Abstract
Temos relatado anteriormente que excitabilidade dos gânglios da raiz dorsal reforçada (DRG) neurónios contribui para o desenvolvimento da dor associada ao cancro do osso, a qual diminui severamente a qualidade de vida de doentes com cancro. Nav1.8, um canal de sódio resistente à tetrodotoxina (TTX-R), contribui a maior parte da corrente de sódio subjacente à acção potencial movimento ascendente e é responsável por maior parte da corrente de picos posteriores num comboio. Especula-se que o canal de sódio Nav1.8 é um potencial candidato responsável pela excitabilidade aumentada de neurónios DRG em ratos com dor de câncer ósseo. Aqui, utilizando electrofisiologia, Western blot e ensaios de comportamento, que documentou que a densidade de corrente dos canais de sódio TTX-R, especialmente do canal de Nav1.8, aumentou significativamente nos neurónios DRG de ratos com dor óssea induzida pelo cancro. Este aumento pode ser devido a um aumento da expressão de Nav1.8 na membrana dos neurónios DRG. Accordantly, o bloqueio dos canais de sódio Nav1.8 pelo seu bloqueador selectivo A-803467 aliviada significativamente a alodinia mecânica induzida por cancro e hiperalgesia térmica em ratos. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a supra-regulação de canais funcionais na membrana Nav1.8 de neurónios DRG contribui para o desenvolvimento da dor óssea induzida pelo cancro
citação:. Liu XD, Yang JJ, Fang D, J Cai , Wan Y, Xing GG (2014) Upregulation funcional de canais Nav1.8 de sódio na membrana dos gânglios das raízes dorsais neurônios contribui para o desenvolvimento de câncer induzida por dor óssea. PLoS ONE 9 (12): e114623. doi: 10.1371 /journal.pone.0114623
editor: Joseph Charles Glorioso, da Universidade de Pittsburgh School of Medicine, Estados Unidos da América
Recebido: 07 de agosto de 2014; Aceito: 11 de novembro de 2014; Publicação: 11 de dezembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. O presente trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (81371237, 31171063,81072951), o Beijing Natural Science Foundation (7112079), o especial Fundação para a profissão bem-estar público programa de pesquisa científica do Ministério da Saúde da República Popular da China (201.302.013-01) e “973” programa do Ministério da Ciência e Tecnologia da China (2013CB531905). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
dor do câncer de osso resultante de tumores primários ou tumores que metástase para os ossos é um dos tipos mais graves e difíceis de dor do câncer, o que diminui a qualidade de vida dos pacientes [1]. Os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento da dor do câncer ósseo permanecem largamente desconhecidos.
Recentemente, nós e os outros descobriram que a hiperalgesia térmica e hipersensibilidade mecânica em modelos murinos de dor do câncer ósseo estão associados com a excitabilidade aumentada de neurônios DRG nociceptivos primários [ ,,,0],2], [3]. As respostas dos nociceptores aos estímulos nocivos são codificados por potenciais de ação cuja gênese e propagação são dependentes de canais de sódio dependentes da voltagem. Assim, os padrões de expressão aberrante destes canais e canalopatias sódio hereditárias têm sido associadas a dor neuropática e inflamatória [4]. neurónios DRG adulto pode expressar ambos os canais de sódio sensíveis à tetrodotoxina (TTX-S) e tetrodotoxina-resistente (TTX-R). Entre estes últimos, o canal de sódio TTX-R Nav1.8 é expresso especificamente em neurónios sensoriais [5], [6]. Assim, Nav1.8 é um dos alvos mais atraentes para o desenvolvimento de novos agentes farmacêuticos para tratar a dor.
Nav1.8 produz um slow-inactivação, a corrente rápida reiniciação de sódio TTX-R com a ativação despolarizada e inactivação tensão-dependência [6], [7]. Nav1.8 contribui a maior parte da corrente de sódio subjacente ao movimento ascendente potencial de acção nos neurónios que expressa o canal de [8], [9]. As propriedades biofísicas de Nav1.8, seu papel crítico na disparo repetitivo, e sua presença nas terminações nervosas livres, onde a sinalização da dor é iniciada, sugerem que Nav1.8 pode influenciar significativamente nociceptors excitabilidade, contribuindo assim para a dor. O papel da Nav1.8 na dor neuropática e inflamatória é bem revisto por Dib-Hajj et al. [4]. No entanto, se Nav1.8 contribui para o desenvolvimento da dor óssea induzida pelo cancro é em grande parte desconhecida. Recentemente, Qiu e colegas [10] observaram uma expressão aumentada de Nav1.8 dentro DRG em um modelo de rato de dor associada ao cancro Walker óssea induzida por células de tumor de 256, o que sugere o envolvimento potencial de Nav1.8 no desenvolvimento de ossos induzida por cancro dor. Neste estudo, utilizando electrofisiologia, Western blot e métodos comportamento farmacológico, forneceu a evidência que mostra que a regulação positiva funcional dos canais de Nav1.8 na membrana dos neurónios DRG contribui para o desenvolvimento da dor óssea induzida pelo cancro.
