Abstract

Fundo

Porque vias de sinalização celular e metabolismo celular são executados através de proteínas, as assinaturas de proteínas em tumores primários são úteis para identificar os nós-chave na sinalização redes cuja alteração está associada à malignidade e /ou resultados clínicos. Este estudo teve como objetivo determinar as assinaturas de proteína em tecidos de câncer de pulmão primários.

Metodologia /Principais Achados

Foram analisados ​​126 proteínas e /ou sítios de fosforilação de proteínas em amostras normais e tumorais de casos combinado de 101 pulmão pacientes com câncer e array de proteínas de fase reversa ensaio (RPPA). Os resultados mostraram que 18 moléculas foram significativamente diferentes (

P

0,05) por, pelo menos, 30% entre tecidos normais e tumorais. A maior parte dessas moléculas desempenham um papel na proliferação celular, a reparação do ADN, a transdução de sinal e do metabolismo de lípidos, ou como função de proteínas de superfície celular /matriz. Nós também validados resultados RPPA por blot e /ou imuno-histoquímica Ocidental análises para algumas dessas moléculas. As análises estatísticas mostraram que os níveis Ku80 foram significativamente mais elevados em tumores de não-fumantes do que naqueles de fumantes. níveis de ciclina B1 foram significativamente sobre-expressos em tumores pouco diferenciados enquanto os níveis de Cox2 foram significativamente sobre-expressos em tumores neuroendócrinas. Um alto nível de Stat5 está associado com desfecho favorável de sobrevivência para os pacientes tratados com cirurgia.

Conclusões /Significado

Os nossos resultados revelaram que algumas moléculas envolvidas no dano ao DNA /reparação, transduções sinal, metabolismo lipídico e proliferação celular foram drasticamente aberrante em tecidos de câncer de pulmão, e Stat5 pode servir um marcador molecular para o prognóstico dos cancros do pulmão

Citation:. Ele Y, Zhou Z, Hofstetter WL, Zhou Y, Hu W, Guo C , et ai. (2012) expressão aberrante de proteínas envolvidas na transdução do sinal e Vias DNA Repair no câncer de pulmão e sua associação com parâmetros clínicos. PLoS ONE 7 (2): e31087. doi: 10.1371 /journal.pone.0031087

editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 21 de julho de 2011; Aceito: 02 de janeiro de 2012; Publicação: 10 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 He et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é apoiada por doações do Instituto Nacional do Câncer: R01CA-092487 (atribuído a BF), RO1CA-124951 (atribuído a BF), Institutos Nacionais de Saúde Núcleo Grant 3P30CA-016672-32S3, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center suporte Grant CA- 016.672 – Programa de pulmão e Proteomics funcionais de fase inversa instalação de Núcleo de matriz de proteínas, o Fundo de Homer flor Gene Therapy Research, o Rogers Fundo Gene Therapy Charles, o Flora e Stuart Mason Cancer Research Fund Lung, o Fundo Memorial Charles B. Swank para o cancro esofágico Investigação, o Fundo George O. Sweeney para Pesquisa do Câncer de esôfago, o Thoracic Fundo Gene Therapy Phalan, eo Fundo Endowed MW Elkins para Thoracic Oncologia cirúrgica, Chapman Foundation, a National Science Foundation Natural da China (81172113, 81071912) e “projeto 1510 “da Third Military Medical University of China (atribuído a YH). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

