Abstract

esporádica carcinoma colorectal início precoce (EOCRC), que tem, por definição, não hereditária identificados predisposição é um problema crescente que continua a ser mal compreendido. A análise molecular pode melhorar a identificação dos distintos subtipos de cancro colorectal (CRC) com implicações terapêuticas e, portanto, pode ajudar a estabelecer que EOCRC esporádica é uma entidade distinta. De 954 pacientes ressecados para CRC em nossa instituição, foram selecionados 98 pacientes. Pacientes com idade entre 45-60 anos foram excluídos para ajudar a definir “jovens” e grupos “velhos”. Trinta e nove casos de EOCRC esporádica (anos patients≤45 com tumores estáveis ​​microssatélites) foram comparados com os tumores microsatélites estáveis ​​de pacientes mais velhos (36 casos, os pacientes 60 anos) e grupos de pacientes com instabilidade de microssatélites. Cada grupo foi testado para

TP53

,

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

mutações ea presença de um fenótipo methylator. perfis de expressão genética também foram utilizados para análise de caminho. Em comparação com microssatélites estável CRC de pacientes antigos, esporádica EOCRC foram caracterizados por localização distal, metástases síncronas frequentes e adenomas síncronos pouco frequentes, mas não tem características morfológicas específicas. A história familiar de CRC foi mais comum em pacientes EOCRC esporádicos apesar da falta de condições hereditárias identificados (p = 0,013). Estudos genéticos também demonstrou a ausência de

BRAF

mutações (p = 0,022) e o fenótipo methylator (p = 0,005) em EOCRC esporádica comparação com os doentes mais velhos. análise de expressão de genes implicados caminhos-chave, como Wnt /beta catenina, MAP Kinase, fator de crescimento de sinalização (EGFR, HGF, PDGF) e a via de TNFR1 em EOCRC esporádica. activação de sinalização /beta catenina de Wnt foi confirmada por imunocoloração aberrante beta catenina nuclear (p = 0,01). Este estudo sugere fortemente que EOCRC esporádica é um clínico-molecular apresentando entidade distinta como uma doença distal e agressivo associado com instabilidade cromossômica. Além disso, várias vias de sinalização, incluindo a via TNFR1 foram identificados como potenciais biomarcadores para o diagnóstico e tratamento desta doença

Citation:. Kirzin S, Marisa L, Guimbaud R, De Reynies A, Legrain M, Laurent -Puig P, et al. (2014) esporádica de início precoce O câncer colorretal é uma sub-tipo de câncer: Um morfológica, Molecular e Estudo Genetics. PLoS ONE 9 (8): e103159. doi: 10.1371 /journal.pone.0103159

editor: Peh Yean Cheah, Hospital Geral de Cingapura, Cingapura

Recebido: 18 Março, 2014; Aceito: 26 de junho de 2014; Publicação: 01 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Kirzin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Os dados estão disponíveis no NCBI, GEO número de acesso repositório:. GSE39084

Financiamento: Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Ligue Régionale Contre Cancer le, Comité du Gers eo programa Carte d’Identité des Tumeurs da Ligue Nationale Contre Cancer le. Os autores agradecem o cancro do Institut National Contre le pelo apoio do geneticista clínico e laboratorial. Os autores agradecem Cancéropôle Grand Sud-Ouest para fornecer anotações clínicas. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer colorretal (CRC) é mais comumente visto em adultos idosos com uma idade média no diagnóstico de 70 anos [1]. No entanto, de acordo com a US Registos a incidência de CRC em adultos jovens está a aumentar constantemente, a uma taxa de 1,5% ao ano entre 1992 e 2005, em adultos com idades entre 20-49 [2]. Início precoce CRC (EOCRC) é uma doença agressiva com pobre diferenciação e é classicamente localizado no cólon esquerdo. Os indivíduos podem estar predispostos a EOCRC através de doenças hereditariedade e inflamatórias intestinais. As formas hereditárias mais bem definidas de CRC são síndrome de Lynch e polipose adenomatosa familiar (FAP), que são responsáveis ​​por 2-4% e menos do que 1% do total de casos de CRC, respectivamente, [3]. A contribuição relativa das doenças inflamatórias intestinais e FAP para EOCRC é modesto uma vez que ambas as condições podem ser facilmente identificados por suas características clínicas e gerido pela triagem e tratamento profilático de acordo com as diretrizes estabelecidas. Em contraste, a síndrome de Lynch não apresentam um fenótipo específico e frequentemente conduz a carcinoma, tornando-se um terço dos casos EOCRC [4]. Assim, a maioria dos casos esporádicos são EOCRC que carecem de marcadores genéticos que indicam uma predisposição

