Abstract

O objetivo deste estudo foi determinar se o anticorpo MUC1 conjugado com um fluoróforo poderia ser usado para visualizar o câncer de pâncreas. Anti-MUC1 anticorpo (CT2) foi conjugado com 550 nm ou 650 nm fluoróforos. ratinho nu foram usadas para fazer modelos subcutâneos e ortotópicos de cancro pancreático. Western Blot e análise de citometria de fluxo confirmou a expressão de MUC-1 em linhas celulares de cancro pancreático humano, incluindo BxPC-3 e Panc-1. A imunocitoquimica com anticorpos anti-MUC1 conjugado fluoróforo demonstrado áreas fluorescentes na membrana de células Panc-1 do cancro. Após a injecção de anticorpos anti-MUC1 conjugados através da veia da cauda, ​​transplantadas subcutaneamente Panc-1 e BxPC-3 tumores emitida fortes sinais fluorescentes. Nos modelos de tumores subcutâneos, o sinal fluorescente a partir do anticorpo anti-MUC1 conjugado foi observada à volta da margem do tumor e o espaço entre as células. O anticorpo anti-MUC1 conjugado ligado ao tumor em modelos ortotopicamente-transplantados Panc-1 e BxPC-3 permitindo que os tumores a ser trabalhada. Este estudo mostrou que fluoróforo conjugados de anticorpos anti-MUC1 poderia visualizar tumores pancreáticos in vitro e in vivo e pode ajudar a melhorar o diagnóstico e tratamento do câncer de pâncreas

Citation:. Parque JY, Hiroshima Y, Lee JY, Maawy AA, Hoffman RM, Bouvet M (2015) MUC1 seletivamente alvos do cancro do pâncreas humano em ortotópico Nude mouse Models. PLoS ONE 10 (3): e0122100. doi: 10.1371 /journal.pone.0122100

Editor do Academic: Shree Ram Singh, National Cancer Institute, United States |

Recebido: 14 Janeiro, 2015; Aceito: 18 de fevereiro de 2015; Publicação: 27 de março de 2015

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho está disponível sob a licença Creative Commons CC0 domínio público dedicação

Data Availability:. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento: Este estudo foi apoiado por doações do Instituto do Câncer CA142669 Nacional e CA132971 (a MB e AntiCancer, Inc.), e uma bolsa da Fundação Korea Research no âmbito do fundo de base promoção de pesquisas do Ministério da Educação e Saúde Recursos de Desenvolvimento da Coreia 2010-0022990 (para JYP). O financiador forneceu apoio sob a forma de salários para os autores [MB], mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições ‘

Conflito de interesses:. JYP, YH e RMH são afiliadas não assalariados de AntiCancer Inc. AntiCancer Inc. comercializa modelos animais de câncer. Não há outros interesses concorrentes. Não há patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

O marcador CA19-9 tumor pode ser detectado no soro de pacientes com cancro pancreático. No entanto, a utilidade de CA19-9 como um biomarcador cancro diagnóstico ou prognóstico é questionável. A sensibilidade de CA19-9 soro varia 41-86% com uma especificidade de 33 a 100%, o que não é adequado para o rastreio e de diagnóstico [1]. CA19-9 é frequentemente elevados em outras doenças inflamatórias e condições de obstrução biliar tal que a sua utilidade como um biomarcador é ainda mais questionável. São necessários melhores biomarcadores para o cancro do pâncreas [2].

MUC1 é uma glicoproteína ligada à membrana, que consiste de uma subunidade grande de domínio extracelular de um conjunto de 20 amino ácidos de repetição, uma pequena subunidade do domínio extracelular, um domínio transmembranar e um cauda citoplasma [3]. MUC1 é frequentemente sobre-expressos em vários cancros, incluindo mama, ovário, pulmão e cancro do cólon [3,4]. Também é considerado como um potencial biomarcador de diagnóstico, prognóstico e terapêutico do cancro pancreático. MUC-1 é sobre-expresso em mais de 90% dos tumores pancreáticos paciente cancro [5]. forte expressão da MUC1 é associada com a sobrevivência reduzida [6]. terapia direcionada MUC1 foi testado em ensaios pré-clínicos e clínicos [7-9]. Foram feitas tentativas para detectar proteína MUC1 no soro de pacientes e tecido de cancro pancreático com vários métodos [10,11].