Materiais e Métodos
Animais
Adulto ratas Sprague-Dawley pesando 180-220 g no início dos experimentos foram fornecidos pelo Departamento de Ciências Animais experimentais, Universidade de Pequim Saúde Science Center. Os ratos foram alojados em gaiolas separadas com livre acesso a comida e água. A temperatura ambiente foi mantida a 24 ± 1 ° C sob luz natural ciclo /escuro. Todos os procedimentos experimentais em animais foram conduzidos de acordo com as orientações da Associação Internacional para o Estudo da Dor [11] e foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Animal da Universidade de Pequim.
A inoculação de células tumorais
MRMT-1 de rato células de carcinoma da glândula mamaria foram cultivadas em meio contendo meio RPMI 1640 (Hyclone, EUA) e 10% de soro fetal de bovino. As células foram libertadas a partir do plástico por uma breve exposição a 0,25% (peso /volume) de tripsina (Gibco, EUA), e, em seguida, preparada para injecção da seguinte forma: as células foram em primeiro lugar recolhido por centrifugação de 10 ml de meio durante 3 min a 1000 rpm . O sedimento resultante foi então ressuspenso em 1 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e as células foram contadas utilizando um hemocitómetro. Em seguida, as células foram diluídas até se atingir a concentração final para injecção e mantido em gelo até injectados em animais. Um modelo de rato de dor associada ao cancro do osso foi estabelecida por injecção intratibial de células singeneicas MRMT-1 como previamente descrito [12]. Resumidamente, depois anestesiados com hidrato de cloral (0,3 g /kg, i.p.), a tíbia esquerda de rato foi cuidadosamente exposto, e uma agulha de calibre 23 foi inserida no canal intramedular do osso. Ele foi, em seguida, removido e substituído por uma agulha romba longa e fina ligada a uma seringa Hamilton de 10 ul contendo-o meio a ser injectado. Um volume de MRMT-1 de rato células de carcinoma da glândula mamária 4 ul (4 × 10
4) ou de veículo (PBS) foi injectada na cavidade do osso da tíbia. Após a injecção local foi selada com cera de osso, e a ferida foi finalmente fechado. Nenhum dos animais apresentou sinais de disfunção motora após o implante das células tumorais.
Whole-cell patch de gravação braçadeira
Os neurónios foram isolados a partir de L4 e L5 de DRG de ratos adultos, utilizando métodos como descrito no nosso estudos anteriores [3], [13]. Resumidamente, os gânglios recém-dissecados foram picadas e lavada em água fria, oxigenado Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM; Sigma), e foram, em seguida, submetido a colagenase (/ml, de tipo IA, 3 mg Sigma) tratamento durante 45 minutos, seguida pela tripsina (2 mg /mL, Tipo II-S, Sigma) durante 15 minutos a 37 ° C. A reacção enzimática foi parada por lavagem das células com DMEM contendo soro de bovino fetal a 10%, e os pedaços restantes de gânglios foram suavemente triturado usando uma pipeta de Pasteur de vidro polido ao fogo e passada através de um filtro de células de 40 mícrons. A suspensão foi então centrifugada a 800 rpm durante 3 minutos, e o sedimento celular foi ressuspenso em DMEM fresco suplementado com soro bovino fetal a 10%. As células dissociadas foram colocadas em poli-D-lisina (0,1 mg /ml, Sigma) lamelas de vidro tenha sido tratada com contidos 4-se placas de cultura de tecidos estéreis e guardadas em 5% de CO
2 incubadora a 37 ° C durante 2 a 3 horas antes da gravação.
