogeneidade estatística significativa, p 0,05 e

2 teste I de acordo com Higgins et al. [34]. análises de subgrupos foram realizadas por métodos experimentais para medir os níveis globais de metilação do DNA ou com base no tipo de câncer devido à heterogeneidade entre-estudo. Um modelo de efeito fixo foi usado na meta-análise porque um modelo de efeitos aleatórios é menos conservador do que um modelo de efeito fixo, dando mais peso aos estudos de amostras pequenas, que são mais propensos a ter viés de publicação, especialmente quando um pequeno número de estudos foram combinado [35], [36].

resultados

Um total de 258 estudos foram excluídos na primeira passagem com base em títulos e resumos entre 285 pesquisados ​​artigos. Os 27 estudos restantes foram novamente revistos. Dezoito estudos que não satisfazem os critérios de inclusão foram excluídos pelas seguintes razões: 12 estudos não medir os níveis globais de metilação do DNA; dois estudos não relataram o risco de câncer de acordo com categorias de níveis globais de metilação do DNA; 3 estudos foram artigos de revisão; e 1 estudo não tem controles. Onze estudos que compreendem dez estudos de caso-controle e estudo de uma coorte foram finalmente selecionados (Tabela 1) [37] – [47]. Encontrámos 2 estudos que foram recentemente publicados durante o processo de revisão [45], [46]. Porque apenas um número limitado de estudos preencheram os critérios para a nossa meta-análise, decidimos incluir esses 2 estudos adicionais (Figura 1). Porque Pufulete et ai. [37] relataram tanto os riscos de câncer colorretal e adenoma colorretal, doze casos foram utilizados para a meta-análise. Três cancro da bexiga, dois adenomas colorretais, um cancro colorectal, um cancro da mama, cancro gástrico dois, um de cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas (CECP), um câncer de células renais, e um caso de câncer em geral foram incluídos. Zhu et al. [47] relataram os riscos de todo o cancro, bem como cada tipo de cancros classificados em grupo de níveis globais de DNA hipometilação dois e quatro. No entanto, os dados de todo o risco de câncer com duas categorias foram selecionados devido ao pequeno número de incidência de câncer. Lim et al. [39] e Liao et al. [45] relataram OR e IC 95% em pessoas do mais alto tercil de metilação genômica em comparação com aqueles no menor tercil de metilação do genoma. Por isso, foi utilizado o OR invertida e IC 95% para calcular a estimativa agrupada. O teste de Egger para viés de publicação mostrou resultados não significativos (p = 0,483).

Figura 2 mostra a meta-análise dos estudos selecionados. A hipometilação de DNA global foi associada com risco aumentado de cancro (OR: CI 1,48, 95%: 1,28-1,70, p 0,001). No entanto, entre o estudo de heterogeneidade foi significativamente elevada (p 0,001, eu

2: 83%). Portanto, realizamos meta-regressão usando métodos experimentais usados ​​para determinar os níveis de metilação do DNA globais [capacidade de aceitação de metilo de DNA, percentual de 5-metilcitosina (% 5-MC) vs. elemento de nucleotídeos longo intercaladas 1 (LINE-1)], o câncer locais (colorretal, estômago, outros vs. bexiga) e sexo (masculino, versus total de mulheres). Métodos experimentais foram significativamente diferentes umas das outras (% 5-MC-1 vs LINHA: p = 0,011), quando o sexo e métodos experimentais foram incluídas no modelo de meta-regressão. No entanto, não foram observadas diferenças significativas quando o site do câncer foi ainda incluído. Foram identificados quatro estudos de base populacional, incluindo um estudo de caso-controle; todos os estudos mostraram estimativas de síntese homogêneos (ou [IC 95%] = 1,36 [1,12-1,64]; teste de heterogeneidade: p = 0,159, eu

2 = 42%). No entanto, os métodos experimentais destes 4 estudos, que envolveram investigações baseadas em hospital de LINE-1 análise e, ainda mostrou uma heterogeneidade significativa. Os dados de meta-regressão não mostraram quaisquer diferenças no que diz respeito à inclusão do desenho do estudo na análise. Portanto, nós não incluem o desenho do estudo em nossa análise. Análises de subgrupo foram realizadas por métodos experimentais (% 5-MC, LINE-1) e estudos de câncer de bexiga para explorar ainda mais a variância entre os estudos (Figura 3). Heterogeneidade entre os estudos não foi detectada em% Método 5-MC (p = 0,393, eu

2 = 0%), mas variação considerável foi encontrado na análise de subgrupo de LINE-1 método (p 0,001, eu

