Abstract

Os principais desafios que estamos enfrentando na terapia do cancro com paclitaxel (PTX) são a resistência aos medicamentos e efeitos colaterais graves. grandes esforços têm sido feitos para superar esses desafios clínicos através da combinação de PTX com outras drogas. Neste estudo, foram relatados os primeiros dados pré-clínicos que o praziquantel (PZQ), um agente anti-parasita, pode aumentar consideravelmente a eficácia anticancerígena de PTX em várias linhas celulares de cancro, incluindo linhas de células resistentes a PTX. Com base no valor de índice de combinação, foi demonstrado que o PZQ sinergicamente aumentada de inibição do crescimento celular induzida por PTX. O co-tratamento de PTX PZQ e também induziu a paragem da mitose e significativa activado a cascata apoptótica. Além disso, o PZQ combinado com PTX resultou numa inibição mais pronunciada do crescimento do tumor em comparação com qualquer um dos fármacos sozinhos num modelo de murganho de xenoenxerto. Nós tentamos investigar os possíveis mecanismos dessa eficácia sinérgica induzida por PZQ e PTX, e descobrimos que o co-tratamento dos dois medicamentos pode diminuir acentuadamente expressão de inibidor ligada ao X da proteína apoptose (XIAP), uma proteína anti-apoptótica . Os nossos dados demonstram, ainda, que foi requerida a sub-regulação de XIAP para a interacção sinérgica entre PZQ e PTX. Juntos, este estudo sugere que a combinação de PZQ e PTX pode representar uma estratégia anticancerígeno inovador e eficaz para otimizar a terapia PTX

Citation:. Wu ZH, Lu Mk, Hu LY, Li X (2012) Praziquantel aumenta sinergicamente paclitaxel eficácia para inibir o cancro do Crescimento celular. PLoS ONE 7 (12): e51721. doi: 10.1371 /journal.pone.0051721

editor: Joseph Alan Bauer, Bauer Research Foundation, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de julho de 2012; Aceito: 05 de novembro de 2012; Publicação: 12 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Wu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Fundação Nacional de Fomento talentos da ciência básica, China (J1030626) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm); O Projeto Chave de Fujian Programas Provinciais de Ciência e Tecnologia (2011Y0050); e da Fundação de Inovação Tecnológica da Ciência e Tecnologia da Secretaria de Xiamen, China (2011S0567). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

tornou-se uma nova tendência que transformar uma velha droga para novos usos, especialmente para o tratamento do câncer, porque esses medicamentos antigos utilizados rotineiramente pode ter um talento escondido ou um bom potencial em lidar com câncer. O facto é que todos adsorvido foi já feita, o que permite deslocar o fármaco para a clínica mais rapidamente e para reduzir o custo para o desenvolvimento de drogas [1], [2]. O conceito de “novos usos para drogas velho” fornece uma maneira eficiente para redescobrir novos usos para remédios existentes com farmacocinética conhecidos e perfis de segurança. Alguns exemplos de sucesso para este tipo de desenvolvimento droga contra o câncer foram previamente relatado como Talidomida [3], a vitamina C [4] – [6], AINEs (medicamentos anti-inflamatórios não esteróides) [7] – [11]. Recentemente, foi relatado que a artemisinina, um agente anti-parasita, e seus derivados, tinha profunda citotoxicidade contra células de cancro de tumores diferentes [12] – [16], proporcionando o impulso ao desenvolvimento de medicamentos anti-parasitas em fármacos anti-cancro. Praziquantel (PZQ), um outro agente anti-parasita, tem sido amplamente utilizado no tratamento de esquistossomíase diferente com boa eficácia [17], [18]. Curiosamente, foi relatado que o PZQ pode melhorar as respostas imunes humorais e celulares do hospedeiro contra doenças [19], [20]. Seria interessante investigar se PZQ tem actividade anti-cancerígena que ainda não está claro até agora.