gravações remendo de célula inteira da braçadeira a partir de neurónios de DRG dissociados de forma aguda foram realizadas utilizando um amplificador EPC-10 e software Patchmaster (HEKA, Freiburg, Alemanha). Remendo pipetas foram puxados a partir de capilares de vidro de borossilicato com uma resistência de ponta de 5-8 MQ quando preenchidos com a solução interna contendo o seguinte (em mM): CsF 135, NaCl 10, HEPES 10, EGTA 5 e 2 de Na
2ATP. O pH foi ajustado para 7,3 usando CsOH. A solução externa continha o seguinte (em mM): 30 NaCl, 20 TEA-CI, 90 de colina-Cl, 3 de KCl, 1 CaCl
2, 1 MgCl
2, 10 HEPES, 10 glucose e 0,1 CDCl
2. O pH foi ajustado para 7,3 usando base Tris. correntes de membrana foram medidos com cancelamento de pipeta e a capacitância da membrana, filtrado a 2 kHz e digitalizados a 10 kHz.
De acordo com o modo de gravação voltagem-grampo, as células foram fixada em -70 mV, e resistência em série foi compensada para 70 % -90%. A capacitância de membrana foi adquirida a partir do amplificador pelo software Patchmaster para a determinação do tamanho das células e calcular a densidade de corrente. Todas as gravações foram realizadas em pequeno e médio diâmetro (20-35 mm) neurônios DRG, que são conhecidos para expressar tanto correntes TTX-R de sódio [14], [15] TTX-S e. correntes TTX-R foram evocadas a partir de um potencial de conservação de -120 mV para os impulsos de ensaio que variam de -80 a +45 mV em incrementos de 5 mV a uma frequência de 0,2 Hz, na presença de TTX (300 nm) para bloquear todos os TTX canais -s. Uma corrente de sódio mediada por Nav1.8 foi induzida com um protocolo de voltagem-grampo utilizado por Rush e Waxman [16] e Berta et ai. [17] na presença de 300 nM de TTX. impulsos de ensaio que variam de -80 a +40 mV em incrementos de 5 mV a uma frequência de 0,2 Hz, foram precedidos por um passo de pré-pulso de 500 ms a -40 mV, para inactivar TTX-R Nav1.9 corrente mediada. A corrente de pico máxima a várias tensões foi utilizado para a análise de densidade de corrente. As curvas de activação normalizada (I /I
0) foram equipados com a seguinte equação distribuição de Boltzmann: I /I
0 = 1-1 /1 + exp {[(V
1/2-V
m) /K]}, em que I
0 é a corrente de pico máximo em várias tensões de ensaio, V
m é o potencial de teste, V
1/2 é o potencial de membrana a metade do valor máximo I, e k é o factor de declive. A inactivação em estado estacionário dependente da voltagem foi estimado através da medição da amplitude da corrente de pico desencadeada por um pulso de teste de 100 ms a -10 mV, depois de um 500-ms pré-pulso de potencial ao longo da gama de -80 a +10 mV com uma 20-s período inter-pulso. As curvas de inactivação normalizada (I /I
0) foram equipados com a seguinte equação distribuição de Boltzmann: I /I
0 = 1 /{1 + exp [(V
1/2-V
m) /K]}, em que I
0 é a corrente de sódio pico no pulso testado medido a partir do potencial de impulso pré-condicionamento mais negativa, V
o símbolo m representa o potencial de impulsos de pré-condicionamento, V
1/2 é a potencial de membrana em metade do valor máximo I, e k é o factor de declive. A análise dos dados e encaixe foram realizadas usando software Origin 8.5 (OriginLab Corporation, Northampton, MA).
Western blot
Os ratos foram anestesiados profundamente com hidrato de cloral a 10% (0,3 g /kg, ip) , e, em seguida, os DRG L4 e L5 foram removidos e imediatamente homogeneizados de acordo com o protocolo descrito no nosso relatório anterior [18] para a extracção da proteína total e ensaio. Para citosol ou membrana de extracção e separação de proteínas, DRGs tecidos foram dissecados e foram lisadas por homogeneização com o kit de preparação Nucl-cito-MEM (Applygen, China) de acordo com as instruções do fabricante, e, em seguida, ensaiados usando métodos descritos por Black et ai. [19]. Dez microgramas de proteína total foi misturado com tampão de carga de 4 × e depois sujeitos a SDS-PAGE. salina Após o bloqueio com leite magro a 5% em Tris-tamponada e Tween (TBST, Tris-HCl a 20 (pH 7,5), NaCl a 150 mM e 0,05% de Tween-20) durante 60 minutos à temperatura ambiente, as membranas de PVDF foram incubadas com os seguintes anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite: anti-rato de anticorpo de coelho Nav1.8 (1:1000, Alomone Labs), de ratinho anti-β-actina (1:3000, Santa Cruz Biotechnology), ou receptor de transferrina anti-ratinho de rato (TFT) de anticorpos (1:2000, Invitrogen). As manchas foram lavadas em TBST e, em seguida, incubadas em anticorpo conjugado com peroxidase de rábano de cabra anti-coelho /IgG de ratinho secundário (1:2000, Santa Cruz Biotechnology). As bandas de proteína foram visualizadas usando um kit de detecção de quimioluminescência aumentada (Pierce) seguido por autorradiografia usando Hyperfilm MP (Santa Cruz Biotechnology). Blots foram digitalizados com um digitalizador canhão (Cannon, Inc., Japão), e as densidades de bandas foram detectadas com um software Quantidade (Bio-Rad, EUA). Os dados de cinco ratos foram utilizados para análise estatística.
