Sumário
O aumento da expressão de Bcl-xL em cancro tem sido demonstrado que confere resistência a uma vasta gama de estímulos apoptóticos e para modular um número de outros aspectos da fisiologia celular, incluindo o metabolismo da energia, do ciclo celular, autofagia, fissão mitocondrial /fusion e adesão celular. No entanto, apenas algumas destas actividades têm uma explicação mecanicista. Aqui utilizou-se a purificação de afinidade em tandem para identificar proteínas que interagem Bcl-xL novos que poderiam explicar os efeitos pleiotrópicos de sobre-expressão Bcl-xL. Entre as várias proteínas co-purificar com Bcl-xL, nós nos concentramos em Praf2, uma proteína com um papel previsto no tráfico. foi encontrada a interacção de Praf2 com Bcl-xL de ser dependente do domínio de transmembrana de Bcl-xL. Descobrimos que a Bcl-2 interage também com Praf2 e que a Bcl-xL e Bcl-2 pode também interagir com Arl6IP5, um homólogo de Praf2. Curiosamente, a sobre-expressão de Praf2 resulta na translocação da Bax para a mitocôndria e a indução de morte celular apoptótica. Praf2 morte celular dependente é impedida pela co-transfecção de Bcl-xL, mas não por seu domínio transmembranar suprimido mutante. Assim, knock-down de Praf2 aumenta clonogenicidade de células U2OS após o tratamento etoposídeo, reduzindo a morte celular. Em conclusão uma tela para Bcl-XL-interagindo proteínas da membrana vamos identificar uma nova proteína pró-apoptótica cuja actividade é fortemente combatido exclusivamente por membrana alvo Bcl-xL
Citation:. Vento MT, Zazzu V, Loffreda A, Cruz JR, J descendente, Stoppelli MP et ai. (2010) Praf2 é um romance Bcl-xL /Bcl-2 proteína de interação com a capacidade de modular a sobrevivência de células cancerosas. PLoS ONE 5 (12): e15636. doi: 10.1371 /journal.pone.0015636
editor: Rafael Linden, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil
Recebido: 9 de setembro de 2010; Aceito: 18 de novembro de 2010; Publicação: 20 de dezembro de 2010
Direitos de autor: © 2010 Vento et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Associação de Câncer Research International, Grant Ref .: 05-0416 (https://www.aicr.org.uk/index.stm), e da Fundação Europeia da Ciência (FSE), Eurocore rede na membrana Arquitetura e Dynamics, Contrato n.LSHC-CT-2003-503297, para MPS Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a capacidade adquirida para escapar apoptose é necessária em várias etapas durante o desenvolvimento do câncer. A sobre-expressão da proteína Bcl-XL é conhecido para conferir resistência a uma vasta gama de estímulos potencialmente apoptóticos que surgem durante o desenvolvimento do cancro, tais como a activação de oncogenes, hipoxia e matriz descolamento [1] – [3]. apoptose prejudicada devido à sobre-expressão do gene Bcl-XL é, portanto, fundamental durante a progressão do câncer. apoptose prejudicada é também uma importante barreira para o tratamento eficaz do cancro, porque terapias citotóxicas para o câncer dependem fortemente na indução de apoptose. Curiosamente, a Bcl-XL tem sido sugerido para desempenhar um papel único da resistência geral a agentes citotóxicos, devido a uma correlação notável entre um aumento do nível de expressão de Bcl-xL e resistência a uma grande painel de agentes de quimioterapia convencionais. mecanismo de acção do Bcl-XL é, portanto, um importante componente de quimiorresistência em células [4] cancerosas. Bcl-xL pertence à família Bcl-2 de proteínas cujos membros podem ter ou anti-apoptótica ou funções pró-apoptóticos. Os membros pró-apoptóticos da família Bcl-2 caem em dois subconjuntos. Os assim chamados factores de vários domínios (Bax e Bak) são proteínas que partilham mais do que um domínio de homologia de Bcl-2 (BH). A outra subfamília compreende proteínas que compartilham apenas o domínio BH3. Uma imagem surgiu sugerindo que “BH3 apenas” proteínas têm diversos mecanismos de regulação e são sensores de diferentes fontes de estresse celular alvo. Sua função principal parece ser a ligação e neutralização dos anti-apoptóticos membres da família Bcl-2 [5], embora alguns deles também foram relatados para ser capaz de ativar diretamente os membros da família proapoptotic vários domínios [6], [7]. é, portanto, amplamente aceito que elevou Bcl-x nível de proteína diminui a susceptibilidade à apoptose, porque aumenta o potencial celular para inativar pró-apoptóticos “BH3 apenas” proteínas [8].