Neste estudo, matando atividade de PZQ sobre as células cancerosas foi avaliada com ensaios diferentes. Investigou-se também o efeito do tratamento combinado com PZQ e o paclitaxel droga quimioterapêutica utilizada (PTX). PTX é um agente de estabilização de microtúbulos, que pode promover a estabilização de microtúbulos, resultando na paragem das células na fase G2 /M do ciclo celular e que conduz à apoptose [21], [22]. Como um dos medicamentos anticancerígenos mais vulgarmente utilizados, PTX demonstrou forte eficácia contra uma larga gama de doenças malignas, incluindo da mama, cabeça e pescoço, do ovário e do pulmão de células não pequenas, bem como o sarcoma de Kaposi [23]. No entanto, o surgimento de resistência clínica e ampla gama de efeitos secundários graves permanecem problemas significativos com a terapia PTX [24] – [26]. Consequentemente, numerosos estudos recentes voltados para a terapia PTX sinérgico com o objetivo de encontrar uma solução eficaz para superar problema resistente a PTX e reduzir a toxicidade induzida pela PTX, sem comprometer a eficácia da droga [27], [28].

Aqui, que relataram que o PZQ pode sinergicamente melhorar o efeito inibidor do crescimento de PTX em uma variedade de linhas celulares de cancro, incluindo linhas de células resistentes a PTX, tais como DLD1 e H1299, embora o tratamento PZQ sozinho não exercem citotoxicidade nessas células cancerosas. PZQ também poderia aumentar consideravelmente paragem da mitose induzida PTX e apoptose. Em outros estudos, mostramos que essa sinergia citotóxico entre PZQ e PTX envolvidos infra-regulação de XIAP. A capacidade de PZQ para potenciar os efeitos anticancerígenos da PTX foi posteriormente confirmada em um rato modelo de xenotransplante. Estes resultados forneceram implicações importantes para otimizar a terapia PTX. Combinando PZQ com PTX pode representar um romance e estratégia anticancerígeno eficaz.

Materiais e Métodos

linhas celulares e Cultura de Células

linha de células de cancro do cólon humano DLD-1, o cancro da mama a linha de células ZR-7530, linhas celulares de cancro de pulmão SPC-a-1 e a-2-Ltep foram cultivadas em meio RPMI 1640. pulmão humano linha celular de cancro das células não pequenas H1299, linha celular de cancro cervical HeLa e linha celular de cancro da mama humano Bcap37 foram mantidas em DMEM. Todos os meios foram suplementados com 10% (v /v) de soro fetal de bovino (Gibco, Carlsbad, CA), 100 unidades /ml de penicilina e 100 mg /ml de estreptomicina. As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. Todas as linhas celulares foram obtidas a partir do celular Banco da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China). As linhas celulares que estavam livres de micoplasma, quando submetido a um teste com base em PCR Mycoplasma [29], [30].

Reagentes e anticorpos

O paclitaxel (PTX), roscovitina, o anticorpo policlonal de coelho contra Bim, Puma, e o anticorpo monoclonal de ratinho (mAb) contra β-actina foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Praziquantel (PZQ) foi gentilmente cedido pelo Dr. junho Lu (Nanjing Pharmaceutical fábrica co., LTD, Nanjing, China). MG132 foi da Calbiochem (Darmstadt, Alemanha). O anticorpo policlonal de coelho contra clivado poli (ADP-ribose) polimerase (PARP; p89) e fosfo-histona H3 (Ser-10) (P-H3) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). O anticorpo policlonal de coelho contra Noxas, Bax, Bak, caspase-3, Survivina, Bcl-2, Bcl-X e

L foram de Santa Cruz (Santa Cruz, CA). O mAb de ratinho contra XIAP era de BD Transduction Laboratories (San Diego, CA). Os anticorpos secundários conjugados com peroxidase de cabra anti-coelho e de cabra anti-ratinho de rábano foram adquiridos a Pierce Biotechnology (Rockford, IL).

Ensaio de viabilidade celular

A viabilidade celular foi determinada por 3- (4 , 5-dimetiltiazol-2-il) -2, brometo de MTT) (5-difeniltetrazólio. As células plaqueadas em placas de 96 poços foram incubadas com fármacos indicados a 37 ° C durante diferentes períodos de tempo. Em seguida, o meio de cultura foi removido e meio contendo MTT (0,5 mg /ml) foi adicionado a cada poço. As placas foram incubadas durante mais 2-4 horas adicionais num CO

2 incubadora a 37 ° C. Os cristais de formazan foram dissolvidos em DMSO a 100% e a absorvância a 570 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas. Cada amostra foi medida em triplicado e repetidas três vezes. A percentagem relativa de sobrevivência foi calculada dividindo a absorvância de células tratadas com o do controlo em cada experiência. PTX e PZQ como agentes isolados e em combinação nas concentrações mais elevadas utilizadas nas experiências relatadas não interferem com os reagentes de ensaio de MTT nas nossas experiências de controlo (dados não apresentados).