Implantação do cateter intratecal e injeção de drogas
Para bloqueio farmacológico dos canais Nav1.8, cateteres foram implantados ao mesmo tempo com MRMT- 1 células tumorais ou PBS inoculação. De acordo com hidrato de cloral (0,3 g /kg, i.p.), a implantação de cânula intratecal foi realizada como descrito no nosso estudo anterior [20]. Em resumo, um cateter de polietileno PE-10 foi implantada entre o L6 vértebras L5 e para alcançar o alargamento madeira da medula espinhal. A parte externa do cateter foi ligado e fixo sobre a pele, sobre o encerramento da ferida. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob condições estéreis. Os ratos que mostram os défices neurológicos após a implantação dos cateteres foram excluídos.
Para examinar os efeitos de bloqueio farmacológico de Nav1.8 com um antagonista selectivo, A-803467 (TOCRIS, Reino Unido) em ratos cancro de osso, A-803467 (50, 100 e 150 nmol) ou do seu veículo (1% de DMSO) foi entregue por via intratecal a ratos MRMT-1 no dia 14 após a inoculação de células tumorais, quando a dor aparece hipersensibilidade. Como um controlo, dose elevada de A-803467 (150 nmol) ou do seu veículo (1% de DMSO) foi também administrado por via intratecal de PBS inoculados animais sham no dia 14 após a inoculação de PBS. Droga ou veículo foi intratecalmente injectado através do cateter implantado num volume de 10 ul de solução seguido de 10 ul de solução salina normal (NS) para a lavagem. Cada injecção durou, pelo menos, 5 min. Depois de uma injecção, a agulha permaneceu in si tu durante 2 minutos antes de ser retirada. Tanto a função comportamentos de dor e locomotora dos animais foram avaliados aos 15, 30, 60, 90 e 120 minutos após a aplicação da droga.
Avaliação da alodinia mecânica
alodinia mecânica, como um sinal comportamental do osso dor associada ao cancro, foi avaliada através da medição do limiar de retirada da pata 50% (PWT) como descrito nos nossos anteriores relatórios [3], [21]. O PWT 50% em resposta a uma série de filamentos de von Frey (Stoelting, Wood Dale, IL, EUA) foi determinada pelo método de cima para baixo e [22]. Os ratos foram colocados em um piso de malha de metal coberta com uma gaiola de plástico transparente invertido (18 × 8 × 8 cm) e permitiu um período de 20 min para a habituação. Oito filamentos de von Frey com aproximadamente iguais incrementais (0,224) forças de flexão logarítmicas foram escolhidos (0,41, 0,70, 1,20, 2,00, 3,63, 5,50, 8,50 e 15,10 g). Cada ensaio começou com uma força de von Frey de 2,00 g entregues perpendicularmente à superfície plantar da pata traseira esquerda durante cerca de 2-3 segundos. Uma retirada abrupta do pé durante a estimulação ou imediatamente após a remoção do cabelo foi registado como uma resposta positiva. Sempre que houve uma resposta positiva ou negativa, a próxima mais fraca ou mais forte do filamento foi aplicada, respectivamente. Este procedimento foi realizado até que tivesse sido observado seis estímulos após a primeira mudança na resposta. O PWT 50% foi calculada usando a seguinte fórmula: 50% PWT = 10
(X
F
+ kδ), em que X
f é o valor do último filamento de von Frey utilizado (em unidades log), K é um valor medido a partir do padrão de respostas positivas /negativas e δ = 0,224, que é o intervalo médio (em unidades log) entre os filamentos de von Frey [23]. Se um animal respondeu à menor de filamentos de von Frey, um valor de 0,25 g foi atribuído. Se um animal não respondeu ao mais alto filamento de von Frey, o valor foi registrado como 15,0 g. sessões de testes foram realizados a 0, 15, 30, 60, 90 e 120 min após a injecção de drogas.