Além de sua capacidade de inibir a apoptose núcleo máquinas, Bcl-xL foi mostrado para modular um número de outros aspectos da fisiologia celular. A sua sobre-expressão, por exemplo, tem sido correlacionada com o grau do tumor alta e aumento da capacidade de invadir e metástase, independentemente da sua capacidade para sustentar a sobrevivência na ausência de ligação da matriz [9] – [11]. Bcl-xL foi encontrado para complementar
S. cerevisiae
genes que facilitam a passagem de glicolítico para metabolismo oxidativo [12]. Bcl-xL também é capaz de modular a homeostase do cálcio [13], estimular a formação de sinapses [14], a progressão do ciclo celular lenta [15], modular autofagia [16], [17], aumentar mitocondrial fissão /fusão [18] e modulam metabolito troca através da membrana mitocondrial externa [19]. Algumas destas actividades Bcl-xL “convencionais” podia ser explicada pela sua capacidade para interagir com outros factores que os pró-apoptóticas “única” proteínas de BH3. Bcl-xL foi de facto demonstrado que interagem com VDAC1 [20], com a IP3 do receptor [21], com Beclin1 [22] e uma série de outras proteínas.
Bcl-XL é tanto um citosólico e uma associada à membrana da proteína [23]. Enquanto citosólica Bcl-xL parece ser um homodímero [24], a estrutura quaternária de ligada à membrana Bcl-xL não foi investigada em detalhes, embora tenha sido relatado que pode ser envolvido em complexos de elevado peso molecular [25] ( Borner comunicação pessoal). No presente estudo, apresentamos evidências de que a Bcl-XL é de fato parte de complexos de alto peso molecular e tentamos realizar uma análise abrangente de proteínas capazes de se ligar Bcl-xL usando Tandem Affinity Purificação. Curiosamente, verificou-se que a Bcl-xL interage com proteínas envolvidas em diversos processos celulares. Entre eles, a via secretora foi uma das vias mais representadas. Com o objetivo de validar a lista de proteínas encontradas para interagir com Bcl-xL, decidimos concentrar a nossa análise sobre a interação entre a Bcl-xL e Praf2, uma pequena proteína pertencente à família PRENILADOS Rab Acceptor, com um papel previsto em ER de Golgi de transporte [26]. Mostramos que Praf2 induz a morte celular por apoptose após expressão e que a Bcl-xL neutraliza a actividade apoptótica de Praf2. Finalmente, mostra-se que o silenciamento Praf2 em células U2OS torna-los mais resistentes a apoptose induzida pelo etoposido droga citotóxica.
Resultados
Para investigar a possibilidade de que a Bcl-xL está associado com proteínas de membrana em complexos de elevado peso molecular, utilizou-se fraccionamentos de gradiente de sacarose de solubilizadas em CHAPS células inteiras extractos. A análise foi realizada utilizando a linha celular U2OS porque expressa níveis elevados de Bcl-xL e parece ser “viciado” a expressão de Bcl-xL de sobrevivência (não mostrado). extractos de células-compensados Pré foram carregados em gradientes de sacarose e submetidas a ultracentrifugação, tal como especificado em Materiais e Métodos. As fracções foram recolhidas, resolvidas por SDS-PAGE e analisados por imunotransferência. A Figura 1 mostra que as proteínas de baixo peso molecular tais como citocromo C (12 kDa), Rab 4 (25 kDa) ou Bax (20 kDa) estão presentes nas fracções do gradiente onde se espera que as proteínas de baixo peso molecular para sedimentar. Bcl-x, em vez disso, está espalhada em fracções que variam de baixo a alto peso molecular. Este resultado sugere que, nestas condições experimentais Bcl-xL poderia ser envolvido em uma série de complexos moleculares diferentes.
fraccionamento em gradiente de sacarose dos extratos celulares totais U2OS. U2OS (60 × 10
6) As células foram lisadas em tampão de extracção com CHAPS e clarificada por centrifugação. Os extractos foram fraccionadas utilizando um gradiente de sacarose 10-40% e volumes iguais das fracções foram analisadas por imunotransferência quanto à presença da proteína Bcl-xL, Bax, Rab4 e Citocromo C.