perfil molecular do cancro do pulmão através de ensaios conjunto de genes para ARNm e microARN levou à identificação de assinaturas moleculares que são potencialmente úteis para predizer paciente sobrevivência e de recidiva da doença e /ou resposta a fármacos quimioterapêuticos individuais e com base na hierarquia agrupamento probabilística de níveis de microRNA mRNA [1] e [2]. Além disso, estudos de polimorfismos de nucleótidos simples de DNA genómico levaram à identificação de potenciais loci de genes na região do cromossoma 15q25 [3], que codificam os genes de subunidades de receptores de acetilcolina nicotínicos que estão altamente associados com susceptibilidade ao cancro do pulmão. No entanto, para a maioria dos genes, não existe uma correlação significativa entre os níveis de proteína e ARNm [4]. Assim, as principais vias de sinalização que reflectem os processos de transformação da doença continuam a ser identificado. Porque transdução mais sinal e regulação da via são conduzidas por proteínas submetidas à modificação pós-transcricional, tais como fosforilação, que não podem ser detectados por ADN, ARNm, ou miARN análises, é necessária caracterização dos níveis de proteína e estado de fosforilação de proteínas para obter assinaturas de proteínas que reflectem funcional e /ou alterações metabólicas no cancro do pulmão e /ou resposta a agentes terapêuticos, tais como inibidores da quinase.

esforços têm sido feitos para determinar assinaturas de proteínas no câncer de pulmão usando eletroforese bidimensional e identificação de proteínas subsequente em massa ensaio de espectrometria ou usando espectrometria de massa direta analisa [5]. Embora esta tecnologia é útil para a identificação de proteínas diferencialmente expressos em tecidos tumorais, é provável que não se adapta ao rápido throughput ensaios necessários para a aplicação clínica por causa dos processos demoradas envolvidos, a possibilidade de contaminação do sinal devidas a milhares de pontos de dados envolvidos na análise, e a possível corrupção de conjuntos de dados devido a problemas experimentais de design [6].

a recente advento da tecnologia de microarrays de proteína pode permitir-nos identificar pontos críticos ou interações na rede de vias de sinalização celular . A vantagem do método é que RPPA uma única sonda de teste (anticorpos) é utilizado para cada matriz, de modo que a condição de teste é consistente para cada anticorpo, proporcionando desse modo uma melhor reprodutibilidade e sensibilidade do que outras técnicas de array de proteínas. Com anticorpos completamente avaliados e validados, um RPPA pode ser usada para detectar diferenças de sinal em alguns milhares de moléculas em amostras de teste [7]. Por isso, esta tecnologia é útil para a monitorização de alterações nos níveis de proteínas e a fosforilação da proteína ao longo do tempo, antes e após o tratamento, entre os tecidos tumorais e normais, e entre respondedores e não-respondedores. Uma vez alvos diferenciais são identificados, é possível utilizar métodos convencionais para testar um pequeno subconjunto dos biomarcadores de prognóstico ou previsão da resposta ao tratamento. Para este fim, foram coletadas amostras de tecido pulmonar normais e malignas de casos combinado de 101 pacientes e determinaram seus níveis de proteínas e status de fosforilação de proteínas utilizando o método RPPA e 126 anticorpos. Aqui, nós relatam que vários nós moleculares que são críticos na fixação das células, o reparo do DNA, a proliferação celular e transdução de sinal foram diferencialmente expressos entre os tecidos normais e cancerosos, alguns deles foram associados com parâmetros clínicos, incluindo os resultados de sobrevivência.

Resultados

paciente e tumor Características

Foram coletadas amostras de tecido pulmonar normais e malignas de casos combinado de 101 pacientes. Características dos doentes e os tumores são resumidos na Tabela 1. Os pacientes tinham idades entre 42-86 y, com uma idade média de 65 y, e 55% eram do sexo feminino. A maioria dos pacientes (93%) eram caucasianos. Adenocarcinoma eo carcinoma espinocelular representaram 56% e 31% dos tipos histológicos, respectivamente. A maioria dos pacientes (66%) tinham doença fase I. Cerca de 50% dos tumores foram pouco diferenciado, e 40% foram moderadamente diferenciado. Noventa pacientes (89%) tinham um histórico de uso de tabaco /fumo. Vinte e quatro pacientes tiveram quimioterapia neoadjuvante, e um teve a radioterapia neoadjuvante.

expressão diferencial entre o tumor e tecidos normais Revelado pelo RPPA

Para cada amostra e cada anticorpo, o sinal na RPPA ensaios foi comparado entre tecidos normais e tumorais. A diferença de sinal entre tecidos normais e de tumor foi calculada como se segue: [(média do tumor tecidos-significativo dos tecidos normais) /(média de tecidos normais × 100%)]. De 126 proteínas ou locais de fosforilação analisados, 18 apresentaram diferenças de sinal que eram maiores do que 30% e foram estatisticamente significativas (