Demonstramos que o anticorpo anti-CEA conjugado com fluoróforos ajudou a melhorar a detecção de cancro e de fluorescência habilitado cirurgia guiada por (FGS) em modelos de pâncreas e câncer de cólon do rato que melhoraram significativamente o desfecho em relação à cirurgia de luz brilhante padrão [12-14]. Tem sido relatado que a catepsina e claduin-4 alvejado imageamento óptico ajudaram a detectar câncer de pâncreas e seu precursor no mouse modelos [15,16].

No presente estudo, verificou-se se o anticorpo anti-MUC1 conjugado com um fluoróforo poderia alvo e visualizar câncer pancreático in vitro e em modelos in vivo.

Materiais e Métodos

linhas celulares de cancro do pâncreas

As linhas celulares de cancro pancreático humano BxPC-3 [ ,,,0],17] e Panc-1 [18] foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (Hyclone, Logan, UT), penicilina /estreptomicina (Gibco-BRL, Carlsbad, CA), piruvato de sódio (Gibco-BRL) , bicarbonato de sódio (Cellgro, Manassas, VA), L-glutamina (Gibco-BRL), e aminoácidos não essenciais meio mínimo essencial (Gibco-BRL). Todas as células foram cultivadas a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora.

Construção de linha celular de cancro pancreático-expressando GFP

A construção de proteína fluorescente verde (GFP) expressando linha celular de Panc-1 foi feito tal como descrito anteriormente [19]. Para a transdução do gene GFP, 20% confluentes células Panc1 [18] foram incubados com uma mistura 1: 1 mistura precipitada de sobrenadantes retrovirais de células de empacotamento PT67 e RPMI 1640 (Gibco-BRL, Life Technologies, Inc.) durante 72 h. As células foram recolhidas por tratamento com tripsina /EDTA 72 h após a incubação com sobrenadantes retrovirais de GFP e subcultivadas a uma razão de 1:15 em meio selectivo que continha 200 ug /ml de G418. O nível de G418 foi aumentada para 800 ug /ml por fases. Os clones que expressam GFP foram isoladas com cilindros de clonagem (Bel-Art Products, Pequannock, NJ) por tratamento com tripsina /EDTA e foram amplificados e transferido por meio de métodos convencionais de cultura. clones de alta GFP-expressão foram, em seguida, isolado, na ausência de G418 durante 10 passagens para selecionar para a expressão estável de GFP [20-22].

Ratos

atímicos

nu /nu

ratos pelados (AntiCancer Inc., San Diego, CA) , 4-6 semanas de idade, foram utilizados neste estudo. Os ratos foram mantidos em uma instalação de barreira sob a filtração HEPA. Os ratinhos foram alimentados com uma dieta de laboratório de roedores autoclavada. Todos os procedimentos cirúrgicos do rato e de imagem foram realizados com os animais anestesiados por injecção intramuscular de 50% de cetamina, xilazina 38%, e 12% de maleato de acepromazina (0,02 ml). Os animais receberam buprenorfina (0,10 mg /kg ip), imediatamente antes da cirurgia, e uma vez por dia durante os 3 dias seguintes para melhorar a dor. O tamanho máximo do tumor era inferior a 2 cm. A condição dos animais foi monitorizada diariamente. Os animais foram todos sacrificados 2-3 semanas após a cirurgia. inalação de CO2 foi usado para eutanásia. Para garantir a morte após asfixia com CO2, foi realizada deslocamento cervical. Todos os estudos com animais foram aprovados pelo AntiCancer, Institutional Animal Care Inc. e Use Committee (IACUC), em conformidade com os princípios e procedimentos descritos no Instituto Nacional de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais sob Assurance Número A3873-1.

conjugação Antibody-dye

Hamster anticorpos monoclonais para MUC1 (CT2; Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) foram conjugados com DyLight 650 ou 550 corantes (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA ) as especificações do fabricante, para garantir um mínimo de pelo menos 4: 1 de corante: proteína. Proteína: As concentrações de corante foram confirmadas usando um Espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts) [23]

Western blotting

Os lisados ​​celulares foram extraídas em tampão de lise contendo 70 mM de β-glicerofosfato. , ortovanadato de sódio mM 0,6, MgCl2 mM

2, 1 mM etilenoglicol ácido tetraacético, DTT 1 mM (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA), 0,5% de Triton-X100, 0,2 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, e 1% de protease cocktail inibidor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Os lisados ​​foram separados por electroforese em gel de dodecilsulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) de sódio e transferida para membranas de fluoreto de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA, EUA). As membranas foram bloqueadas em 5% (w /v) de leite magro seco e sondado com anticorpos. Foi utilizado anti-MUC1 (CT2). As proteínas imunorreactivas foram visualizadas utilizando o SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA).