Criação de células HeLa que expressam a TAP-Bcl-xL proteína quimera
a fim de identificar o conjunto de proteínas que interagem com Bcl-xL nas condições analisadas, fizemos uso de Tandem Affinity Purification [27], [28]. Bcl-XL é uma proteína ancorada-cauda que adquire a localização da membrana de inserir a cauda hidrófoba C-terminal na bicamada lipídica de vários compartimentos membranares. Para evitar a interferência com a inserção na membrana de Bcl-xL, que gerado um vector que expressa a colocação de uma etiqueta TAP na extremidade N-terminal da proteína Bcl-xL. Também obtido um vector de controlo em que um codão de terminação foi adicionado a jusante da sequência de TAP. Ambas as construções foram transfectadas em células HeLa para se obter clones que expressam de forma estável, quer a TAP-Bcl-xL ou única TAP-parar. Nós escolhemos células HeLa, porque eles podem ser facilmente adaptados ao crescimento em culturas em suspensão, a fim de produzir um material adequado para purificações bioquímicos de partida. Ao contrário U2OS, células HeLa, além disso, tem um nível relativamente baixo de expressão endógena de Bcl-xL (Figura S1), o qual pode competir com a TAP-Bcl-xL de parceiros de ligação. Para testar se a adição da etiqueta TAP para Bcl-xL podia prejudicar a sua capacidade para proteger contra a apoptose, que desafiados células que expressam TAP-Bcl-xL (HeLa /TAP-Bcl-XL) ou TAP-paragem (HeLa /TAP) com irradiação UV e analisado o estado de clivagem de PARP, como uma medida da actividade celular de caspase 3. Como mostrado na Figura 2A, em comparação com a TAP-stop, HeLa que expressam TAP-Bcl-xL exibiu um nível reduzido do produto de clivagem de PARP. Por conseguinte, a adição da etiqueta TAP para o N-terminal da proteína Bcl-xL não impede a capacidade de Bcl-xL para proteger as células da apoptose induzida por UV. A seguir testou se a adição da etiqueta TAP para Bcl-xL podia alterar a sua distribuição subcelular. células HeLa /TAP-Bcl-XL foram fracionados em citosólica (S100), nuclear (núcleos), membranas pesadas (HMM) e frações de membranas de luz (LMM) por centrifugação diferencial. Localização subcelular de TAP-Bcl-xL endógeno em comparação com Bcl-xL foi analisada por imunotransf erência. A análise foi realizada usando quantidades equivalentes de proteínas de cada fracção determinada e não é informada sobre a distribuição relativa das proteínas analisadas em diferentes compartimentos celulares. A qualidade do fraccionamento foi definida utilizando anticorpos contra marcadores conhecidos de compartimentos subcelulares: PARP para a fracção nuclear, Sec23 para a fracção de microssomas (LMM) e Citocromo C para a fracção HMM (mitocôndria). Também foi avaliada a localização de Bax, outro membro da família de proteínas Bcl-xL, que é conhecido para localizar tanto na mitocôndria um no citosol. A Figura 2B mostra que, de forma semelhante ao endógena de Bcl-xL, Bcl-TAP-xL concentra em a fracção HMM, ao LMM e as fracções S100. Por conseguinte, a adição da etiqueta TAP não interfere com a capacidade de Bcl-xL para adquirir a localização da membrana.
(A) células HeLa que expressam de forma estável com a etiqueta TAP-Bcl-xL são mais resistentes do que o controlo para induzida por UV apoptose. Análise da clivagem PARP em células HeLa que expressam TAP sozinho ou TAP-Bcl-xL e irradiado ou não com UV (200 J /m
2). As células foram recolhidas 2 e 4 horas após a irradiação e analisados por imunotransf erência para a aparência do produto clivado da PARP. (B) com a etiqueta TAP-Bcl-xL concentra em o mesmo compartimento intracelular endógena de Bcl-xL. células HeLa que expressam TAP-Bcl-xL foram fraccionados por centrifugação diferencial para obtenção de: pista 1, proteínas citosólicas (S100); pista 2, proteínas nucleares (núcleos); pista 3, a fracção da membrana pesada (HMM); pista 4, a fracção de membrana de luz (LMM). 20 ug de cada fracção foram analisadas por imunotransferência quanto à presença de TAP-BclxL (utilizando apenas anticorpo secundário) e Bcl-xL endógeno. A qualidade do fraccionamento foi determinada usando os anticorpos contra Sec23 (LMM), citocromo C (HMM), Bax (S100 e HMM) e PARP (núcleos). células (C) HeLa transfectadas de forma estável com a TAP sozinho ou TAP-Bcl-xL foram submetidos a Tandem Affinity Purificação. A figura mostra um representante corado com Coomassie SDS-PAGE efectuada sob condições de redução usados para resolver os eluatos a partir de purificações. Purificações foram realizadas utilizando extractos de CHAPS membrana a partir de células HeLa que expressam TAP sozinho (pista 1) ou de HeLa que expressam TAP-Bcl-xL (faixa 2).