P

0,05) em todas as amostras normais e de tumor analisadas (Tabela 2). Essas 18 moléculas podem ser categorizados como moléculas associadas com a proliferação celular (ciclina B1), moléculas adaptadoras na transdução de sinal (14-3-3zeta, IRS1-pS307, e IGFBP2), as moléculas do metabolismo lipídico (COX2 e ACC-pS79), moléculas envolvidos em respostas de danos no DNA (Ku80, CHK2 e ATM), da superfície celular ou moléculas de matriz (caveolina 1, CD31, e colágeno tipo VI), e moléculas nas vias de sinalização (PI3K /Akt: PI3K-p85, mTOR, e S6K ; Src /Stat pathway: Stat5 e Src; e via da MAP-cinase: p38-pT180). As intensidades de sinal para a ciclina B1, IGFBP2, e caveolin 1 em amostras de tecido de cada um dos casos são mostrados como exemplos na Fig. 1. A maior parte destas moléculas foram relatados para desempenhar papéis críticos em vários cancros ou ter expressão alterada em vários cancros. Por exemplo, a perda de caveolin 1 expressão [8], [9] e superexpressão de ciclina B1 [10], [11] no pulmão tecido canceroso já foram relatados em estudos com arranjos de cDNA e imuno-histoquímica.

a) a intensidade de sinal (eixo Y) para cada caso (eixo X) para moléculas de ciclina B1, IGFBP2 e caveolin 1. B) distribuição desceu de sinais em tecidos normais e tumorais.

Porque 88 dos 101 casos analisados ​​no estudo eram ou adenocarcinoma ou carcinoma de células escamosas, analisamos se estas 18 moléculas foram significativamente diferentes entre amostras de tecidos normais e tumorais para os dois principais subtipos de cânceres de pulmão de células não-pequenas. Os resultados mostraram que 13 das 18 moléculas foram significativamente diferentes entre o tecido normal e de tumor, tanto para adenocarcinoma e carcinoma de células escamosas (p £ 0,05, Tabela S2), um achado semelhante ao observado quando todas as amostras foram analisadas em conjunto. Duas moléculas (COX2 e S6) não foram significativamente diferentes quando adenocarcinoma eo carcinoma espinocelular foram analisados ​​separadamente, enquanto PI3K-p85, Src, e mTOR permaneceu significativamente diferente entre os tecidos normais e tumorais em adenocarcinoma, mas não em carcinoma de células escamosas. Se as vias de PI3K /mTOR /S6 e Src são mais críticos em adenocarcinoma do que em carcinoma de células escamosas ou se este achado foi devido ao menor número de amostras de carcinoma de células escamosas no estudo não é clara.

Validação de RPPA dados

foram realizadas análises de transferência de Western em moléculas cujas expressões foram alteradas relativamente em um grande número de tecidos tumorais, incluindo ciclina B1, caveolin 1, colagénio VI, ACC1 /pS79, CHK2, e IGFBP2. Os resultados mostraram que os dados obtidos a partir da análise de Western blot correspondente ao de ensaio RPPA (Fig. 2, Fig. S1), demonstrando que os dados obtidos a partir do ensaio RPPA são fiáveis ​​e podem ser validadas por análise de Western blot.

Ciclina B1, caveolin 1, colagénio de tipo VI, ACC-pS79, CHK2, IGFBP2 e em tecidos de tumor de pulmão normal e primários foram analisadas por Western blot, em pelo menos quatro casos em que RPPA mostraram diferença de sinal em tecidos normais e tumorais. Os resultados de Western blot foram consistentes com aqueles gerados pelo RPPA.