celular CycleAnalysis

para a análise do conteúdo de DNA e do ciclo celular por citometria de fluxo, as células foram colhidas, lavadas uma vez com PBS e fixadas em 70% de etanol a 4 ° C durante a noite. No tempo para análise de citometria de fluxo, as células foram lavadas com PBS e re-suspensas em solução de coloração (100 ug /ml de ARNase e 100 ug iodeto de propídio /ml em PBS). Depois as células foram incubadas durante 30 min a 37 ° C no escuro, a distribuição do ciclo celular foi analisada por um fluxo Coulter EPICS XL citómetro (Beckman Coulter, Miami, FL).

Western Blot Análise

análise por Western blot foi realizada tal como descrito previamente [31]. Resumidamente, as células foram colhidas e lisadas em tampão de lise contendo Tris-HCl 20 (pH = 7,4), NaCl 150 mM, 1% de Triton-X 100, fenilmetanossulfonil fluoreto de 1 mM, 10 ug /mL de leupeptina, 2 ug /ml de aprotinina, NaF 10 mM, 1 mM de na

3VO

4, e a concentração de proteína foi determinada usando o ensaio de ácido bicinconínico (BCA). As proteínas celulares foram submetidos a electroforese em gel de poliacrilamida-sulfato de dodecilo de sódio e transferida para membrana de difluoreto de polivinilideno (Millipore, Bedford, MA). As membranas foram bloqueadas com TBS-Tween 20 (0,5%) contendo 5% de leite desnatado durante 2 horas à temperatura ambiente e incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Após três lavagens com TBS-Tween 20, as membranas foram incubadas com anticorpo de cabra anti-coelho ou anticorpos secundários conjugados com peroxidase de cabra anti-ratinho de rábano durante 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram lavadas com TBS-Tween 20 e novamente desenvolvida por quimioluminescência aumentada (Pierce, Rockford, IL). β-actina foi utilizado como um controlo de carga. Os anticorpos primários foram utilizados a uma diluição 1:1000, excepto para o anti-β-actina, que foi utilizado a uma diluição 1:5000. Os anticorpos secundários conjugados com peroxidase anti-coelho ou anti-ratinho de rábano foram utilizados a uma diluição de 1:5000.

Coloração DAPI

Após tratamento da toxicodependência, as células cultivadas em placas de 6 poços foram lavou-se com PBS e fixadas com formaldeído a 3,7% durante 10 minutos à temperatura ambiente, em seguida, incubadas com a solução de coloração (0,3% de Triton X-100 e 1 ug /mL de DAPI em PBS) durante 5 minutos, evitando luz à temperatura ambiente. As células foram examinadas por microscopia de fluorescência (Nikon). As células que possuem núcleos fragmentados e uniformemente condensadas foram considerados como células apoptóticas, e a apoptose foi expressa como uma percentagem calculada a partir do número de células com morfologia nuclear apoptótica dividido pelo número total de células examinadas.

Colony Formation Ensaio

As células foram semeadas em placas de 6 poços a 1,5 × 10

3 células por poço e exposto a tratamento medicamentoso. Após 10 dias, as células foram fixadas e coradas com violeta de cristal (0,5% de violeta de cristal e 20% de metanol) durante 30 minutos. Em seguida, as placas foram lavadas com água destilada e fotografada. As colónias que continham mais do que 50 células foram contadas. Os valores para cada condição foram expressos como uma percentagem em relação aos controlos tratados com veículo. Cada condição ensaio foi realizado em, pelo menos, três experiências independentes.

A coloração de imunofluorescência

células em lamelas foram fixadas em paraformaldeído a 4% em PBS à temperatura ambiente durante 10 min, lavadas com PBS, permeabilizadas com 0,2% de Triton-X100 em PBS durante 10 min, e, em seguida, bloqueadas com 3% de albumina de soro bovino em PBS à temperatura ambiente durante 30 min. Foi adicionado anti-fosfo-Histona H3 (10-Ser) (P-H3) anticorpo (diluição 1:100) e incubou-se durante 30 min à temperatura ambiente. Após lavagem com PBS contendo 0,02% de Triton X-100 e 1,5% de BSA, as lamelas foram incubadas com Alexa Fluor anti-IgG de coelho de cabra conjugado 647 (diluição 1:200) durante 30 min à temperatura ambiente. Finalmente, as células foram incubadas com 1 ug /ml de DAPI em PBS durante 5 minutos antes de montada em 90% de glicerol e selado com prego polonês. índice mitótico foi expressa em percentagem do-células-P-H3 positivos em relação ao número total de células examinadas.