A avaliação da hiperalgesia térmica
hiperalgesia térmica da pata traseira foi testada como descrito pela nossa anterior relatório [20]. Os ratos foram deixados a aclimatar durante um mínimo de 30 minutos no interior de caixas de acrílico sobre uma placa de vidro claro mantida a 30 ° C. Uma fonte de calor radiante foi focada na superfície plantar da pata traseira. As medições de latência de retirada da pata (PWL) foram tiradas por um temporizador que foi iniciado pela activação da fonte de calor e, quando parou a retirada da pata foi detectado com um fotodetector. A hora-limite máximo de 30 s foi usado para prevenir danos no tecido desnecessário. Três medições de PWL foram tomadas para cada pata traseira e foram ponderadas como o resultado de cada sessão de teste. A pata traseira foi testado alternadamente com mais de intervalos de 5 min entre os testes consecutivos.
Avaliação da função locomotora
test-placa inclinada foi realizada para a avaliação da função locomotora de ratos receberam A-803467 (150 nmol). O rato foi colocado transversalmente ao eixo longitudinal de uma placa inclinada. O ângulo inicial da placa inclinada foi de 50 °. O ângulo foi depois ajustada em incrementos de 5 graus. O ângulo máximo da placa em que o rato manteve sua posição do corpo durante 5 s, sem cair foi determinada de acordo com o método relatado anteriormente [24].
A análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas com GraphPad Prism 5.0 pacote (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA). Todos os dados foram expressos como a média ± SEM. Uma análise de variância (ANOVA) seguido por teste de Dunnett múltipla comparação ou ANOVA de duas vias seguido pelo teste de Bonferroni post-hoc foi utilizada para comparações múltiplas. Diferenças com P 0,05. Foram considerados estatisticamente significantes
Resultados
Aumento da corrente de sódio TTX-R em neurônios do GRD de ratos com dor de câncer ósseo
para explorar se TTX- R canais de sódio contribuirá para o desenvolvimento de dor óssea induzida pelo cancro, nós medimos primeiro correntes de sódio TTX-R gravados em neurónios DRG agudamente isolados em um modelo de rato de dor associada ao cancro do osso, através da adição de TTX (300 nM) à solução do banho para bloquear todos os canais sensíveis a TTX [25]. O protocolo de voltagem foi utilizado é mostrado na Fig. 1A. Verificou-se que a densidade de corrente de sódio TTX-R aumentou gradualmente após a inoculação de células tumorais de um modo dependente do tempo. No dia 7 após a inoculação, não se observou qualquer diferença significativa na densidade de TTX-R corrente de sódio entre neurónios de ratos tratados com células MRMT-1 de tumor (96,67 ± 8,2 pA /pF, n = 14) e aqueles a partir de ratos tratados com PBS (97,08 ± 5,8 pA /pF, n = 15) (P 0,05, ANOVA de duas vias, figuras 1C, D e G.), que é consistente com nossas descobertas comportamentais anteriores mostrando que não havia hipersensibilidade dor mecânicos ou térmicos naquele tempo [3]. No entanto, no dia 14 após a inoculação, a densidade de corrente de sódio TTX-R aumentaram significativamente nos ratos tratados com MRMT-1 (181,34 ± 17,2 pA /pF, n = 19) em comparação com ratos tratados com PBS (100,83 ± 14,7 pA /pF , n = 15) (P 0,001, ANOVA de duas vias, as Figuras 1E a G).. traços representativos de corrente de sódio TTX-R em ratos ingénuos, PBS-tratados e tratados com MRMT-1, gravados em neurónios DRG em 7 e 14 dias após a inoculação de células tumorais ou de PBS são mostrados nas Figs. 1B a F.
(A): protocolo de voltagem utilizado para a gravação de corrente de sódio TTX-R com 300 nM TTX na solução do banho. (B a F): vestígios representativos de corrente de sódio TTX-R em ingénuos (B), PBS-tratada (C e E) e MRMT-1-tratados ratos (D e F), gravados em neurónios DRG na posição 7 (C e D) e 14 (e e F) dias após a inoculação de células tumorais ou PBS. (G): A análise estatística da densidade da corrente de pico. Note-se que a densidade de corrente de sódio TTX-R é significativamente aumentada nos neurónios DRG de ratos câncer ósseo.