Nem ensaio RPPA nem análise de Western blot forneceu informações sobre os tipos de células, tumor ou estromal, contribuíram para as diferenças observadas. Para determinar os tipos de células nas quais as proteínas foram expressas diferencialmente, foi realizada análise de imuno-histoquímica para cinco moléculas (ACC-pS79, CHK2, IGFBP2, ciclina B1, e caveolina 1), em amostras que apresentaram diferença entre tecidos normais e tumorais. Os resultados mostraram que as diferenças na expressão de todos os cinco moléculas foram derivados a partir da expressão alterada em células cancerosas mas não em células do estroma (Fig. 3). marcante heterogeneidade na expressão da proteína em células tumorais foi observado para a ciclina B1. Apenas uma porção de células tumorais foram coradas com anticorpo fortemente ciclina B1 enquanto que outras células tumorais no mesmo tumor mostraram coloração muito baixo ou negativo para a ciclina B1, possivelmente por causa de diferentes graus de ciclos celulares. A expressão da ciclina B1 é conhecido por ser dependente do ciclo celular e atingiu um máximo de G2 /M [12]. A sobre-expressão ou perda de expressão de outras moléculas foi muito menos heterogeneidade.

A expressão aumentada da ACC-pS79, CHK2, IGFBP2, ciclina B1, STAT5, ATM, e Ku80, e a diminuição da expressão de caveolin 1 em tecidos tumorais foram comparados com os tecidos normais dos mesmos casos mostrados withconsistent com os resultados gerados por RPPA e análises de Western blot. Ampliação de 40 ×.

Nanjundan

et al.

Informou recentemente um RPPA profiling análise sobre os casos de câncer de pulmão 46 com 63 proteínas ou sítios de fosforilação de proteínas e identificadas várias proteínas foram diferencialmente expressos em primária tecidos de câncer de pulmão [13]. Nós, portanto, comparados os resultados do estudo atual com a do estudo de Nanjundan. Os dois estudos usaram conjuntos de amostras completamente distintas. Todas as amostras utilizadas no estudo da Nanjundan foram recolhidos antes de 2000, enquanto que as amostras utilizadas neste estudo foram recolhidas após sítios phosphoryaltaion 2006. Quarenta e oito proteínas /proteínas foram testadas em estudos de ambos. Oito dos onze (72,7%) marcadores que foram significativamente diferentes entre tecidos normais e cancerosas no estudo de Nanjundan têm diferenças significativas semelhantes nos estudos atuais. Três moléculas (27,3%) (FAK, β-catenina e AKT) que foram significativamente diferentes (p = 0,002-0,003) no estudo de Nanjundan não foram significativas neste estudo. Este resultado indica que a validação dos resultados obtidos em estudos separados RPPA será importante, ainda que a maioria das moléculas expressas de forma diferente são consistentes nos dois estudos.

Três (caveolin-1, ciclina B1 e de Src-pY527) de quatro assinatura marcador que diferencia NSCLC de pulmão normal no estudo de Nanjundan também foram significativamente diferentes entre os tecidos normais e tumorais dos estudos atuais. Por isso, utilizadas conjunto de treino de Nanjundan (25 casos) para testar se estes três assinatura marcador pode ser utilizado para diferenciar o conjunto de dados (101 casos) do estudo actual. O resultado mostrou que estes três marcadores, quer isoladamente ou em combinação, podiam distinguir tumor do normal do estudo corrente com várias precisões, sensibilidades e especificidades (Tabela 3). Em geral, uma combinação de dois ou três marcadores melhorou tanto a precisão, sensibilidade ou especificidade.

associado aos dados clínicos

Foram analisados ​​se a expressão das 18 moléculas listadas na Tabela 2 em tecidos tumorais foi associado com os parâmetros clínicos. A análise estatística revelou que os níveis destas moléculas em tecidos tumorais não foram significativamente associados com o estágio clínico ou sexo. No entanto, a expressão de Ku80 foi significativamente superior nas amostras de doentes sem história de fumar do que aqueles com história de fumar (

P

= 0,004). A expressão de ciclina B1 foi significativamente mais elevada em tecidos tumorais pouco diferenciadas do que em tecidos de tumor moderadamente ou bem diferenciados (