análise de citometria de fluxo

As células foram cultivadas até à confluência de 80%, tratada com solução de Accutase (Sigma) durante 5 minutos, lavadas duas vezes com tampão de triagem de células activadas por fluorescência (FACS) (2% de FBS, 0,1% de azida de sódio em PBS). As células (1 x 10

6) foram ressuspensas em tampão de SCAF. As células foram fixadas com paraformaldeído a 2% e depois bloqueada com solução de BSA-PBS a 2% durante 30 min à temperatura ambiente. As células foram incubadas com anti-MUC1 (CT2, 2 ^ g /ensaio) durante 40 min à temperatura ambiente, e, em seguida, com cabra de hamster anti-arménio IgG-FITC (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA) durante 40 min à temperatura ambiente . Depois de se lavar com tampão de SCAF, as células foram ressuspensas em tampão de SCAF e submeteu-se a citometria de fluxo utilizando um FACS Aria (Sistemas Immunocytometry BD, Franklin Lakes, NJ). dispersão lateral e perfis de dispersão para a frente foram usadas para eliminar dobletes celulares.

Imunocitoqu�ica de células vivas

células Panc-1 (2 x 10

5) foram cultivadas durante a noite. Anti-MUC1 anticorpo (CT2) conjugado com DyLight corantes 550 foi diluído para 4 ug /ml em PBS (Corning Cellgro, Manassas, VA). O meio de cultura das células foi aspirado e o anticorpo diluído foi adicionado para as células vivas. As células foram incubadas com anticorpo durante 1 hora à temperatura ambiente. As células foram lavadas suavemente 2 vezes com solução salina tamponada com fosfato após o anticorpo foi aspirado. As células foram observadas em microscópio confocal FV1000 (Olympus, Tóquio, Japão) com luz branca e 559 de laser nm [24].

Imunohistoquímica

Para fluorescência imunocoloração em lâminas feitas de tecido tumoral congelado , foi utilizado anti-MUC1 (CT2) conjugado com DyLight 650. As lâminas foram incubadas com soro de burro normal a 10% durante 1 hora à temperatura ambiente, e incubadas com o anticorpo conjugado à temperatura ambiente durante 1 hora, a uma diluição de 1: 100. Os tecidos foram secos e observadas com um IV-100 microscópio laser confocal (Olympus, Tóquio, Japão) com laser de 633 nm [25]. lâminas alternadas a partir do mesmo tecido tumoral congelado foram coradas com hematoxilina e eosina e observadas ao microscópio de luz.

Pele modelo de retalho

foram anestesiados ratos nus com a mistura de cetamina por injecção subcutânea. Uma incisão em forma de arco foi feita na pele abdominal. O tecido conjuntivo subcutâneo foi separada para libertar o retalho de pele sem ferir a artéria e veia. O retalho de pele se espalhou e fixada na posição plana. Panc-1-GFP (1 X 10

6 células) em 30 mL de matrigel foram aspergidos na superfície interna do retalho de pele, ea pele foi fechada [26].

subcutânea e tumor ortotópico rato modelo

Para fazer transplantados subcutaneamente modelos de tumores pancreáticos, Panc-1 e BxPC-3 células de câncer pancreático humano (2 x 10

6) foram injectados subcutaneamente nos flancos de ratinhos nus. Quando os tumores subcutâneos cresceu entre 10 e 20 mm de diâmetro, que foram colhidas e fragmentadas em pequenos fragmentos. Os fragmentos de tumor foram implantados ortotopicamente em ratinhos nus, como descrito anteriormente [19,27-29].

imagem de corpo inteiro de

Em ambos os modelos de tumores subcutâneos e ortotópicos, os ratinhos foram injectados com o anticorpo conjugado com fluoróforo na veia da cauda, ​​e imagem de corpo inteiro, em seguida, foi realizada utilizando o Sistema de animal pequeno OV100 tratamento de imagens (Olympus, Tóquio, Japão), após anestesia com cetamina a mistura acima descrito [30]. A dose ideal para estudos em animais foi decidido por dose do anticorpo conjugado que produziu imagens com a melhor tumor à relação de fundo no modelo de tumor subcutâneo.