2: 80%) e câncer de bexiga (p = 0,016, eu

2: 76%). O grupo com os mais baixos níveis de metilação de DNA global teve cancro riscos significativamente mais elevados em comparação com o grupo com os mais altos níveis de metilação global do DNA em% 5-MC e estudos [OR (IC 95%) 1 LINE-: 2,93 (2,14-4,01) e 1,20 (1,03-1,41), respectivamente]. Na linha 1-subgrupo, com a excepção do estudo por Hsiung et ai. [38] e Liao et al. [45] que usou região diferente da sequência alvo de ADN de outros estudos, eu

2 estatísticas foram de 49% (p = 0,097) e os níveis globais de DNA hipometilação foram significativamente associados com o aumento do risco de câncer [OR (IC 95%): 1,36 (1,12-1,65)]

colorectal A:. colorectal Adenoma, metil: ensaio metil aceitação, line-1: elementos nucleares de longo intercaladas, e% 5-mC: As percentagens de 5-metilcitosina. F: Modelo de efeitos fixos, R: modelo de efeitos aleatórios. As linhas horizontais através das caixas representam intervalos de 95% de confiança (IC). Os centros das caixas estão situados na estimativa pontual (OR /RR) e as caixas maiores significam estudos não possuem maior influência nas estimativas de síntese.

(A)% 5-MC, ( B) lINE-1, e (C) mesma sequência alvo lINE-1 usado. A associação entre o risco de câncer de bexiga e hipometilação do DNA global (D). R: modelo de efeitos aleatórios. estimativas de síntese foram calculados com base em um modelo de efeitos fixos, salvo indicação contrária.

Discussão

Onze estudos foram utilizados no presente estudo para estimar resultados globais. Estes estudos têm testado se o nível de metilação do DNA global em DNA de sangue periférico é um bom marcador para detectar câncer. hipometilação do DNA global de leucócitos no sangue foi associado com aumento do risco de câncer. No entanto, a associação variou de acordo com os métodos experimentais utilizados e a região de ADN-alvo para medição dos níveis de hipometilação globais, bem como o tipo de cancro.

Foram identificados três métodos experimentais para medir os níveis globais de metilação do DNA na presente meta- análise: Três estudos utilizaram% 5-mC; sete estudos utilizados LINE-1 com pyrosequencing (6 estudos) e uma versão modificada da análise de restrição bisulfite combinado da linha Element retrotransponíveis 1 (LRE1) sequência (1 estudo); um estudo analisou a capacidade de aceitação de metilo de DNA usando [3H-metil] S-adenosilmetionina. análise de subgrupo no método% 5-MC foi homogênea. No entanto, LINE-1 método e cancro da bexiga, que foi o único tipo de câncer que foi analisada em mais de 3 estudos, permaneceu significativamente heterogêneo. Muitos métodos analíticos foram desenvolvidos para determinar os níveis de metilação de ADN [48] – [51]. Metil ensaio aceitação baseia-se na capacidade de incorporação de metilo marcado radioactivamente no ADN, assim, elevado o grupo metilo incorporação indica baixos níveis de metilação do ADN. No entanto, a alta no dia-a-dia e variação de concentração de ADN imprecisas devido à dificuldade de solução de ADN genómico misturando homogeneamente foram observados [52]. A medição directa de percentagens de 5-metilcitosina foi usado em muitos estudos epidemiológicos para estimar o conteúdo de metilação global do DNA usando cromatografia líquida de fase reversa de elevado desempenho (HPLC), cromatografia líquida (LC) -massa espectrometria, ou electroforese capilar de alta eficiência ( HPCE). Estes métodos são altamente quantitativo e reprodutível, mas eles não são adequados para estudos epidemiológicos com tamanho de amostra e de alta quantidade de ADN são necessários para produzir resultados fiáveis. Introdução de conversão de bissulfito de sódio de ADN genómico revolucionou os métodos analíticos para a análise de metilação [13]. Além disso, pyrosequencing que é um de alto rendimento e preciso método está actualmente disponível [51]. sequências repetitivas compreendem grandes porções do genoma humano e são ricos em CpG [53], [54]. regiões genômicas repetitivas, como LINE-1 e Alu são geralmente metilado em tecidos somáticos [55]. Portanto, pirossequenciao com o ADN tratado com bissulfito para medir repetitivo elemento metilação tem sido usada como marcadores substitutos para a hipometilação de DNA global.