Identificação de proteínas Bcl-xL-novos que interagem usando afinidade em tandem purificação
a fim de produzir um material de partida adequado para purificações TAP, HeLa /TAP-Bcl-xL e HeLa /células TAP foram adaptadas para crescimento em cultura de suspensão usando garrafas de vidro que giram. Dado o nosso interesse em interações membrana base que escolhemos para se concentrar em purificações realizada utilizando extratos de membrana. As pelotas de células foram lisadas mecanicamente através de um homogeneizador de Dounce, num tampão hipotónico sem detergente. A centrifugação do lisado celular última permitiu separar as membranas totais a partir de proteínas citosólicas. Total de membranas foram extractadas utilizando um tampão contendo CHAPS, e sujeito a purificação por afinidade em tandem. Os eluatos a partir do último passo de purificação foram concentradas e resolvidos em SDS-PAGE. FIG. 2C mostra imagens representativas de purificações TAP analisados em geles corados com Coomassie de-TAP apenas as células que expressam (pista 1) ou TAP-Bcl-xL de células (pista 2) que expressam. material de pequeno surgiu das purificações feitos a partir de células que expressam TAP única, indicando que o fundo determinado por adsorção não específica ao meio cromatográfico utilizado é negligenciável. As bandas correspondentes à espécie de proteína mais abundantes foram cortados dos géis e a sua identidade foi determinada por LC-MS /MS. Uma lista de proteína encontrada para co-eluir com TAP-Bcl-XL é mostrado na Tabela 1.
Bcl-x é capaz de interagir com proteínas envolvidas em diversos processos celulares
embora a lista de Bcl-xL interagindo proteínas apresentadas na Tabela 1 não pode ser considerada exaustiva, pode considerar-se uma lista de confiança elevada. Temos subdividida todas as proteínas identificadas em diferentes categorias funcionais e para cada proteína que tenha especificado o sub-celular de localização conhecida ou putativa. Nós também afirmaram se a proteína já haviam sido encontrados anteriormente para interagir com Bcl-xL. É interessante notar que a maioria dos membros anti-apoptóticos da família de proteínas Bcl-2 que foram previamente descritos para interagir com Bcl-xL estão presentes no eluato final. VDAC1 também foi já descrito para interagir com Bcl-xL [20], enquanto VDAC2, uma isoforma menos abundantes, foi mostrado para interagir com o multidomínio membro da família Bcl-2 Bak [29]. ATP2A2 /SERCA2 em vez disso, tem sido relatado para interagir com Bcl-2 [30]. Em geral, a presença destas proteínas no eluato final do nosso purificação constitui uma boa indicação da especificidade das interacções encontrados. Além dos membros da família Bcl-2, montamos um grupo de proteínas que são todos mitocondrial e são funcionalmente envolvido no metabolismo energético e fisiologia mitocondrial. Este grupo inclui 10 das 17 subunidades da ATP sintase multiprotein complexos, subunidades II e IV do citocromo c oxidase e citocromo b5 tipo B, toda a parte da cadeia bioquímica responsável pela fosforilação oxidativa e produção de ATP. Também inclui sintetase mitocondrial carbamoil-fosfato de 1, que desempenha um papel importante na remoção do excesso de amoníaco a partir da célula, e VDAC1 e 2, principais reguladores da permeabilidade mitocondrial. Neste grupo foram incluídos mais duas proteínas mitocondriais identificados como Bcl-xL associado: Stomatin como proteína-2 (StomL2) e proibitina 2. StomL2 foi recentemente mostrado para ser parte de um complexo com Mitofusin 2 [31] enquanto proibitina 2 é suposto a desempenhar um papel na regulação da respiração mitocondrial.