P

0,025). Por outro lado, a expressão de ATM, Ku80, e S6 foi significativamente mais elevada nos tecidos de tumor bem diferenciado do que em tecidos tumorais fracamente ou moderadamente diferenciados (Fig. 4). Quando a expressão em diferentes tipos histológicos foi comparado, as expressões de ATM, Ku80, IGFBP2, IRS1-pS307, e S6 foram significativamente mais elevados no carcinoma neuroendócrino do que no adenocarcinoma ou carcinoma de células escamosas (

P

0,05). Este resultado sugere que a expressão de determinadas moléculas eram dramaticamente diferentes nos tumores neuroendócrinas quando comparados com os de adenocarcinoma ou cancro das células escamosas, enquanto que os níveis das proteínas expressas diferencialmente listados na Tabela 1 foram mais ou menos semelhante entre adenocarcinoma e carcinoma de células escamosas. No entanto, por causa de um número relativamente baixo de tumores neuroendócrinas utilizados neste estudo, não é claro se existe uma assinatura molecular específico para este tipo de cancro.

Os níveis de proteína em tecidos de tumor detectado no ensaio foram analisados ​​para RPPA associações com parâmetros clínicos dos pacientes. A molécula que foi significativamente diferente em tumores com base em parâmetros clínicos analisados ​​é mostrado no topo de cada gráfico. Os parâmetros clínicos são apresentados na parte inferior de cada gráfico. Os diagnósticos histológicos e diferenciação foram baseadas em relatórios patológicos no banco de dados clínicos. * Indica que a diferença foi significativa quando comparada com outros grupos no mesmo gráfico (

p Art 0,05).

associação com a sobrevivência Outcomes

Para determinar se os níveis de proteínas são aqueles associados com os resultados clínicos, foi realizada a análise de sobrevivência sobre os marcadores de proteínas diferencialmente expressas mostrados na Tabela 1, utilizando o método de Kaplan-Meier. Resumidamente, separamos os doentes em dois grupos com base na expressão do valor médio de cada um dos marcadores individuais, grupos de expressão como de alta e baixa designadas, e, em seguida, utilizando o algoritmo de Kaplan-Meier para calcular curvas de sobrevivência para os dois grupos definidos de cada marcador. O resultado mostrou que os níveis de Stat5 foram significativamente associados com a sobrevivência resultados quando analisados ​​tanto com estágio pacientes I-III (p = 0,032) e com i pacientes em estágio somente (p = 0,014) (fig. 5). Os pacientes com um alto nível de Stat5 em seus tecidos tumorais apresentaram sobrevida favorável resultados quando comparados com aqueles com um nível mais baixo de Stat5, sugerindo que Stat5 poderia ser um marcador útil para o prognóstico dos cancros do pulmão.

Análise

Kaplan-Meier na associação dos níveis STAT5 e os resultados de sobrevivência para o estágio I-III (a) (n = 50 para cada grupo), e Estágio I somente (B) pacientes (n = 33 por grupo de alto STAT5, 34 para STAT5 grupo de baixo).

Discussão

Foram analisadas diferenças moleculares nos níveis de proteína ou de fosforilação de proteínas entre os tecidos de câncer de pulmão normal e em 101 amostras por ensaio RPPA. De 126 moléculas analisadas, 18 foram identificadas moléculas que foram dramaticamente ( 30%) e estatisticamente significativo (

P

0,05) entre as amostras normais e tumorais. A análise de transferência de Western e /ou ensaios de immunohistopathologic de várias moléculas validado os resultados obtidos a partir de matrizes RPPA, demonstrando que os resultados da análise RPPA são fiáveis. Além disso, uma comparação com um estudo realizado em outro RPPA de amostras de doentes mostrou que os resultados da caracterização RPPA eram altamente reproduzível e consistente em estudos separados com conjunto separado de amostras de doentes. Os nossos resultados também indicam que a expressão de várias moléculas em tecidos de tumor foi associada com a história de fumar, diferenciação, e histopatológicas tipos de cancros do pulmão.