CRC é uma doença heterogénea, que é dividida em três sub-tipos de [5], de acordo com os mecanismos moleculares de condução sua transformação:. ( i) instabilidade cromossómica (CIN), o mecanismo predominante, o qual é caracterizado por tumores estáveis ​​microssatélites (MSS), perda de heterozigocidade e grandes alterações cromossómicas em genes supressores de tumores e oncogenes [9]; (Ii) Uma mudança epigenética conhecido como o CpG island methylator fenótipo (CIMP) que provoca o silenciamento transcricional por metilação de regiões ricas em CpG do promotor de genes supressores de tumores. CIMP é responsável pela grande maioria dos tumores esporádicos MSI através de silenciamento do promotor do gene da MMR

hMLH1

[7], [8]; (Iii) instabilidade microssatélite (MSI), que é a marca de síndroma de Lynch e é caracterizada pela acumulação de mutações em sequências de deslocamento do quadro de microssatélites devido a uma deficiência na reparação de emparelhamentos incorrectos (MMR) genes [6]. No entanto, esta classificação molecular atualmente usado de CRC é baseado em apenas alguns marcadores de DNA comum.

Até agora os marcadores moleculares de EOCRC esporádica não foram totalmente exploradas e as suas contribuições individuais para a carcinogênese não foram caracterizadas. perfil de expressão análise do genoma (GEP) poderia melhorar a classificação molecular de CRC e ajudar a identificar entidades clínicas e biomarcadores capazes de predizer a resposta ao tratamento. Nós recentemente utilizado este tipo de abordagem para identificar seis subtipos moleculares de CRC que surgem através de vias biológicas distintas [10].

O objetivo do presente estudo foi investigar EOCRC esporádica usando uma abordagem integrada que combina clinico exaustiva dados Patológica com análises genéticas a fim de determinar as características clínicas e perfis moleculares desta entidade específica. Para este estudo, pela primeira vez identificado um grupo homogêneo de EOCRC esporádica que foi definido por ter um diagnóstico de câncer em menores de 45 anos de idade, não tendo nenhuma predisposição hereditária identificado para CRC e ter um perfil de MSS. A seguir, comparação de dados específicos genética, epigenética e de expressão gênica deste grupo com a de outros grupos bem definidos de CRC.

Materiais e Métodos

Este estudo foi desenhado para investigar os casos esporádicos EOCRC ( MSS tumores de pacientes jovens) e compará-los com contrapartida tumores MSS de pacientes mais velhos. Incluímos também CRC com MSI (ambos de pacientes jovens e idosos), uma vez que constituem um modelo bem caracterizado de CRC oncogênese.

Pacientes e amostras selecção

Entre abril de 1999 e dezembro de 2005, 954 pacientes foram tratados e acompanhados por CRC em nossa instituição. Doentes com menos de 45 anos (doravante referida como pacientes “jovens”) e mais foram consideradas 60 ( “velho”) para comparação. Os critérios de exclusão foram: tecido congelado indisponíveis; diagnóstico de FAP ou IBD; pré-operatório quimioterapia /radioterapia; As amostras contendo células de tumor inferior a 50%; e desconhecida estatuto MMR. Devido a uma alta proporção de estágio IV MSS tumores de pacientes jovens, tumores MSS de pacientes jovens e idosos foram pareados de acordo com o estágio do tumor. Após a selecção da amostra, 98 pacientes estavam disponíveis para o estudo, como descrito na Figura 1. Quatro grupos de pacientes foram definidos: MSS-Y (MSS-tumoral 45 anos), 39 casos; MSI-Y (MSI tumor 45 anos), 9 casos; MSS-O (MSS tumor 60 anos), 36 casos; eo grupo MSI-O (tumor MSI 60 anos)., 14 casos