Outro conjunto de proteínas poderiam ser agrupadas na categoria funcional dos transportadores. Eles estão localizados em diferentes compartimentos da membrana, e são: o SLC3A2 transportador de amino ácido; a membrana celular de Na + /K + ATPase, transportador ATP1A1; o transportador de cálcio ER residente ATPase ATP2A2 /SERCA2; o receptor de transferrina, que pode ser visto como um transportador atípico. Um quarto grupo funcional de proteínas, directa ou indirectamente associadas a Bcl-XL é composta de proteínas com um papel putativo ou estabelecido no ramo secretora do tráfico intracelular. Aqueles são componentes do complexo de translocação (beta Sec61, Sec11A), acompanhantes envolvidas no dobramento de proteínas assistência no ER (Calnexina), proteínas envolvidas em modificações ER específicos de proteína (Ribophorin I, OST48, MPDU1) e proteínas com um papel putativo em ER para Golgi trasport (Sec22b, ERGIC-32, TMP21, TMED5, Praf2), bem como a retenção de ER (SSR4, receptor de KDEL 1). Outras proteínas de tráfico associado com Bcl-xL foram RAB7 proporcionou, uma GTPase pequena, com um papel na maturação do endossoma tardio e VAMP3, uma proteína com um papel putativo em endossomas reciclagem. Finalmente, identificado como romance Bc-xL proteínas que interagem um conjunto de fatores, quer com função desconhecida ou muito mal descrito (Tabela 1).
Validação da interação entre Praf2 e Bcl-xL
A relação entre o ramo secretora do tráfico intracelular e a morte celular apoptótica é longe de serem compreendidos. Entre as proteínas recentemente identificadas, Praf2 tem sido sugerido para desempenhar um papel no ER para transporte de Golgi [26]. Praf2 pertence à família prenilados Rab Acceptor (PRA) de proteínas, cujo fundador, pra1 /Rabac1, foi mostrado para interagir com a Bcl-2 viral BHRF1 homólogo, e modular a sua actividade [32]. Para obter insights sobre a relação entre o transporte vesicular e apoptose, decidimos concentrar a nossa atenção sobre Praf2. O ADNc que codifica para Praf2 humana foi obtida a partir do consórcio IMAGEM e clonado em pcDNA3 com uma marcação tripla HA fundido no seu terminal-C. A fim de validar a interacção entre Praf2 e Bcl-xL, células 293T foram transfectadas quer com Praf2
HA e os plasmídeos de expressão de
FLAGBcl-XL sozinho ou co-transfectadas com ambos os plasmídeos. 24 horas após as transfecções foram células lisadas e imunoprecipitadas utilizando Praf2 foi conjugado de agarose anti-HA monoclonal. Como mostrado na Fig. 3A,
FLAGBcl-xL era detectável no precipitado apenas quando co-expressa com Praf2. Foi por isso capaz de confirmar a interacção de Bcl-xL e Praf2 também num sistema de dois componentes, em que a Bcl-xL e Praf2 são concomitantemente sobre-expresso.
células HEK 293T (A) ou foram transfectadas com HA com etiquetas Praf2 ou BclxL marcado com FLAG ou co-transfectadas com ambos os vectores de expressão. As amostras foram sujeitas a imunoprecipitação, utilizando agarose HA-conjugado anti e ambos os lisados totais (entradas) e eluato esferas de agarose (IP) foram analisados por imunotransf erência utilizando anticorpos anti anticorpos monoclonais anti-FLAG e HA. (B) As células U2OS foram transfectadas com HA-tagged Praf2 ou o vector vazio (Vec) e os lisados celulares foram sujeitos a imunoprecipitação, utilizando agarose de HA conjugado. Ambos os lisados e pérolas de agarose foram analisados por imunotransf erência utilizando anticorpos anti-anti Bcl-xL e HA.
A verificação de que Praf2 co-purificado com Bcl-xL por purificação de afinidade em tandem demonstra claramente que a Bcl-xL está capaz de interagir com Praf2 endógeno em células HeLa. Nós agora investigado se endógena de Bcl-XL é capaz de interagir com Praf2 em células U2OS. células U2OS foram transfectadas quer com vector vazio ou com a expressão vector Praf2
HA, e lisados foram immunoprecipitaed usando agarose anti-HA conjugado. Como mostrado na Fig. 3B, agarose anti-HA conjugado pode precipitar especificamente endógena de Bcl-xL em células U2OS transfectadas com Praf2
HA, mas não com o vector vazio.