***
P
. 0,001, comparado ao grupo PBS, two-way ANOVA, n = 19 (MRMT-1) e 15 (PBS)
aumento na corrente de sódio Nav1.8 em neurônios do GRD de ratos com dor de câncer ósseo
Para isolar corrente de sódio Nav1.8 de corrente total de sódio TTX-R, foi utilizado outro protocolo de tensão com um pré-pulso de 500 ms à temperatura de -40 mV para inactivar o canal Nav1.9 tal como descrito no relatório anterior [17] (Fig. 2G). Os resultados mostraram que a densidade do mediada por Nav1.8 sódio actuais 14 dias após a inoculação aumentou significativamente em ratos tratados com MRMT-1 (136,11 ± 10,4 pA /pF, n = 17) em comparação com ratos tratados com PBS (74,09 ± 10,0 pA /pF, n = 16) (P 0,001, ANOVA de duas vias, as Figuras 2D a F).. Semelhante à densidade da corrente de sódio TTX-R, a densidade de corrente mediada por Nav1.8 permaneceu inalterada no dia 7 após a inoculação das células de tumor (P 0,05, vs. PBS, ANOVA de dois factores, n = 11 MRMT- 1 e 12 de PBS, as Figs. 2B, C e F). Para investigar se as propriedades intrínsecas do canal de sódio Nav1.8 foram alteradas após a inoculação de células tumorais, examinamos ambas as curvas de activação e inactivação de correntes de sódio Nav1.8 mediadas em ratos naïve, PBS-tratados e tratados com MRMT-1 . Como mostrado nas Figs. 2H e I, não foi observada alteração significativa em ambos a activação (Fig. 2H) ou a inactivação (Fig. 2I) curvas entre os três grupos, indicando que as propriedades intrínsecas do canal de sódio Nav1.8 permaneceu inalterada após a inoculação do tumor células. traços representativos de corrente de sódio Nav1.8-mediada, em ratos PBS e MRMT-1-tratados naïve, gravados em neurónios DRG em 7 e 14 dias após a inoculação de células tumorais ou de PBS são mostrados nas Figs. 2A a E.
(A a E): vestígios representativos de corrente de sódio Nav1.8 mediada em ingénuos (A), tratados com PBS MRMT-1 (B e D) e (C e E) ratos, gravados em neurónios DRG em 7 dias (B e C) e 14 (D e e) depois da inoculação das células tumorais ou PBS. (F): A análise estatística da densidade da corrente de pico. Note-se que a densidade de corrente de sódio Nav1.8 mediada é significativamente aumentada nos neurónios DRG de ratos câncer ósseo.
***
P Art 0,001, comparado ao grupo PBS, two-way ANOVA, n = 17 (MRMT-1) e 16 (PBS). (G): protocolo de voltagem utilizado para a gravação de correntes de sódio mediada por Nav1.8 com 300 nM TTX na solução do banho. A 500-ms pré-pulso a -40 mV foi usada para inativar os canais de sódio Nav1.9. (H e I): curvas de activação e inactivação da corrente de sódio Nav1.8 mediada em ratos ingénuos, PBS-tratados e tratados com MRMT-1 no dia 14 após a inoculação de células tumorais ou PBS. Note-se que não houve alteração significativa é observada quer na activação (H) ou nas curvas de inactivação (I) entre os três grupos. curvas de activação foram ajustados utilizando o mesmo protocolo utilizado para o registo da corrente de sódio Nav1.8. Note-se que as curvas em grupos ingênuo e PBS sobrepõem quase completamente. As curvas de inativação foram montados utilizando o protocolo descrito nos métodos.