Os plasmídeos, transfecção celular e RNA Interferência

O plasmídeo XIAP-expressando pcDNA3- myc-XIAP foi um presente do Dr. John C. Reed (Instituto Burnham, La Jolla, EUA) eo pcDNA3 vazio foi utilizado como controle negativo. transfecção de células foi feita utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Para knockdown XIAP, shRNA sequência de direccionamento de XIAP (GTGGTAGTCCTGTTTCAGC) foi clonado num vector lentiviral Lenti-Lox3.7 (PLL3 0,7). Uma sequência com nenhuma parte correspondente no genoma humano (GATCATGTAGATACGCTCA) foi utilizada como um controlo. Para a produção de lentivírus shRNA infecciosos que expressam, 293 células T foram transfectadas com um vector lentiviral pLL3.7 em conjunto com vectores de embalagem pVSV-G, pRSV-Rev e pMDL gag /pol RRE. 48 h após a transfecção, os meios sobrenadantes contendo vírus foram colhidos, passados ​​através de um filtro de 0,45 mícrons e usadas para as células infectadas após adição de 10 ug /mL de polibreno.

em tempo real Transcrição Reversa-PCR

o RNA total foi extraído usando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado a partir do ARN total utilizando um iniciador oligo-dT e transcriptase reversa de Moloney de murino o vírus da leucemia (Takara, Shiga, Japão). PCR em tempo real foi realizado sobre o rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Mortlake, Austrália) e verde SYBR (BIO-V, Xiamen, China) foi utilizada como um reagente de detecção. As sequências dos iniciadores para XIAP e da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) foram: XIAP (para a frente: 5′-GACAGTATGCAAGATGAGTCAAGTCA-3 ‘; reverso: 5′-GCAAAGCTTCTCCTCTTGCAG-3′), GAPDH (para a frente: 5’-3-CCACCCATGGCAAATTCC ‘; reverso: 5′-TGGGATTTCCATTGATGACAAG-3’). Cada amostra foi executado em triplicado. A análise dos dados foi realizada com o software série Rotor Gene 6000 1,7 (Corbett Research, Mortlake, Austrália). Os valores de ARN relativos foram normalizados para mRNA GAPDH.

xenoenxertos e Tratamento Procedimentos

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Animal da Universidade de Xiamen. As células tumorais (DLD-1, 2 × 10

6) foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus atímicos (BALB /c, 4-5 semanas de idade). Quando o volume do tumor atingiu 25-35 mm

3, os animais foram randomizados e atribuídos a diferentes grupos de tratamento (n = 6 em cada grupo). Os animais foram injectados por via intraperitoneal com PZQ sozinho (100 mg /kg), a PTX sozinho (30 mg /kg), ou uma combinação de PZQ (100 mg /kg) e a PTX (30 mg /kg). PTX foi dissolvido em volumes iguais de Cremophor EL e de etanol, e em seguida diluído com PBS antes da injecção. PTX foi determinado nos dias 5, 9, e 13 após a injecção das células tumorais. PZQ dissolvidos em óleo de milho foi dado nos dias 5, 7, 9, 11 e 13 após a injecção de células tumorais. Para o tratamento com um único agente, veículo foi apresentado no lugar de PZQ ou PTX com a mesma programação. O tamanho do tumor foi determinada utilizando compassos de calibre. O volume do tumor (mm

3) foi calculada pela fórmula: (a) x (b

2) × 0,5, em que um comprimento do tumor e b é a largura é de tumor em milímetros

Análise estatística.

Os valores foram expressos como média ± SEM. Para determinar diferenças significativas nos dados,

t

teste foi aplicado de Student não emparelhado de duas caudas. Diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a P 0,05. As interações medicamentosas foram examinados para sinergismo ou antagonismo utilizando análise Mediana Dose Efeito. (CalcuSyn; Biosoft, Ferguson, MO)

Resultados

PZQ não exerce qualquer citotoxicidade nas células tumorais

A citotoxicidade de PZQ em várias células de tumor foi examinado pela primeira vez com linhas de células tumorais, incluindo células de cancro do pulmão (SPC-A-1, Ltep-A-2 e H1299), células de cancro da mama (Bcap37 e ZR7530), células do carcinoma do colo do útero (HeLa ) e células cancerígenas do cólon (DLD-1). No entanto, nem PZQ induzida a inibição do crescimento ou a apoptose mesmo a concentrações tão elevadas como 100 uM (Fig. S1), indicando que o PZQ não exerceu qualquer citotoxicidade nas células tumorais.