Vários membros da família Bcl-2 são capazes de interagir com vários membros da família
PRA
o membro fundador da família de proteínas de PRA, pra1 /Rabac1, foi mostrado para interagir com o vírus homólogo de Bcl-2 BHRF1, mas não com a Bcl-2 em si [32] . Por isso, perguntado se a capacidade de ligação de Praf2 limitou-se a Bcl-xL ou poderia ser estendida para Bcl-2 bem. Nós também perguntado se o próximo homólogo de Praf2, Arl6IP5, também é capaz de interagir com Bcl-xL e /ou Bcl-2. FIG. 4 mostra que Praf2
HA pode também interagir com
FLAGBcl-2 (pista 4), e também que, Arl6IP5
HA pode interagir com ambos
FLAGBcl-xL e
FLAGBcl-2 ( pista 5 e 6). Arl6IP5
expressão HA resulta em bandas com mobilidade eletroforética diferente. Dado que todos eles são imunoprecipitados pelo anticorpo anti-HA, e dado que tem sido descrito que tanto Praf2 e Arl6IP5 pode dar origem a espécies de SDS-insolúveis [33], acreditamos que as bandas observadas correspondem aos monómeros, dímeros e multímeros de Arl6IP5 .
células HEK 293 foram transfectadas quer com BclxL marcado com FLAG ou a Bcl-2 isoladamente (pista 1 e 2), ou co-transfectadas com HA-tagged Praf2 ou marcada com HA Arl6IP5 (pistas 3 a 6) . As amostras foram sujeitas a imunoprecipitação, utilizando agarose HA-conjugado e os lisados e pérolas de agarose foram analisados por imunotransf erência utilizando anticorpos anti anticorpos anti HA e FLAG. Arl6IP5 monómero: *; Arl6IP5 dímero: **; Arl6IP5 multímero:. ***
O domínio transmembranar de Bcl-XL é essencial para a sua interacção com Praf2
A capacidade de Bcl-xL de interagir com os membros pró-apoptóticos da família Bcl-2 é conhecida por ser mediada por uma fenda hidrofóbica formada na sua superfície por os domínios BH1, BH2 e BH3 [34]. Por outro lado, a ligação de Bcl-2 /XL para Raf e Ras tem sido demonstrado que dependem do domínio BH4 [35], [36]. A fim de definir os domínios de Bcl-xL responsável pela sua interacção com Praf2, que gerado um mutante de Bcl-xL excluído dos seus primeiros 24 aminoácidos correspondente ao domínio BH4 (Bcl-xLΔBH4). Nós também gerado um mutante de Bcl-xL, em que a tirosina-101 foi substituído por uma lisina (Bcl-xLY101K) (Fig. 5A), uma mutação que foi descrito para abolir a capacidade da proteína Bcl-xL para interagir com Bax [37]. Por último, porque Praf2 é uma proteína de membrana [33], que gerado um mutante de Bcl-xL excluído dos 22 aminoácidos do terminal C correspondente ao seu domínio transmembranar (Bcl-xLΔTM). Como mostrado na Fig. 5B, nem a deleção do domínio BH4 nem a mutação Y101K afectava a capacidade de Bcl-xL para interagir com Praf2. No entanto, a deleção do domínio transmembranar C-terminal, aboliu completamente a interacção Praf2 /Bcl-xL, o que indica que o domínio TM é essencial para esta interacção.
(A) Representação esquemática das construções de expressão de Bcl-XL utilizada neste estudo. Bcl-XL: comprimento total Bcl-xL; Bcl-xLΔBH4: Bcl-xL faltam os primeiros 24 aminoácidos; Bcl-xLΔTM: Bcl-xL sem os últimos 22 aminoácidos; Bcl-xLY101K: Bcl-xL com uma substituição da tirosina 101 por lisina. (B) As células de HEK 293 foram co-transfectadas com HA-tagged Praf2 e as construções BclxL descritos em (a) realizar um identificador FLAG no terminal-N. As amostras foram sujeitas a imunoprecipitação, utilizando agarose HA-conjugado e os lisados e pérolas de agarose foram analisados por imunotransf erência utilizando anticorpos anti-HA e anti bandeira.