Um número de biomarcadores identificados aqui são consistentes com os relatados na literatura em termos de suas expressões de genes alterados em tecidos tumorais, incluindo caveolin 1 [8], [9], a ciclina B1 [10], [11], 14-3-3zeta [14], Stat5 [15], p38 activado [16], IGFBP2 e [17]. No entanto, para algumas moléculas, alguns resultados contraditórios foram relatados por outros anteriormente. Por exemplo, a expressão CHK2 ou a sua activação foi encontrado para ser diminuída em tecidos tumorais de cancro do pulmão de células não pequenas, de uma matriz de tecido disponível comercialmente [18], ou aumentada em 50% das amostras de pulmão e tumor da mama cirurgicamente ressecados a partir de pacientes não tratados [ ,,,0],19]. Descobrimos que a expressão CHK2 foi aumentada em ambos os adenocarcima e tecidos pulmonares de carcinoma espinocelular, constituído com o relatado por Ditullio et al [19]. Aumento da expressão COX2 foi encontrado em nosso estudo, mas foi menos frequente do que relatado por Hida et. ai em pacientes japoneses, em que um aumento significativo na expressão de COX2 foi observada em 70% dos casos de adenocarcinoma invasivo [20]. Nosso resultado foi consistente com o relatado por Khuri et al, que observou que apenas alguns casos tiveram expressão COX2 forte em tecidos tumorais [21].

Curiosamente, nossos resultados mostraram que várias moléculas envolvidas no DNA danos /reparação (ATM, CHK2 e Ku80) foram aumentadas em tecidos tumorais. Um aumento dos níveis de ARNm de ATM e ADN-PKcs, mas não de Ku80, foram detectados nos tecidos de tumor quando comparada com os tecidos normais adjacentes [22]. No entanto, pouco se sabe sobre a expressão da proteína ATM em tecidos de câncer de pulmão primário. ATM, CHK2, e /ou Ku80 são considerados como genes supressores de tumores que estão envolvidos na resposta a danos no ADN [23], [24]. Curiosamente, a activação constitutiva de ATM via /CHK2 foi encontrado em células cancerígenas de p53 mutantes [19]. O aumento da resposta os danos no DNA /reparação de moléculas em tecidos tumorais podem reflectir a presença de instabilidade do genoma em células cancerosas, uma característica comum que distingue os cancros de tecidos normais [25]. É digno de nota que a sobre-expressão de Ku80 foi encontrada no cancro da cabeça e do pescoço e no cancro da pele [26], [27], e pode ser causada por activação de NFkB e COX2 [28]. Alternativamente, a expressão aumentada de Ku80 em pacientes não-fumante ou tumores neuroendócrinos pode refletir uma grande demanda por reparação de rupturas de filamentos duplos até o final de adesão não homóloga nos tecidos cancerosas, porque Ku80 é fundamental nesta via de reparação do ADN. Essas moléculas podem servir como um marcador para a terapia do cancro alvejando a via de reparação do ADN [29]. Porque vinte e cinco pacientes incluídos neste estudo tinha várias quimioterapias neoadjuvante ou radioterapia, analisamos se o aumento da expressão dessas moléculas foi associada com quimioterapia e radioterapia. A análise estatística mostrou que a expressão aumentada de ATM, CHK2, e Ku80 não foi associada com a quimioterapia ou radioterapia neoadjuvent. Assim, o aumento da expressão destas moléculas danos /reparação do ADN foi induzida por tratamento improvável, mas sim uma característica intrínseca de tumores primários.