Consort diagrama que representa a seleção de pacientes a partir de uma única instituição, com base em tecido congelado disponíveis e após a aplicação de critérios de exclusão. Quatro grupos foram definidos tendo em conta a idade eo estado MMR. O estudo foi desenhado para permitir a comparação de MSS de início precoce CRC com outros grupos bem definidos de CRC. FAP: polipose adenomatosa familiar. IBD: Doença inflamatória intestinal. estatuto MMR: status de reparo incompatível. MSS: estável de microssatélites. MSI:. Microssatélites instável

Comissão de Ética Aprovação

Todos os pacientes foram prospectivamente registrados em um banco de dados protegido Central declarados à Comissão Nationale Informatique et Liberté (1.365.952). O uso dos tumores recolhidos foi aprovado pelo conselho Toulouse Hospital (CRB-Cancer Toulouse, DC-2008-463, AC-2008-820, CPP2). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os assuntos.

parâmetros estudados

Setenta e nove variáveis ​​de interesse foram extraídos do banco de dados e analisados. Estes dados clínicos incluídos (pedigree familiar, local do cancro, apresentação clínica no momento do diagnóstico, modalidades de tratamento, a sobrevida) e características do tumor (dados patológicos completos, presença de adenoma síncrona no segmento ressecado, estado MMR, presença de alterações genéticas e epigenéticas). O seguimento clínico dos pacientes foi realizada de acordo com as diretrizes nacionais publicados [11]. As curvas de sobrevivência foram estabelecidos a partir da data do diagnóstico de acordo com os cálculos de Kaplan-Meier. Detalhes de variáveis ​​estudadas são fornecidos na Tabela S1.

estatuto MMR e familiar pedigree

estatuto MMR foi determinada no momento do diagnóstico (anterior ao estudo) por avaliar o estado de instabilidade de microssatélites usando um PCR pentaplex e por usando imuno-histoquímica (IHC) para testar a expressão de MLH1, MSH2 e MSH6, como previamente descrito [12]. deficiências de reparação de emparelhamentos incorrectos (tumores dMMR) foram definidos pela MSI e /ou perda de expressão de uma das proteínas de MMR, enquanto MMR (pMMR) tumores proficientes correspondeu a tumores MSI-baixos ou MSS que expressam as proteínas de MMR.

o pedigree de todos os jovens pacientes foi avaliado por um único geneticista clínico (RG). Os testes genéticos para os 2 principais genes MMR

hMLH1

e

hMSH2

foi realizada no caso de tumores MSI ou quando história pessoal ou familiar de câncer estava presente em pacientes jovens. O diagnóstico de síndroma de Lynch foi formalmente confirmado pela identificação de uma mutação da linha germinativa do gene deletério em uma MMR. Casos de tumores MSI que indicam uma ausência de MSH2 ou coloração MSH6 com IHC foram considerados como síndrome de Lynch provável.

A análise mutacional

A genotipagem de mutações-chave que ocorrem no câncer colorretal (

KRAS

,

BRAF

,

TP53

e

PI3KCA

) foi realizada seguindo a extração de DNA a partir de tecido congelado. As sete mutações mais frequentes nos codões 12 e 13 da

KRAS

, e a mutação V600E códon no

BRAF

foram avaliados por hibridização alélicas utilizando sondas Taqman, como descrito anteriormente [13]. A sequenciação directa de

TP53

exons 5 a 9 e

PI3KCA

exons 9 e 20 foi realizada em paralelo utilizando a técnica de Sanger (Beckman Coulter, Danvers, MA, EUA).