Aumento na expressão de membrana de proteína Nav1.8 na DRG de ratos com dor de câncer ósseo
Além disso, nós examinamos a expressão da proteína Nav1.8 no DRG de ratos com dor nos ossos induzida por cancro, em particular, os canais na membrana celular, que representam canais funcionais. Usando o ensaio de transferência de Western, verificou-se que a expressão da proteína total em Nav1.8 L4 e L5 ipsilateral DRGs manteve-se inalterada a partir do dia 7 ao dia 14 em ratos tratados com MRMT-1 em comparação com ratos tratados com PBS (P 0,05, dois ANOVA, n = 4 /grupo, Fig. 3A). Isto era inesperado, como experiências de electrofisiologia revelou uma densidade de corrente aumentado de Nav1.8 em ratos tratados com MRMT-1 (ver Fig. 2). Especula-se que um tal aumento da corrente de sódio Nav1.8 é provavelmente devido a um aumento da expressão de Nav1.8 na membrana celular, porque as propriedades intrínsecas do canal de sódio Nav1.8 permaneceu inalterada após a inoculação de células tumorais (ver Figs. 2H e EU). Para clarificar esta hipótese, foi detectada ainda mais a expressão de Nav1.8 membrana usando um método de centrifugação a alta velocidade para isolar a fracção de membrana a partir de células de DRG como descrito no estudo anterior [19]. Como esperado, 14 dias após a inoculação de células tumorais, a densidade da banda de proteína Nav1.8 expresso na membrana de células aumentou significativamente em ratos tratados com MRMT-1 (1,45 ± 0,06, n = 6) em comparação com ratos tratados com PBS ( 0,87 ± 0,07, n = 6) (P 0,001, ANOVA de dois factores, a Fig 3B).. Enquanto isso, a densidade da banda de proteína Nav1.8 localizado no citosol diminuiu acentuadamente em ratos tratados com MRMT-1 (0,57 ± 0,04, n = 3) em comparação com ratos tratados com PBS (1,09 ± 0,02, n = 3) (P . 0,001, ANOVA de duas vias, Fig 3C)
(A):. A proteína total Nav1.8. Superior: representante de bandas de Western blot; Baixa: análise estatística da expressão da proteína total de Nav1.8. Não houve diferença significativa é observado sobre a expressão da proteína total Nav1.8 entre os três grupos.
P Art 0,05, ANOVA de duas vias, n = 4 /grupo. (B): proteína de membrana Nav1.8. Superior: representante de bandas de Western blot. receptor de transferrina (TfR) é utilizado como controlo interno. Baixa: análise estatística da expressão da proteína de membrana Nav1.8. Note-se que a expressão de Nav1.8 sobre a membrana celular é aumentado significativamente nos neurónios DRG de ratos tratados com MRMT-1 em comparação com ratos tratados com PBS.
***
P Art 0,001, ANOVA de duas vias, n = 6 /grupo. (C): proteína Nav1.8 no citosol. Note-se que a expressão de Nav1.8 no citosol é significativamente diminuída nos neurónios DRG de ratos tratados com MRMT-1 em comparação com ratos tratados com PBS.
***
P
. 0,001, ANOVA de duas vias, n = 3 /grupo
A-803467 alivia a alodinia mecânica e hiperalgesia térmica de câncer ósseo ratos
Finalmente, nós investigamos se a-803467, um bloqueador seletivo dos Nav1.8 [26] poderia aliviar a dor óssea induzida por câncer em ratos. Testamos PWT e PWL no dia 14 após a inoculação de células tumorais ou PBS como a linha de base. Então, A-803467 ou veículo de DMSO foi intratecalmente entregue ao MRMT-1 ratos dor de cancro inoculadas, bem como PBS inoculados ratos sham, e tanto o PWT e PWL foram medidas a 15, 30, 60, 90 e 120 min após a aplicação do fármaco. A dosagem e injeção de raiz de A-803,467 foi de acordo com um relatório anterior mostra que a administração intratecal de A-803467 (50-150 nmol) reduz tanto descargas evocadas e espontâneas de gama dinâmica neurônios de largura (WDR) no corno dorsal da medula [27 ]. Como mostrado na Fig. 4, a administração intratecal de A-803467 (em ambas as 100 e 150 nmol) poderia proeminentemente restaurar a diminuição induzida pelo cancro dos ossos, tanto PWT (P 0,05-0,001, comparativamente com o veículo /grupo de ratos com cancro, ANOVA de dois factores, n = 7-8 /grupo, figura 4A) e PWL (P . 0,05-0,001, comparativamente com o veículo /cancro grupo ratos, ANOVA de dois factores, n = 6-9 /grupo, figura 4B) de ratos com cancro.. Em contraste, mesmo uma dose elevada de A-803467 (150 nmol) não teve nenhum efeito significativo sobre o PWL e PWT de PBS inoculados ratos sham (P 0,05, comparativamente com o veículo /grupo de ratos sham, ANOVA de dois factores, n = 6 /grupo, as Figs. 4A e B). Para excluir qualquer disfunção motora possível induzida pela A-803467, que também examinou efeito da A-803.467 (a uma dose máxima de 150 nmol) sobre a função locomotora de ratos usando o teste de inclinação da placa. Como a nossa expectativa, sem disfunção motora significativa foi observada em nenhum momento após a injeção de drogas (p 0,05, ANOVA one-way, n = 7 /grupo, Fig 4C.). Estes dados sugerem que a inibição de Nav1.8 por A-803467 pode resgatar a alodinia mecânica induzida por tumores e a hiperalgesia térmica em ratos câncer ósseo
(A, B): Efeitos da A-803.467 (a 50. , 100 e 150 nmol) em mecânica (a) e térmicas (comportamentos B) dor em ratos, avaliadas no dia 14 após a inoculação de MRMT-1 células tumorais ou PBS. Note-se que A-803467 restaura notavelmente a redução induzida por células tumorais de PWT e PWL em ratos modelo câncer, mas não tem efeito significativo sobre o PWL e PWT em PBS inoculados ratos sham.