Imagem análise

Todas as imagens foram analisadas usando Image- J (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland) antes do processamento de imagens e comparados. processo de imagem foi feita com o Adobe Photoshop CS3 (Adobe Systems Inc., San Jose, Califórnia).

Resultados

A expressão de MUC1 em linhas celulares de cancro pancreático

Tanto o câncer de pâncreas linhas de células testadas (BxPC-3 e Panc-1) tinha a expressão MUC-1 observada com a técnica Western blot (Figura 1A). A proporção de células positivas para MUC1 foram de 36,9% no BxPC3 e 24,4% em linhas celulares de cancro pancreático Panc1, como observado com a citometria de fluxo (Figura 1B). O mesmo teste foi repetido em cada linha de células pelo menos três vezes. Os resultados de todas as experiências mostraram que o anticorpo anti-MUC1 (CT2) poderia detectar proteína MUC1 na membrana celular de células de cancro do pâncreas in vitro.

(A) análise de transferência de Western mostra a expressão de MUC-1 em linhas celulares do cancro do pâncreas (BxPC -3 e Panc-1). Análise (B) por citometria de fluxo mostra a expressão de MUC-1 na superfície de BxPC-3 e linhas de células Panc-1. (C) imunocitoquímica, em células vivas mostra múltiplos pontos fluorescentes na superfície de células Panc-1. imagens de fluorescência representativos mescladas com imagens DIC (diferencial de contraste de interferência) correspondente (x60 objectiva de imersão em água sobre FV1000, utilizando o laser 559 nm).

Imunocitoqu�ica também foi realizada utilizando anticorpo anti-MUC1 (CT2) conjugado com flourophores. Após a incubação com o anticorpo conjugado sem permeação, múltiplos pontos fluorescentes foram observadas na superfície das células Panc-1, sob um microscópio de fluorescência (Figura 1C). A fusão com microscopia de contraste de interferência diferencial correspondente confirmou que o anticorpo fluophore conjugado reagiu com MUC-1 na superfície das células de cancro do pâncreas e produzido de fluorescência.

Segmentação de tumores pancreáticos subcutâneas com MUC1 fluorescente

Quando BxPC-3 ou Panc-1 tumores subcutâneos tinham atingido aproximadamente 10-20 mm de diâmetro, os animais foram, cada um recebeu uma única dose de 30 ug de 650-DyLight conjugado anti-MUC1 (CT2) através da veia da cauda. Os ratos foram fotografadas sob ambos claro e de fluorescência de iluminação com o Sistema de Imagem de Pequenos Animais Olympus OV100. Ambos Panc-1 (Figura 2A) e BxPC-3 (dados não mostrados) mostraram fluorescência mais forte do tumor. Fluorescência a imunocoloração foi realizada em amostras de tumor congeladas feitas a partir de BxPC-3 e mostraram fluorescência em membranas celulares que demonstram a expressão de MUC-1 (Figura 2B).

(A) O rato é imaginada tanto sob luz de fluorescência e iluminação branca. A intensidade do sinal de fluorescência vermelha do tumor subcutâneo Panc1 é mais forte do que o fundo. (B) de hematoxilina e eosina (x200, à esquerda). Fluorescência imunocoloração para MUC1 (objetiva regulares x20, direita) de amostras de tumores congelados mostra sinais de fluorescência na membrana das células cancerosas.

Segmentação de células de câncer de pâncreas em retalhos de pele com MUC1 fluorescente

os ratinhos com células de cancro do pâncreas que crescem em retalhos de pele foram injectados com anticorpos anti-MUC1 (CT2) conjugado com DyLight corantes 550 na veia da cauda. Quarenta e oito horas após a injecção de anticorpo, a aba de pele foi espalhada novamente. A visualização foi realizada com o OV100 e FV1000. Várias colónias de células cancerosas foram notadas na superfície do retalho de pele com o OV100. sinais de fluorescência de GFP a partir de células de cancro individuais foram observados com o FV1000. Na margem do lado de fora da colônia e espaço entre as células cancerosas dentro da colônia, a 550 nm sinais de fluorescência, que se originou a partir do anticorpo fluoróforo conjugado, foram observados. (Figura 3) Os resultados demonstraram que o anticorpo reage com o MUC1 na membrana das células cancerosas in vivo.

Imagens representativas foram obtidos sob luz branca, e 473 nm e 559 nm sobre a lasers OV100, e fundiu . Foram observadas sinal GFP das células cancerosas individuais e sinal vermelho fluorescente do anticorpo anti-MUC1 DyLight 550 fluoróforo conjugado na margem externa da colônia e espaço entre as células cancerosas.