Methylator avaliação fenótipo

perfis CIMP foram determinadas usando um painel de cinco marcadores como descrito por Weisenberger

et al

:

CACNA1G

,

IGF2

,

NEUROG1

,

RUNX3

e

SOCS1

. Após o tratamento com bissulfito de ADN, foram realizadas duas reacções de PCR específica de metilação-multiplex. análise de fragmentos foi levada a cabo por electroforese capilar num sequenciador automático (Beckman Coulter, Danvers, MA, EUA). Methylator casos fenótipo positivo (CIMP +) teve 3 ou mais metilados promotores enquanto os CIMP-negativos tinham menos de 2 promotores metilados, definidas de acordo com critérios estabelecidos [14].

extração de RNA e análise de microarray

O ARN total foi isolado utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), e verificado quanto à pureza, integridade e quantidade. As amostras foram, em seguida, amplificado, marcado e hibridado com um Plus2 GeneChip Affymetrix Human Genome U133, seguindo um protocolo de ciclo-alvo rotulagem do fabricante (Affymetrix, Santa Clara, CA). Os chips foram digitalizadas com um scanner Affymetrix GeneChip 3000 e intensidades matérias foram extraídas de imagens subsequentes usando GCOS 1.4 software (Affymetrix). Os dados foram normalizados utilizando o método robusto Média multiarray (RMA), implementado no pacote de R affy [15]. Os dados estão disponíveis no Gene Expression NCBI repositório Omnibus (número de acesso: GSE39084).

análise Unsupervised

descoberta classe foi realizada pelo agrupamento de consenso de perfis de expressão, como descrito anteriormente [16]. conjuntos de sondas foram primeiro filtrada para manter aqueles expressos (isto é, com um valor de intensidade normalizada mais de 15) em, pelo menos, 10% das amostras com uma variação significativamente mais elevada do que a variância média de todos os conjuntos de sonda (P 0,01). Em seguida, foram obtidos 7 lista que inclui de 1% a 50% dos conjuntos de sonda mais variantes (com base no coeficiente de variação robusto). Para cada lista constante sonda, as amostras foram agrupadas utilizando a correlação de 1-Pearson para a distância métrica e articulação Ward, rendendo 7 dendrogramas. Partições em k clusters (k 2-8) foram obtidos por cada dendrograma e uma partição de consenso foi calculado para cada valor de k, produzindo 7 partições de consenso.

análise Supervisionado

As associações entre clínica e anotações molecular e grupos de amostras foram testadas para significância estatística usando o teste do qui-quadrado ou exato de Fisher, quando apropriado. Genes diferencialmente expressos entre os tumores de pacientes MSS jovens e velhos foram selecionados com base em Limma moderado valores de p t-teste ajustados para testes múltiplos pela Benjamini método de Hochberg ( 0,05) [17]. Vias do banco de dados Biocarta foram testados para o enriquecimento de genes desregulados por combinação dos seguintes métodos: Globaltest (R pacote globaltest), SAM-GS, e Tuckey [18], [19]. Os valores de p de cada método foram convertidos em fileiras e a classificação média foi calculada para encomendar vias.

sinalização catenin Beta ativação da via

A imuno-histoquímica foi realizada em blocos fixo-formol e embebidos em parafina a partir dos 98 pacientes do estudo com o mouse anticorpo monoclonal beta catenina (Clone 14, BD Biosciences, diluição 1/200, Ventana XT Autostainer (Tucson, AZ, EUA). Todas as lâminas foram revisadas por dois patologistas cegos para grupos de pacientes ( JS e SK). a activação da via de sinalização de beta catenina foi definido por coloração nuclear forte em mais de 50% de células tumorais, com ou sem coloração citoplasmática difusa e com uma perda de coloração da membrana celular [20].