O co-tratamento de PTX e PZQ sinergicamente inibe tumor Cell Growth

a seguir, avaliou se PZQ pode afetar a sensibilidade das células tumorais a agentes quimioterápicos, tais como paclitaxel (PTX) por ensaio MTT. Descobrimos que PZQ melhorou substancialmente a inibição do crescimento por PTX em várias linhas celulares tumorais incluindo duas linhas de células resistentes a PTX, DLD-1 e H1299 (Fig. 1a, Fig. S2). Nós fizemos a maioria das nossas experiências seguintes com estas linhas de células resistentes à PTX dois. Para obter mais conhecimentos sobre o efeito de combinação, foram realizados estudos de dose-resposta como mostrado na Fig. 1B. PZQ poderia aumentar a sensibilidade de células DLD-1 a PTX, a diferentes concentrações de PTX e PZQ. ensaio de formação de colónia, também mostraram que a combinação de PZQ e PTX notavelmente suprimida a formação de colónias em comparação com o tratamento quer um dos agentes isoladamente (Fig. 1C). análise mediana Dose Efeito foi utilizado para caracterizar as interações entre PZQ e PTX no que diz respeito a declinar na viabilidade celular. Combinação de valores do índice de 1.0, derivado do efeito de uma gama de concentrações e PZQ PTX em DLD-1 e de células H1299 linhas, indicado um efeito sinérgico entre o PZQ e PTX

(A (Fig 1D.). ) A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT depois de várias linhas celulares de cancro foram tratadas com PZQ sozinho, PTX isoladamente ou combinados ambos os fármacos em concentrações e pontos de tempo como indicado a seguir: HeLa, ZR7530, as células DLD-1 e H1299 foram tratadas com 20? M PZQ sozinho, 10 nM PTX sozinho, ou combinado tanto durante 48 h; Bcap37 e células SPC-A-1 foram tratadas com 30? M PZQ, 5 nM PTX sozinho, ou ambos, durante 48 h; Ltep-A-2 As células foram tratadas com 30? M PZQ sozinho, 5 nM PTX sozinho, ou ambos, durante 60 h. (B) DLD-1 foram tratadas com as concentrações indicadas de PTX na ausência ou na presença de 20 uM ou 40 PZQ durante 48 h. A viabilidade das células foi então determinada por ensaio MTT. (C) DLD-1 e H1299 células foram tratadas com 20? M PZQ sozinho, 10 nM PTX sozinho, ou a combinação de 10 dias. As colónias foram então coradas com violeta de cristal e contadas. As células DLD-1 e H1299 (D) foram tratados com várias concentrações de PZQ e PTX em uma razão fixa (2000:1) durante 48 h. Após a viabilidade das células foi determinada para cada condição, o índice de combinação (Cl) foi calculada tal como descrito em “Materiais e Métodos”. Os valores de CI 1,0 sugerem uma interacção sinérgica entre os dois fármacos. Todos os valores representam a média ± SEM de três experiências separadas.

efeito da combinação de PZQ e PTX na apoptose Indução

Para confirmar ainda mais a potenciação da morte celular induzida por PTX por PZQ, analisou-se extractos de células para a expressão de marcadores de apoptose, tais como poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) de clivagem. A combinação resultou na clivagem marcada da PARP em uma variedade de diferentes linhas de células, enquanto que a administração de PZQ ou PTX sozinho fez não (Fig. 2A), indicando a activação significativa da cascata apoptótica por esta combinação. Além disso, a percentagem de população sub-G1 foi determinada por citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 2B, em comparação com o tratamento com qualquer agente isoladamente, o co-tratamento de PTX com PZQ marcadamente aumentou a acumulação de células na fase sub-G1. Nós também confirmaram estes resultados por coloração nuclear com DAPI, um ensaio alternativo apoptose celular. A percentagem de células com núcleos apoptóticos foi significativamente maior no grupo de combinação do que no grupo de tratamento única (dados não mostrados). A seguir, examinaram a contribuição de caspases para a apoptose induzida pelo co-tratamento de PTX e PZQ. Como mostrado na Fig. 2C, a activação de caspase 3 e PARP de clivagem foram bloqueados por o inibidor de largo espectro de caspases zVAD-fmk. O tratamento com zVAD-fmk bloqueou também significativamente a apoptose induzida pelo co-tratamento de PTX e PZQ (Fig. 2D). Estes resultados sugerem que a apoptose celular induzida pelo co-tratamento de PTX e PZQ dependia actividade da caspase.