* /#
P Art 0,05,
** /##
P Art 0,01,
***
P 0,001, comparado com veículo /cancro (MRMT-1) grupo de ratos, ANOVA de dois factores, n = 6-9 /grupo. (C): teste inclinado-plate. Note-se que a administração intratecal de A-803467, na dose máxima de 150 nmol não tem efeito significativo sobre a função locomotora de ratos.
P Art 0,05, ANOVA one-way, n = 7 /grupo
Discussão
upregulation funcional dos canais de sódio Nav1.8 em neurônios do GRD de. ratos com dor de câncer ósseo
de acordo com descobertas anteriores de que a expressão de mRNA e proteína Nav1.8 são aumentados dentro lombar 4-5 DRG em um modelo animal de dor câncer ósseo [10], o nosso estudo fornecem adicional evidência directa demonstrando uma regulação positiva funcional de acesso por voltagem do canal de sódio subtipo Nav1.8 na membrana dos neurónios DRG em um modelo de rato da dor do cancro, que é provou ser necessária para o desenvolvimento da dor óssea induzida pelo cancro.
estudos biofísicos e farmacológicos identificaram que quatro canais de sódio específicos periférica, incluindo a NaV1.3 canais TTX-S e Nav1.7 eo TTX-R canais NaV1.8 e NaV1.9 são preferencialmente expressos nos neurônios DRG sensoriais primários e jogo papéis importantes na fisiopatologia de diferentes síndromes de dor [18], [28], [29]. Entre eles, o canal de sódio Nav1.8 foi demonstrado ser necessário para muitos tipos de dor inflamatória e neuropática crónica [26], [30], [31]. No entanto, o papel do canal de sódio Nav1.8 na patogénese da dor associada ao cancro ósseo ainda é desconhecido. Embora Qiu et al. [10] ter observado um aumento da expressão de Nav1.8 dentro DRG em um modelo de rato de dor associada ao cancro do osso, eles não definitivamente tirar uma conclusão se ou não o canal de sódio aumentada Nav1.8 contribui para a dor óssea induzida por cancro. Em outro estudo, Miao e colaboradores [32] relataram uma regulação baixa significativa de expressão Nav1.8 na DRG em um modelo de dor do câncer de rato. No entanto, utilizando oligodesoxinucleótidos anti-sentido (ODNs) contra Nav1.8, eles descobriram que knock-down de expressão Nav1.8 nos neurônios DRG poderia aliviar estabelecida comportamentos de dor do câncer em ratos portadores de tumor, o que implica um possível papel do Nav1.8 no desenvolvimento e manutenção da dor do câncer ósseo. De forma inconsistente, um estudo recente utilizando camundongos knock-out condicional mostrou que nem Nav1.7 ou Nav1.8 é necessário para dor óssea induzida por câncer [33]. Em nosso estudo, nós apresentamos evidências eletrofisiológicas e bioquímica mostrando que a densidade de corrente de sódio Nav1.8 mediada é significativamente aumentada nos neurônios DRG de ratos com dor de câncer ósseo e que este aumento é provavelmente devido a um aumento da expressão de Nav1 funcional .8 canais de sódio na membrana celular, em vez de alterações nas propriedades intrínsecas ou a expressão da proteína total dos canais, pois que, as correntes de sódio, juntamente com a densidade aumentada de ambos TTX-R e Nav1.8-mediadas, a expressão da proteína de membrana