resultados

características clínico-patológicos da esporádica EOCRC

O grupo EOCRC esporádica consistiu de 39 pacientes, distribuídos da seguinte forma: 17 eram 40-45 anos, 13 eram 35-40 anos, 5 eram 30-35 anos, 2 foram 25-30 anos e 2 tinham menos de 25 anos de idade. Tal distribuição da idade está de acordo com dados publicados no registo dos EUA [1]. Em comparação com os tumores de pacientes antigos MSS, (pacientes jovens MSS) esporádicos EOCRC exibido características distintivas. tumores do reto foram mais abundantes no EOCRC esporádica (41% versus 8,3%, p = 7,4

e-04) com adenomas menos frequentes observados em espécimes ressecados (8% versus 33%, p = 0,013). Notavelmente, 15 (38%) pacientes EOCRC esporádicos tiveram uma história familiar (primeira ou parente até segundo grau) da CRC em comparação a 3 (9%) no grupo de pacientes antigos MSS (p = 0,013). A análise do pedigree destes 15 pacientes revelou que 3 deles tinha um padrão de herança autossômico transmissão dominante clara com vários membros da família afetados. Dois dos três eram da mesma família, mas nenhuma mutação da linha germinativa tenha sido identificado até à data. Os restantes 12 pacientes tinham um modo indeterminado de transmissão com apenas um membro da família ascendente possuindo CRC, geralmente em idade avançada ( 60 anos). De acordo com as recomendações franceses,

MUTYH

análise de mutações foi realizada por apenas um paciente que apresentava 8 adenoma, mas esta análise foi negativo [21]. Observou-se uma história pessoal de CRC apenas em pacientes de idade (incluindo tanto os tumores MSI MSS e). Todos os tumores da MSI pacientes jovens surgiu no contexto de síndrome de Lynch, e 3 pacientes (21,5%) do grupo de idade MSI também foram pacientes Lynch. Ao considerar toda a população estudada, as outras diferenças significativas observadas entre os grupos estavam ligados à deficiência de MMR, ou seja, mais frequente localização proximal (p = 2,0

e-05), diferenciação celular pobres (p = 0,033) e do componente mucinoso frequente ( p = 0,012). As principais características da população estudada são apresentados na Tabela 1.

EOCRC esporádica é uma doença agressiva frequentemente se apresentam com metástases ao diagnóstico. A localização de tumores metastáticos era predominantemente no fígado e dos pulmões, como observado para CRC. Um perfil de sobrevida específica foi observada para cada grupo de pacientes, com sobrevida global melhor para MSI do que os pacientes MSS. Apesar de uma elevada carga de metástases (com 23,1% versus 5,6% ter múltiplos sítios metastáticos ao diagnóstico), os pacientes EOCRC esporádicos tiveram uma melhor sobrevida global em 5 anos do que os pacientes antigos MSS, embora esta não foi significativa (69% versus 42%, p = 0,09). A taxa de sobrevida global em cinco anos foi de aproximadamente o mesmo para pacientes MSI, embora MSI pacientes jovens experimentaram recidiva precoce mais frequente (Figura 2)

.

Cada grupo tinha um perfil específico de sobrevida global, embora nenhum foram significativamente diferentes uns dos outros (p = 0,15). MSS: estável de microssatélites. MSI: microssatélites instável

características genéticas e epigenéticas de esporádicos EOCRC

padrões de mutação de

KRAS

,

BRAF

e

TP53. ,

eo status CIMP foram estabelecidas para todos os pacientes (Tabela 2).

PI3KCA

genotipagem foi realizada por 74 tumores. O perfil mutacional de tumores esporádicos EOCRC foi semelhante à dos tumores MSS de pacientes antigos para

KRAS

,

TP53 Comprar e

PIK3CA

genes, mas era claramente diferente para

BRAF

mutações e perfis CIMP. tumores esporádicos EOCRC nem continha

BRAF

mutações (p = 0,022) nem exibiu um perfil CIMP + (p = 0,005) em comparação com tumores de pacientes de idade MSS. tumores MSI em pacientes de idade tinha uma alta taxa de

BRAF

mutação (36%) e frequentemente exibido um CIMP + perfil (62%). MSI pacientes jovens diferiam dos pacientes idosos MSI pela ausência de um fenótipo methylator (p = 0,006) e

BRAF

mutações.