várias proteínas aqui identificadas desregulados têm sido investigados como alvos terapêuticos para a terapia do cancro. pequenas moléculas ou inibidores da quinase como alvo os receptores e fator de crescimento da PI3K /AKT /mTOR, Src /Stat, p38 e caminhos /Chk2 ATM foram amplamente investigadas para tratamento de câncer, tanto pré-clinicamente e clinicamente, incluindo o tratamento de cancros do pulmão [29] – [ ,,,0],31]. Um estudo recente mostrou que a inibição de ATM ou CHK2 é suficiente para sensibilizar células tumorais deficientes em p53, mas não p53 células do tipo selvagem, para genotóxico cisplatina agente quimioterapêutico ou doxorrubicina [32], sugerindo que a combinação de cisplatina ou doxorrubicina com ATM ou CHK2 inibidores poderia beneficiar pacientes portadores de tumores p53 mutantes. Nossos resultados também mostraram que o aumento da expressão de STAT5 pode servir biomarcador de prognóstico tão favorável para pacientes com câncer de pulmão tratados com cirurgia. Embora os mecanismos subjacentes continuam a ser investigado, STAT5 como um marcador de tumor de prognóstico favorável tem sido relatada para câncer de mama [33] – [35] e câncer de nasofaringe [36]. Evidências mostraram que STAT5 promove homot�ica adesão e inibe características invasivas de células cancerosas da mama humanos [34]. Se o mesmo ocorre com as células cancerosas do pulmão continuam a ser investigado. No entanto, a associação significativa de STAT5 com os resultados clínicos, em especial no câncer de pulmão em estágio I, sugeriu que STAT5 pode ser um biomarcador de prognóstico útil para o cancro do pulmão.

Materiais e Métodos

tecido pulmonar humano espécimes

normal e amostras de tecidos pulmonares malignos foram coletados entre 2006 e 2009 a partir de espécimes retirados cirurgicamente sob um protocolo de pesquisa Lab-90-020 com o consentimento informado dos pacientes. O estudo foi aprovado pelo comitê de ética local (Institutional Review Board da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center). Os tecidos normais foram, pelo menos, 5 cm de distância da borda de tumores correspondente nas mesmas amostras. Ambos os tecidos normais e tumorais foram recolhidas da sala de operações imediatamente após os espécimes foram removidos a partir de pacientes. Em todos os casos, o controlo de qualidade histologia foi realizada por um patologista torácica em secções de tecido. As amostras de tumor foram incluídos na análise, se a percentagem de células malignas presentes na amostra foram ≥70%. amostras de pulmão normal dos mesmos pacientes foram revisados ​​para confirmar que eles não continham células malignas. Todas as amostras foram divididas em duas partes: uma parte foi imediatamente congelado e armazenado em azoto líquido para a extracção de proteínas; a outra parte foi fixada em formalina e embebidos em parafina para exame histológico de rotina ou de imuno-histoquímica. Os pares de amostras emparelhadas foram colhidas, processadas e analisadas ao mesmo tempo, de acordo com os mesmos protocolos.

RPPA Ensaio

RPPA ensaio foi realizado na instalação Núcleo array funcional de proteínas Proteomics Fase Reversa em nossa instituição como descrito anteriormente [37]. Resumidamente, as amostras de tecido foram lavadas duas vezes em PBS arrefecido em gelo e em seguida homogeneizados em tampão RPPA lise [1% de Triton X-100, 50 mmol /L de HEPES (pH 7,4), 150 mmol /L de NaCl, 1,5 mmol /L de MgCl

2, 1 mmol /L EGTA, 100 mmol /L de NaF, 10 mmol /L Nappi, 10% de glicerol, 1 mmol /L Na

3VO

4, 1 mmol /L de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, e 10 ug /ml de aprotinina]. Após centrifugação, o sobrenadante foi recolhido e a concentração de proteína foi determinada por rotina (