No entanto, no estudo de Choi et al. [41], os níveis globais de metilação do DNA foram medidos com% 5-MC e LINE-1 em um estudo piloto. No entanto, ambos os métodos não se correlacionou com o outro, e o nível de metilação LINE-1 não apresentaram diferenças significativas entre casos e controles. Nenhuma correlação estatisticamente significativa entre% 5-MC e LINE-1 pode ser devido ao tamanho reduzido da amostra em estudo piloto, mas o coeficiente de correlação ainda era muito pequeno (r = -0,204). Portanto, LINE-1 pode não ser apropriado para servir como um marcador substituto sensível para a metilação do DNA global. Além disso, Nelson et ai. [56] relataram que os níveis de metilação com a linha-1 método pode ser variado dependendo da sequência alvo e de CpG entre amostras. A sequência CpG frequentemente utilizado para LINE-1 está localizado na região 5 ‘que é muitas vezes excluído sem saber a freqüência exata; Consequentemente, as quantidades de elementos utilizados para a medição LINHA-1 pode ser diferente entre amostras. Phokaew et ai. [57] relatou que os níveis de LINE-1 metilação de células brancas do sangue e epitélio oral normal foram altamente variáveis ​​dependendo de onde a sequência alvo estão localizados, mas padrão semelhante foi observado no mesmo locus. Este resultado sugere que o locus de segmentação para a linha 1-metilação de medição em tecidos normais deve ser cuidadosamente seleccionado, mas a quantidade de variação de níveis de metilação entre amostras não pode ser grande. Cinco dos 7 estudos de envolver LINE-1 metilação em nosso estudo usou a mesma sequência alvo de LINE-1, e todos eles foram referenciados a partir Bollati et al. [58]. As estimativas de verão destes estudos mostraram pouca heterogeneidade e mostrou associação significativa com o risco de câncer. Liao et al. [45] relataram níveis de metilação do DNA globais em 4 posições diferentes; no entanto, as associações com o risco de câncer eram diferentes em cada posição. Porque os estudos foram realizados em locais diferentes de câncer, não é possível concluir se os métodos experimentais eram mais importantes do que o tipo de câncer na associação entre o risco de câncer e metilação global do DNA usando sangue periférico. No entanto, estes resultados sugerem que os métodos experimentais usados ​​para quantificar os níveis globais de metilação do DNA são fatores importantes no estudo de associação com o risco de câncer.

Os efeitos da metilação do DNA aberrante de regiões promotoras sobre o risco de câncer são relativamente claras. No entanto, a relação entre a hipometilação do DNA global e câncer não são conclusivos. A hipometilação de DNA global está relacionada com fases precoce da carcinogénese [7] – [9], a progressão tumoral [29], ou ambos [59]. hipometilação global pode funcionar como uma causa ou consequência da carcinogênese. No entanto, os resultados atuais não poderia confirmar a associação. A maioria dos estudos (10 em 11 estudos) tinha um design de caso-controle. O único estudo de coorte na meta-análise teve casos de incidência de câncer pequenas e mostrou resultados inconsistentes com métodos diferentes.

hipometilação do ADN em leucócitos do sangue de pacientes com câncer pode ser causado pela circulação de DNA do tumor [60]. No entanto, os efeitos de ADN de tumor com os resultados do presente estudo parece ser mínima. tumores agressivos activas e libertar o ADN do tumor mas hipometilação podem ser encontrados nas fases iniciais de cancro, e ADN do tumor é detectada no plasma de doentes com cancro, mas os níveis de metilação foram avaliadas utilizando leucócitos de sangue.

A limitação deste estudo é que um pequeno número de publicações preencheram os critérios para a presente meta-análise e que estes artigos eram em sua maioria de caso-controle estudos projetados. Embora hipometilação do DNA global de leucócitos no sangue foi associado com aumento do risco de câncer na meta-análise, hipometilação do DNA global pode ser útil como um biomarcador para susceptibilidade ao câncer, mas não uma ferramenta de diagnóstico para o câncer. Porque é difícil decidir o ponto de corte de hipometilação para um biomarcador para o risco de câncer, a sensibilidade e especificidade de hipometilação global, sobre os riscos de cancro não pôde ser determinado.

Em resumo, hipometilação do DNA global no sangue periférico leucócitos pode ser considerado como um biomarcador para o risco do cancro. No entanto, a associação com o risco de câncer pode variar de acordo com os métodos experimentais e região de destino de DNA para medir os níveis hipometilação global e tipo de câncer. Diversos métodos estão disponíveis para medir a metilação do DNA global, mas são limitados para estudos epidemiológicos, que exigem técnicas que são de alto rendimento, preciso e econômico. É necessária mais investigação para elucidar marcadores substitutos para os níveis globais de metilação do DNA e determinar se hipometilação do DNA global é um marcador de risco de câncer com grandes estudos de coorte.