análise do transcriptoma

dados de microarranjos foram obtidos para 70 pacientes. As análises revelaram que não supervisionadas, independentemente do número de aglomerados e a percentagem de genes variantes usadas, as partições subjacentes foram consistentemente e fortemente associada com o estado e grupos MMR. Outras variáveis ​​associadas significativamente com as partições sem supervisão eram localização do tumor, estado CIMP e mutante BRAF. Essas variáveis ​​foram-se intimamente associado com o estado de MMR. A idade foi ligeiramente associada com algumas divisórias (não supervisionadas obtidos utilizando 5% e 20% dos maioria dos genes diferentes). A partição de consenso nas 5 clusters foi mais associado com os quatro grupos definidos no estatuto MMR e idade (Figura 3). Cluster 1 (C1) foi quase exclusivamente composto por tumores MMR deficiente. Cluster C2 foi enriquecido com MMR proficiente e tumores com mutação BRAF. Clusters C3 e C4 continha mais CIMP +, C4 sendo quase exclusivamente composto por tumores MMR proficientes de pacientes idosos. Cluster 5 (C5) foi enriquecida em tumores esporádicos EOCRC encontrados no cólon esquerdo

classificação não-supervisionada de perfis de expressão:. Dendrograma do agrupamento mais próximo para a partição de consenso para k = 5. Legenda: io, MSI /Old ; iy, MSI /Young; assim, MSS /Old; sy, MSS /Young; d, deficiente MMR; p, proficiente MMR; R, cólon direito; L, cólon esquerdo; Re, reto; H, mutado; . W, do tipo selvagem

A seguir, realizou uma análise supervisionada de tumores MSS (n = 54) que forneceram uma lista de 297 conjuntos de sondas que representam 219 genes altamente discriminatórias (p 0,001). Este conjunto fornecido uma clara distinção entre tumores esporádicos EOCRC e tumores de pacientes MSS antigos (Figura 4). Uma descrição extensa destes genes é fornecida na Tabela S2. O único gene oncogênese CRC chave que foi altamente desregulamentado em EOCRC esporádica era catenin beta (

CTNNB1

). O elevado número de genes discriminatórias nos permitiu levar a cabo via análises para entender melhor carcinogênese EOCRC esporádica. Quarenta e nove vias foram significativamente enriquecidas para a expressão diferencial de genes em EOCRC esporádica em comparação com tumores de pacientes de idade MSS. A descrição completa dos mesmos é fornecida na Tabela S3. Entre eles, 20 estavam envolvidos na sinalização celular, 10 na inflamação e apoptose, 7 na adesão e /ou motilidade, 7 na biologia do desenvolvimento e 3 na proliferação celular (Figura 5). Várias vias que foram regulados positivamente em EOCRC esporádicos foram relacionados às principais vias de sinalização envolvidas no CRC, como a MAP quinase e PI3KCA /AKT ou estão relacionadas com fatores de crescimento (EGF, HGFR e PDGF) e angiogênese (VEGF). Duas das principais vias envolvidas na adesão e /ou regulação da motilidade (vias de sinalização de integrina e de sinalização de adesão célula-a-célula) foram regulados positivamente em EOCRC esporádica. Curiosamente, a maioria das vias relacionadas à inflamação e /ou apoptose que foram encontrados até regulamentada em EOCRC esporádica estão directa ou indirectamente ligadas à via TNF-R1 (via TNFR1, HIV-1Nef, FAS via de sinalização, TNF /stress relacionado sinalização) .

o mapa de calor mostra a expressão de 219 genes. Com base nos níveis de expressão, os genes foram agrupados em quatro grupos de genes altamente sobre-expressos (caixas de vermelho rodeado por uma borda preta) e um conjunto de genes underexpressed em tumores MSS (caixas azuis rodeado por uma borda preta) de pacientes jovens em comparação a tumores MSS de pacientes mais velhos. MSS: microssatélites Estável. MSI:. A instabilidade de microssatélites

análise Pathway agrupar as 49 vias mais significativamente enriquecido para a expressão do gene diferencial entre esporádicos tumores EOCRC e MSS de pacientes idosos. Pathways foram agrupadas em cinco categorias principais, a saber, a adesão celular /motilidade, inflamação /apoptose, proliferação celular, sinalização celular e biologia do desenvolvimento. A distribuição das principais vias canônicas entre as categorias é detalhado, bem como a sua ordem de classificação. Esta ordem de classificação é indicada pelo símbolo # seguido pelo número da linha (# 1 significa que esta via é a mais desregulamentado entre os 49 vias).