Praf2 superexpressão induz a morte celular por apoptose
é amplamente aceite que os níveis de proteína Bcl-xL elevados diminuem a susceptibilidade à apoptose por ligação e inactivação de proteínas pró-apoptóticas [8]. Além disso, foi relatado que a sobre-expressão de Yip3p (levedura pra1 /Rabac1 homólogo) severamente inibido o crescimento de células [38]. Por isso, se testado Praf2 sobreexpressão pode induzir a morte celular, e se esta poderia ser bloqueada pela expressão concomitante de Bcl-xL ou da Bcl-xLΔTM mutante que foi demonstrado ser incapaz de se ligar a Praf2. As células HeLa foram transfectadas apenas com vector, com Praf2 ou co-transfectadas com Praf2 e Bcl-xL ou Bcl-Praf2 e xLΔTM. FIG. 6A mostra que Praf2 transfecção resultou numa forte indução de morte celular, com quase 65% das células se tornarem PI positivo. morte celular induzida Curiosamente Praf2 foi completamente inibida pela transfecção concomitante de comprimento total de Bcl-xL, mas nenhuma inibição foi observada quando Praf2 foi co-transfectado com o mutante de Bcl-xLΔTM. Além disso, a morte celular induzida por Praf2 é acompanhado por activação da caspase como avaliada pela aparência da forma clivada da PARP. Mais uma vez, este fenómeno foi completamente bloqueada por Bcl-xL, mas não por o mutante de Bcl-xLΔTM (Fig. 6B). A inibição da clivagem de PARP induzida por Praf2 também foi evitada pela expressão concomitante de Bcl-2 (dados não mostrados).
(A) análise de FACS de células HeLa transfectadas com os vectores de expressão indicados e coradas com iodeto de propídio ( PI). Percentagens de células positivas PI são indicados no canto superior esquerdo de cada gráfico. (B) se alíquotas das células HeLa transfectadas como em (A) foram analisados por imunotransf erência para o aparecimento da forma de PARP clivada. Os níveis de expressão de Praf2, Bcl-xL e Bcl-xLΔTM também são indicados. (C) Análise de GFP-Bax localização em células U2OS transfectadas com vector vazio (VEC) ou marcada com HA Praf2. As fotografias são representativas das duas principais localizações GFP-Bax observados nas amostras: difusa citosólica e agregados. Acima das fotografias são indicados a% de células positivas para GFP com uma localização agregada após células com vector vazio ou marcada com HA Praf2 transfecção em dois experimentos independentes.
Em seguida, queríamos avaliar se Praf2 induzida apoptose envolvia a translocação da Bax para a mitocôndria, um evento precoce na via apoptótica intrínseca. Nós, portanto, cotransfectadas um GFP-Bax construir com Praf2 ou controle de vetores em U2OS. FIG. 6C mostra que a expressão da GFP em células-Bax U2OS pode ter ou uma coloração difusa citosólica, ou podem ser agregados em agregados. Nós mostramos anteriormente que a agregação de GFP-Bax, na mesma linha celular, foi coincidente com a disfunção mitocondrial, tal como medido por uma perda de ΔΨm [39]. Utilizou-se um excesso de Praf2-expressando plasmídeos ou vazias (Vec), a fim de obter todas as células receptoras que GFP-Bax também recebeu Praf2 e contados a% de células transfectadas com o sinal de GFP-Bax difusa ou agregados. O resultado apresentado na Fig. 6C mostra que a co-transfecção Praf2 foi associado a mais do que 30% de células que apresentem uma coloração agregada GFP-Bax, que diz respeito a apenas 2% observada em células co-tansfected vazio-vector.