As linhas celulares indicadas (A) foram tratados como na Fig. 1A, e apoptose foi examinado por análise de Western da PARP clivada nível (cle-PARP). As células DLD-1 e H1299 (B) foram tratadas com 20? M PZQ sozinho, 10 nM PTX sozinho, ou a combinação durante 48 h. Em seguida, sub-G1 fracção foi determinada por citometria de fluxo. (C) DLD-1 As células foram tratadas com PZQ 20 pM e 10 nM de PTX na ausência ou na presença de 20 uM de inibidor de caspase zVAD-fmk, durante 48 h, e a expressão da caspase 3 e cle-PARP foram analisados ​​por Western blot. (D) Depois de as células DLD-1 foram tratadas como em C, a percentagem de células apoptóticas foi determinada por coloração com DAPI. Todos os valores representam a média ± SEM de três experiências separadas.

O co-tratamento de PZQ e PTX poderia induzir paragem da mitose nas células tumorais

A citometria de fluxo foi utilizada para examinar os efeitos da PZQ e PTX sobre a distribuição do ciclo celular de células de tumor. O co-tratamento de PTX PZQ e dependente da dose, aumentou a população G2 /M, em comparação com o tratamento com PTX sozinho em células DLD-1 (Fig. 3A). Para clarificar o perfil de células G2 /M-acumulados induzidas pela combinação, examinámos índice mitótico nas células DLD-1 tratadas com PTX na ausência ou na presença de PZQ. Como esperado, o tratamento de PTX sozinho dependentemente da dose o aumento do índice mitótico (Fig. 3B). PTX em combinação com PZQ ainda levou a um aumento no índice mitótico (Fig. 3B). Nós também descobrimos que poderia promover PZQ dramaticamente aumento PTX mediada no nível de fosforiladas histona H3 (Ser-10) (P-H3), um marcador mitótico (Fig. 3C) expressão. Estes resultados sugerem que o PZQ reforçada paragem da mitose induzida por PTX em células tumorais.

células DLD-1 (A) foram tratadas com 10 nM ou 20 nM de PTX na ausência ou na presença de 20 uM PZQ durante 12 h, e o ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo. Os resultados são representativos de três experiências independentes. Após DLD-1 As células foram tratadas tal como acima, índice mitótico foi determinada como descrito em “Materiais e Métodos” (B), e o nível de H3 fosfo-histona expressão (Ser-10) (P-H3) foi monitorizada por Western blot ( C). Os valores representam a média ± SEM de três experiências separadas.

Uma experiência ao longo do tempo com base na citometria de fluxo demonstraram que o aumento em G2 /M população que precedida da população sub-G1 em células DLD-1 tratados com a combinação de PZQ e PTX (Fig. 4A), indicando persistente G2 /M prisão conduziu provavelmente a apoptose. Nós, então, examinou se havia uma correlação entre a paragem da mitose e apoptose induzida pela co-tratamento de PZQ e PTX. Um inibidor de CDK, roscovitina, foi usado. Roscovitina poderia inibir selectivamente CDK1, CDK2 e CDK5 e progressão do ciclo celular bloco, evitando que as células entrem nas fases S e M [32]. Como mostrado na Fig. 4B, inibiu quase completamente a roscovitina G2 /M detenção induzida pelo co-tratamento de PTX na PZQ e células DLD-1. O aumento do índice mitótico resultou a partir do co-tratamento de PTX PZQ e também devolvido para o nível de controlo após a adição de roscovitina (Fig. 4C), indicando que a roscovitina inibiu a paragem da mitose induzida por esta combinação. Surpreendentemente, também inibiu a roscovitina PZQ-PTX aumentada apoptose mediada quase completamente, como determinado pelo sub-população apoptótica G1 e análise de Western de PARP clivada (Fig. 4D e E). Resultados semelhantes foram obtidos com células H1299 (dados não mostrados). Estes dados sugerem que o aumento da apoptose induzida pelo co-tratamento de PTX PZQ e provavelmente resultou de um aumento da paragem da mitose induzida por esta co-tratamento.