Segmentação de pâncreas tumores em modelos ortotópicos com fluorescente Ratos MUC1

com tumores implantados ortotopicamente em pâncreas de rato foram injectados com anticorpo 650 DyLight-conjugado anti-MUC1 (CT2) com uma única dose de 30 ug por meio da veia da cauda de 7-10 dias após a implantação do tumor. A visualização foi realizada após a abertura do abdómen dos ratos. imagiologia intravital com o OV100 detectado o sinal de fluorescência proveniente de tumores e Panc1 BxPC3 (Fig 4). Tumores menos de 5 mm pode ser detectada com imagens de fluorescência (Figura 4). As razões da média de intensidade de fluorescência entre tumor e de fundo em Panc-1 e BxPC-3 tumores ortotópicos foram 6,70 e 2,39, respectivamente. Estes resultados confirmaram que, em modelos de tumores ortotópicos, MUC1 alvo câncer de pâncreas e detecção de tumores habilitado. Diferente do tumor, os sinais de fluorescência foram detectados a partir da pele e, bexiga e conteúdo intestinal, mas em menor intensidade.

sinais de fluorescência a partir de tumores pancreáticos transplantados ortotopicamente na cauda do pâncreas foram detectados. Diferente do tumor, o sinal de fluorescência foi detectada a partir da pele e, bexiga e conteúdo intestinal, mas em menor intensidade do que o tumor. setas brancas indicam tumor pancreático.

Discussão

MUC1 é um biomarcador de imagem muito atraente para câncer de pâncreas, uma vez que é sobre-expresso em cerca de 90% dos pacientes com câncer pancreático [5,6]. Os resultados deste estudo de modelos de tumor subcutâneo e ortotópicos demonstrar que MUC1 pode direcionar e visualizar o câncer de pâncreas, tornando-o fluorescente. Os resultados do presente estudo demonstram que MUC1 é uma meta adicional para entrega rotulagem e terapêutica do cancro do pâncreas. MUC-1 pode ser um alvo útil para identificar e tratar metástases à distância de todos os tipos de cancro que expressam o antigénio utilizando anticorpos marcados ou terapêuticas de transporte.

BxPC-3 e Panc-1 foram seleccionados com base em estudos anteriores com estas linhas celulares para a cirurgia guiada por fluorescência (FGS) [13,14]. É possível que a fracção de células positivas em que o tumor é menor do que a observada por citometria de fluxo, devido ao impedimento estérico do anticorpo para a entrada para dentro do tumor. É também possível que a presença de células estromais, em que o tumor pode diminuir a percentagem de células positivas.

O anticorpo CT2 é reconhecendo tanto as células cancerosas vivas, bem como as células dentro do tumor no ratinho que é prontamente visualizado por conjugação do anticorpo com um fluoróforo. É possível que na célula viva, partes suficientes da cauda citoplasmática se tornam acessíveis ao anticorpo. Como mostrado recentemente por Kumar et al, mais estudos são necessários para entender a estrutura e localização subcelular da proteína MUC1 [31].

Tem havido tentativas de usar MUC1 como um alvo do tratamento. MUC1 imagem alvo pode orientar a terapêutica ao tumor [11,32,33]. Imaging para MUC1 pode demonstrar se alvos terapêuticos estão presentes em células cancerosas e prever a resposta ao tratamento da terapia MUC1-alvo [5]. Além disso, imagens de fluorescência orientada para MUC1 no cancro pancreático podem melhorar a visualização de tumores, a fim de alcançar a ressecção completa durante a cirurgia. Fluorescente cirurgia guiada (FGS) foi mostrado para melhorar a sobrevivência em modelos de ratos com câncer de pâncreas [13,14].

No presente estudo, nós fato para estudar MUC1 alvo de cancro pancreático humano com o próximo objetivo de estudando MUC1 segmentação em nossa câncer pancreático xenotransplante ortotópico (PDOX) modelos [12]. futuros estudos subsequentes estarão em MUC1 visando em modelos de ratos PDAC espontâneas. estudos bio-distribuição formal será feito em experimentos futuros. O presente estudo mostra MUC1 pode ser usado para tumor seletiva alvo in vivo. Com base na capacidade do anticorpo MUC1 fluorescente segmentação para iluminar estes tumores, podemos agora comparar FGS em futuros estudos com anticorpos marcados anti-ACE e anti-MUC1.