Beta catenin imunohistoquímica

A dados de microarranjos acima identificados beta catenina de ser o único gene chave oncogênese CRC desregulamentado em EOCRC esporádica. Por isso, procurou avaliar a ativação beta catenina utilizando imuno-histoquímica. Todos os casos de tumores MSS de pacientes jovens (39 casos) e 33 casos (33/36) de tumores MSS de pacientes idosos foram validados para a ativação beta catenina utilizando imuno-histoquímica. activação beta catenina foi identificada em 17 casos (44%) dos pacientes e 5 casos (15%) MSS-jovem de MSS de idade pacientes (p = 0,01) com uma coloração nuclear +/- citoplasmático (Figura 6).

A. Secção transversal de um tumor de um paciente MSS-Old mostra apenas coloração da membrana. de um tumor de um EOCRC esporádica B. Seção transversal (MSS-Young) paciente mostra forte coloração citoplasmática e nuclear, com uma perda de coloração da membrana, refletindo Wnt /beta ativação catenina.

Discussão

os resultados do presente estudo sugerem que esporádica EOCRC é uma entidade clínica e molecular distinta. Pela primeira vez, nós apresentamos uma análise integrada de ambos os extensos dados clínicos e genómica de uma série cuidadosamente selecionados de pacientes consecutivos que tinham sido tratados e acompanhados em uma única instituição. Esta abordagem translacional nos permitiu refinar a descrição antes limitada desta forma específica de CRC e derramou uma visão sobre sua biologia tumor específico.

No momento não há uma definição clara aceita de idade de início precoce no campo do CRC. Portanto, a maioria dos estudos que relatam sobre este tema incluem pacientes nos 40-50 anos de faixa etária [22], [23]. No entanto, existe um aumento progressivo na frequência de CRC entre 40 e 50 anos de idade, por isso, é provável que nestes estudos há uma mistura de entidade EOCRC específica e CRC início tardio. Para abordar esta questão foi utilizada uma definição mais restritiva de precoce e tardia CRC início: pacientes entre 45 e 60 anos de idade foram excluídos, a fim de garantir uma partição clara das duas entidades e evitar qualquer sobreposição dessas duas formas de CRC. Outro fator de confusão na análise dos EOCRC em muitos estudos é a falta de distinção entre as formas hereditárias de CRC, particularmente a síndrome de Lynch, e a verdadeira forma esporádica da CRC. No entanto, a síndrome de Lynch representa por si só um terço dos casos EOCRC [24]. Portanto, no presente estudo um pedigree completo foi estabelecida por um geneticista clínico para todos os pacientes jovens. casos de síndrome de Lynch foram identificados utilizando critérios robustos e foram claramente separados dos EOCRC esporádica. Apesar disso, neste estudo pacientes EOCRC esporádicos tiveram uma taxa elevada de história da família (38%). Uma minoria deles apresentou uma herança autossómica dominante de transmissão (8%), que provavelmente corresponde a uma doença hereditária para as quais ainda não foi identificado susceptibilidade genética (síndrome X). Por outro lado, é cada vez mais reconhecido que alguns loci menor predisposição poderia ser responsável por uma forma complexa de CRC hereditariedade [25]. Portanto, uma predisposição genética como também poderia ser envolvido em alguns pacientes com EOCRC. Esta hipótese é apoiada pela baixa taxa de adenoma síncrona observamos em pacientes EOCRC esporádicos que poderia refletir carcinogênese acelerada secundária a condições predisponentes.