,

por exemplo. Bradford) ensaios e, em seguida, ajustado a 1-1,5 mg /ml por adição de tampão de lise. Os lisados ​​dos tecidos foram misturados com 1/4 de volume de 4 × tampão de amostra de SDS contendo 40% de glicerol, 8% SDS, Tris-HCl a 0,25 (pH 6,8), e 10% (v /v) de 2-mercaptoetanol (adicionado de fresco) . Duas vezes lisados ​​de tecidos diluídas em série (a partir de não diluído diluição a 1:16) foram impressas em lâminas revestidas de nitrocelulose (Whatman, Inc.) usando uma arrayer GeneTAC G3 (Genomic Solutions), juntamente com os correspondentes controlos positivos e negativos preparados a partir da tampão de diluição. Um total de 126 anticorpos específicos validados para proteínas ou seus locais fosforilados que estão envolvidos em várias vias de sinalização estavam disponíveis e utilizados na RPPA (ver Tabela S1 para os anticorpos utilizados neste estudo). Cada lâmina foi sondada com um anticorpo primário validada mais um anticorpo secundário conjugado com biotina. O sinal foi amplificado usando um sistema DakoCytomation (Dako) catalisada e visualizados por 3,3′-diaminobenzidina reacção colorimétrica tetracloridrato. As lâminas foram digitalizadas, analisados ​​e quantificados utilizando software personalizado, Microvigene (VigeneTech, Inc.), para gerar intensidade local. Sinais de cada diluição foram equipados com o modelo não-paramétrico desenvolvido pelo Departamento de Bioinformática e Biologia Computacional no MD Anderson [38]. As concentrações de proteínas de cada conjunto de lâminas foram então normalizados e corrigido através amostras pelos valores de expressão lineares, utilizando os níveis de expressão da mediana de todas as experiências anticorpos para calcular um factor de correcção de carregamento de cada amostra, como descrito anteriormente [13], [37] .

análise Western blot

para validar os resultados de ensaios RPPA, foi realizada análise de Western blot para um subconjunto de moléculas que apresentaram diferença significativa entre tecidos normais e cancerosas. Cerca de 40 mg de cada amostra de tecido congelado foi lavada duas vezes em PBS frio e homogeneizados em 0,5 ml de tampão de lise arrefecido com gelo. Os extractos de cerca de 50-60 ug da proteína total foram separados por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida a 10%, em seguida, transferidos para membranas de nitrocelulose. A análise por Western blot foi realizada tal como anteriormente descrito [37]. Anticorpos para IGFBP2, caveolin-1, CHK2 (1C12) e fosfo-acetil-CoA carboxilase (ACC-pS79) foram adquiridos a partir de Cell Signaling, anticorpo de ciclina B1 foi de Epitomics, e colagénio de tipo VI a partir de Santa Cruz Biotechnology.

imuno-histoquímica coloração e Avaliação

Os mesmos anticorpos utilizados para a análise de Western blot foram utilizados para coloração imuno-histoquímica. secções fixadas com formalina e embebidas em parafina de tecido (5-m de espessura) foram desparafinadas, hidratadas, e aqueceu-se num vapor para recuperação de antigénios. As lâminas foram então coradas com vários anticorpos, tal como descrito acima. Os tecidos não incubadas com um anticorpo de controlo IgG de ratinhos em vez de um anticorpo primário foram usadas como um controlo negativo.

Análise estatística

A análise da variância foi realizada usando o software Statistica (StatSoft, Inc. ) para comparações entre grupos.

t

teste de Student foi utilizado para comparação entre os dois grupos. A análise discriminante linear diagonal (DLDA) foi usado para a classificação e predição de tecidos normais e tumorais. Os dados de sobrevivência serão analisados ​​pelo método de Kaplan-Meier e modelo proporcional de Cox. A

valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Informações de Apoio

Figura S1.. Os níveis de proteína

detectados por análise de Western blot em 6 casos adicionais para IGFBP2 e CHK2. tecidos de tumor de pulmão primário (T) IGFBP2 e CHK2 no normal (N) e foram analisados ​​por Western blot em 6 casos adicionais em que RPPA mostraram diferença do sinal em tecidos normais e tumorais. β-actina foi utilizada como controle de carga

doi:. 10.1371 /journal.pone.0031087.s001

(TIF)

Tabela S1.

diferença Expressão em adenocarcinoma e cancro epidermóide *

doi:. 10.1371 /journal.pone.0031087.s002

(DOC)

Tabela S2.

Proteínas e locais de fosforilação utilizados em estudos RPPA.

doi:. 10.1371 /journal.pone.0031087.s003

(DOC)

Reconhecimentos

Agradecemos Markeda Wade para revisão editorial