knock-down de Praf2 aumenta a sobrevida celular
a seguir, queria para definir se a redução de expressão Praf2 por interferência de RNA poderia também influenciar a viabilidade celular. A linha de células U2OS do osteossarcoma expressa níveis relativamente elevados de Praf2. Nós knocked-down expressão Praf2 em células U2OS usando dois siRNAs diferentes visando diferentes regiões do mRNA Praf2 humano. A análise de Western blot de Praf2 mostra uma forte diminuição na expressão Praf2 no que diz respeito a células transf ectadas com o controlo (Fig. 7a). Nenhuma diferença morfológica óbvia era perceptível entre as células knock-down Praf2 controle e 72 horas após a transfecção em condições normais de crescimento. Por isso, perguntado se Praf2 silenciamento pode afectar a sensibilidade celular para o efeito tóxico de um agente quimioterapêutico tal como o etoposido. Como mostrado na Fig. 7B silenciamento de Praf2 com ambos os siRNAs escolhidos resultou numa redução de mais de 50% em caspase activação em relação às células de controlo transfectadas. Por conseguinte, clonogenicidade de células U2OS tratados com etoposido aumentou de menos de 20% das células transfectadas Ctrl para quase 60% em células Praf2 silenciados (Fig. 7C). A diminuição na activação da caspase observada após Praf2 RNAi não foi específico estímulo-apoptótica ou célula de tipo específico, como foi também evidente em células U2OS tratados com paclitaxel ou doxorrubicina (Fig. S2A) e na linha celular de cancro da mama MDA-MB 231 tratados com etoposido (Fig. S2B).
(a) Análise por imunotransferência da eficácia de Praf2 derrubar a seguir à transfecção de células U2OS com dois diferentes ARNsi direccionamento do mRNA Praf2. células (B) U2OS transfectadas com controlo (Ctrl) ou Praf2 segmentação siRNAs (siRNA5 e siRNA6) após 48 horas foram tratados com 50? M de etoposido durante 24 horas. caspase celular 3 e 7 atividades foram medidos utilizando o ensaio luminométrico Caspase-Glo 3/7. O gráfico mostra a percentagem de caspase 3 e 7 de activação em amostras tratadas com o Praf2 segmentação ARNic em comparação com a actividade presente nas células transfectadas com o ARNsi de controlo em 3 experiências independentes. (C) clonogenicidade de células U2OS transfectadas com controlo ou Praf2 segmentação siRNAs e tratadas ou não com etoposídeo. 48 horas após a transfecção de células U2OS com ARNsi de controlo ou Praf2 siRNA6, as células foram tratadas com 50? M de etoposido durante 3 horas e que deslocado novamente para meio normal durante 2 semanas. Colónias eram de cor de violeta cristal. O gráfico representa a porcentagem de colónias cresceram após o respeito tratamento etoposídeo com a testemunha.
Discussão
Bcl-XL é um ancorada proteína C-cauda com a capacidade de localizar em várias membranas intracelulares. A fim de ter uma grande imagem do conjunto de proteínas de membrana que interagem com Bcl-xL, foi realizada purificação de afinidade em tandem a partir de membranas celulares totais de células HeLa que expressam de forma estável com a etiqueta TAP-Bcl-xL. Dado que os detergentes não iónicos tais como Triton-100 ou NP-40 são conhecidos para alterar a conformação das proteínas da família Bcl-2 [23], todas as experiências foram realizadas na presença de CHAPS, um detergente que sai da conformação de Bcl-xL inalterada. Como listado na Tabela 1, encontramos muitas proteínas co-purificar com a TAP-Bcl-xL. No entanto, aqueles que são susceptíveis de reflectir verdadeiros interacções proteína-proteína durante pelo menos duas razões. Em primeiro lugar, como se mostra na pista 1 da Fig. 2C, purificações da mesma linha de células transportando um TAP-tag somente construir recuperar proteínas quase indetectáveis, sugerindo que todas as proteínas recuperadas são de facto associada a Bcl-xL. Em segundo lugar, como discutido a seguir, utilizando este procedimento, encontramos co-eluindo com Bcl-xL muitas proteínas que se sabe serem capazes de interagir especificamente com Bcl-xL. Temos sub-dividido da lista de proteínas encontradas para interagir com Bcl-xL nas categorias funcionais discutidos abaixo. Vale a pena notar que todas as proteínas encontradas são ou proteínas trans-membrana ou proteínas solúveis localizadas em organelas intracelulares. A maioria deles localizam os compartimentos sub-celulares conhecidas por ser alvo de Bcl-xL. Muitos deles são múltiplos componentes de complexos de proteínas. Estas observações constituem uma boa indicação da validade da abordagem utilizada e da especificidade e sensibilidade da técnica utilizada. Podemos, portanto, concluir que Bcl-XL pode ser envolvido em vários complexos de proteínas diferentes em vários locais sub-celulares. Esta conclusão é reforçada pelos dados gradiente de fracionamento de sacarose apresentados na Fig.