(a) Após as células DLD-1 foram co-tratados com 20 uM PZQ e 10 nM PTX para pontos de tempo indicados, as fracções de G2 /M e sub-G1 foram determinados por citometria de fluxo. células (B) DLD-1 foram tratados com uma combinação de PZQ (20 uM) e a PTX (10 nM), com ou sem a 12,5 uM roscovitina durante 12 h, e depois do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo. células (C) DLD-1 foram tratadas como em (B), e determinou-se o índice mitótico. Após DLD-1 foram tratados com uma combinação de PZQ (20 uM) e a PTX (10 nM) na presença ou ausência de 12,5 uM roscovitina durante 48 h, a apoptose foi avaliada por citometria de fluxo de análise da população Sub-G1 (D) e análise de western de nível cle-PARP (E). Todos os valores são apresentados como média ± SEM de três experiências separadas.

O co-tratamento de PZQ e PTX poderia Down-regulação de XIAP Protein

Para avaliar o mecanismo subjacente da citotoxicidade sinérgica entre PZQ e PTX, foram avaliados os efeitos dos dois agentes, quer isoladamente quer em combinação, em várias proteínas de regulação de apoptose em células DLD-1. Como mostrado na Fig. 5A, o tratamento com PZQ ou PTX sozinhos não alterou a expressão de XIAP. No entanto, a exposição das células à combinação de PZQ e PTX, resultou numa diminuição notável no nível de XIAP. Não ocorreram alterações significativas na expressão de outras proteínas, tais como Bcl-X

L, sobrevivendo, Puma, Bim, Noxas, Bax e Bak, foram observadas em células expostas a PTX sozinho, PZQ sozinho, ou a combinação.

(a) DLD-1 as células foram tratadas com 20? M PZQ sozinho, 10 nM PTX sozinho, ou a combinação durante 24 h. Em seguida, a expressão de Bcl-XL, Bcl-2, Survivina, XIAP, Bim, Puma, Noxas, Bax e Bak foram monitorizadas por Western blot. (B) Após a exposição das células DLD-1 para uma combinação de PZQ 20 pM e 10 nM de PTX na presença ou na ausência de 20 uM zVAD-fmk durante 24 h, a expressão de XIAP foi determinada por Western blot. (C) H1299 células foram tratadas com 20? M PZQ sozinho, 10 nM PTX sozinho, ou a combinação durante 24 h, após o que a expressão de XIAP foi examinada. (D) Depois de as células DLD-1 foram tratadas como em (A), o ARN total foi isolado e ARNm de XIAP foi quantificada pelo tempo real de RT-PCR. Após normalização para ARNm de GAPDH, os valores da expressão de ARNm de XIAP, para cada condição foram relativamente a células de controlo tratados com veículo. células (E) DLD-1 foram tratados com uma combinação de PZQ 20 uM e 10 nM de PTX na ausência ou na presença de 10 uM MG132 durante 24 h, e, em seguida, a expressão de XIAP foi monitorizada por Western blot. Os valores representam a média ± SEM de três experiências separadas.

Para determinar se as alterações na expressão de XIAP era dependente da activação de caspase, que trataram células DLD-1 com a combinação de drogas, na presença ou ausência do inibidor de caspase zVAD-fmk. Como mostrado na Fig. 5B, zVAD-fmk teve pouco efeito sobre a sub-regulação de XIAP induzida pela combinação de PZQ e PTX, indicando que as alterações na expressão de XIAP era independente de caspase. A sub-regulação de XIAP também foi observada em células co-H1299 tratadas com PZQ e PTX (Fig. 5C), sugerindo que a modulação desta proteína podem não ser a linha celular específica.

tentaram identificar o mecanismo através que XIAP foi regulada em resposta à co-tratamento de PZQ e PTX. Para investigar se o co-tratamento de PTX PZQ e pode regular a expressão de XIAP ao nível da transcrição, utilizou-se a transcrição reversa-PCR. Comparado com o grupo controle, o tratamento combinado com PZQ e PTX não levar a mudanças significativas nos níveis de mRNA de XIAP (Fig. 5D).

Outra possível explicação para XIAP down-regulação pode constituir degradação do XIAP por proteassoma. Para testar esta hipótese, foram tratadas células DLD-1 com a combinação de drogas, na presença de um inibidor de proteassoma, MG132. Supressão de XIAP em células DLD-1, tratado com a combinação de PZQ e PTX foi quase completamente abolido pela MG132 (Fig. 5E). Estes resultados indicaram que PZQ e PTX pode induzir a degradação XIAP através da via mediada por proteassoma.

XIAP desempenha um papel importante na sinérgica citotoxicidade do PZQ e PTX

Com base nos resultados acima, investigaram se a regulação negativa de XIAP realmente mediado morte celular induzida pela combinação de PZQ e PTX. Nós transientemente transfectadas células DLD-1 com um plasmídeo contendo XIAP marcada com epitopo (myc-XIAP) e um plasmídeo vazio que serviu como um controlo. A transfecção foi confirmada por Western blot (Fig. 6A). A sobre-expressão de XIAP em células DLD-1 significativamente atenuada-PZQ citotoxicidade melhorada PTX-induzida, tal como determinado por análise de viabilidade celular e população sub-G1 (Fig. 6B e C).

(A) Western blot mostrou expressão de XIAP em células DLD-1 às 24 h após a transfecção com o vector de controlo pcDNA3-myc-XIAP ou. (B) 24 horas após a transfecção com pcDNA3-myc-XIAP e vector de controlo, as células DLD-1 foram tratadas com 20? M PZQ sozinho, 10 nM PTX sozinha ou a combinação durante 48 h, e, em seguida, a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. (C) 24 horas após a transfecção com pcDNA3-myc-XIAP e vector de controlo, as células DLD-1 foram tratados com uma combinação de PZQ 20 uM e 10 nM de PTX. Em seguida, a fracção de sub-G1 foi determinada por citometria de fluxo. células (D) DLD-1 foram infectadas com um controlo de codificação de XIAP lentivírus shRNA ou shRNA durante 48 h, e a expressão de XIAP foi analisada por Western blot. (E) As células DLD-1 foram infectadas com um controlo de codificação de XIAP lentivírus shRNA ou shRNA durante 48 h, e depois tratou-se com 20 uM PZQ sozinho, 10 nM PTX isoladamente ou a combinação durante 48 h. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. Todos os valores são apresentados como média ± SEM de três experiências separadas.

Para aprofundar o estudo do papel da XIAP na sinergia entre PZQ e PTX, usamos lentivírus mediada por RNA curto hairpin (shRNA) para knockdown XIAP em células DLD-1. As células foram colhidas 48 h após a infecção, e a expressão de XIAP foi analisada por Western blot. Comparado com DLD-1 de células infectadas com o shRNA controle, células infectadas com XIAP shRNA exibida dramaticamente suprimida a expressão de XIAP (Fig. 6D). A seguir, avaliou o efeito de XIAP knockdown na viabilidade celular. Como mostrado na Fig. 6E, bloqueando a expressão de XIAP não teve nenhum efeito sobre a sensibilidade das células DLD-1 para o tratamento PZQ. No entanto, XIAP knockdown sensibilizados significativamente as células DLD-1 a citotoxicidade induzida por PTX (Fig. 6E). Além disso, a citotoxicidade induzida pelo co-tratamento de PTX PZQ e também foi melhorada em células DLD-1-XIAP knockdown (Fig. 6E). Estes dados sugerem que XIAP desempenha um papel importante na mediação da citotoxicidade sinérgica causada pela co-tratamento de PTX e PZQ.

A combinação de PZQ e PTX suprime o crescimento do tumor

In vivo

Para testar se o co-tratamento de PZQ e PTX tem qualquer efeito sobre o crescimento do tumor

in vivo

, foi estabelecido um modelo de xenoenxerto em ratinhos nus com células resistentes a PTX DLD-1. Injectadas subcutaneamente células DLD-1 deu origem a crescer exponencialmente tumores em ratinhos nus atímicos (Fig. 7A). O tratamento combinado com PZQ e PTX suprimiu significativamente o crescimento do tumor em relação ao tratamento de PTX sozinho, enquanto que PZQ administrado sozinho não foi capaz de inibir o crescimento tumoral nos murganhos portadores de xenoenxertos DLD-1 (Fig. 7A e B). Em comparação com o grupo de controlo, o tratamento com a combinação PZQ e PTX resultou numa 50% de redução no peso do tumor (Figura 7C.).