Tem sido desde há muito reconhecido que as especificidades morfológicas das EOCRC são diferenciação celular pobres, colóide componente e linfocítica reacção estroma [22], [26] – [29]. Mais uma vez, estes dados são provavelmente confundidos pela inclusão de pacientes com síndrome de Lynch, que tipicamente estão associados a essas características histológicas. Nos dois únicos estudos que tenham especificamente analisados ​​MSS-pacientes jovens (um com 24 e outro com 55 casos), não houve associação entre a histologia mucinoso, pobre diferenciação, linfócitos infiltrantes de tumor e de início precoce da doença [30], [ ,,,0],31]. Nosso estudo confirmou estes dados e que, além disso, mostrar que a diferenciação celular pobre e um componente mucinoso estão claramente associados com o status MSI, independentemente da idade do paciente. Em contraste, não se observou uma associação entre invasão linfática, invasão perineural ou histologia celular anel de sinete com EOCRC esporádicos, como foi relatado nos dois estudos anteriores citados acima (dados não mostrados) [30], [31].

do ponto de vista clínico, os nossos resultados estão de acordo com a descrição clínica da EOCRC esporádica publicado recentemente por Chang et al .: EOCRCs esporádicos presentes como tumores com localização distal e doença metastática frequente [30]. No presente estudo, o surpreendentemente elevada taxa de doença metastática síncrona no grupo EOCRC (41%) nos levou para coincidir com pacientes antigos MSS para o estágio do tumor de modo a não polarização comparações de expressão de genes. Apesar de não ser estatisticamente significativa, pacientes jovens tendem a ter melhores taxas de sobrevivência de acordo com o estágio da doença em comparação com pacientes mais velhos. Naturalmente, os pacientes mais jovens são susceptíveis de sofrer uma terapia mais agressiva, incluindo quimioterapia ou ressecção cirúrgica repetida para a doença metastática que podem melhorar o prognóstico mais pobre dada para EOCRC. Embora parcialmente contraditória com estudos mais antigos, alguns dos quais foram análises globais com base em registos, o presente trabalho fornece resultados confiáveis ​​para os mesmos motivos citados acima [32] – [35]. No geral, EOCRC esporádica apresenta como uma doença agressiva com localização distal, estágio de alta tumor e nenhuma especificidade histológica clara.

O presente estudo é o primeiro a fornecer uma visão geral da frequência de um painel padrão de mutações genéticas, bem como alterações epigenética especificamente para EOCRC esporádica. Estabelecidos classificações carcinogênese colorretal, usando uma combinação de mutações KRAS e BRAF com CIMP e estado MSI, permitir a identificação de três a cinco subgrupos moleculares distintos de CRC [36], [37]. Por exemplo, KRAS e P53 mutações são classicamente associada a cancros CIN-colorretais enquanto mutações BRAF estão fortemente associados com formas esporádicas de CIMP + /MSI + CRC. Alguns estudos investigaram as taxas de mutação em casos esporádicos EOCRC e mostrou que 0-8% têm

BRAF

mutações, de 0 a 4%

PIK3CA

mutações, de 6 a 78%

KRAS

mutações, e 64%

TP53

mutações [30], [31], [37] – [40]. Identificamos uma taxa de

KRAS Comprar e

TP53

mutações (respectivamente 37% e 44%) como semelhante à de tumores CIN mas com uma ausência de

BRAF

mutações e nenhuma evidência de um fenótipo methylator [41]. As discrepâncias com os dados da literatura sobre as taxas de mutação em EOCRC pode estar ligada à ausência de uma clara distinção entre tumores MSS e MSI em estudos mais antigos que podem ter afetado as taxas de mutação, especialmente para

KRAS Comprar e

BRAF

[39], [40]. No geral, o nosso estudo genético favorece a hipótese de que EOCRC esporádica é um sub-grupo de tumores CIN com nem

BRAF

mutação nem methylator fenótipo.

O agrupamento obtido por análises sem supervisão mostraram que as diferenças no gene perfis de expressão (GEP) foram determinados principalmente pelo estado de MMR e, em menor medida, pelo estatuto CIMP, enquanto a idade teve pouco impacto. Estes resultados foram demonstrados previamente por estudos que mostram que os tumores MSI e MSS têm perfis de expressão diferencial, que valida os resultados atuais [42]. No entanto, embora PGEs foram altamente significativos em análises supervisionadas restritas aos tumores MSS, mostrando um conjunto de 219 genes que diferenciam jovens de pacientes idosos, os resultados das matrizes de expressão deve ser considerada com cautela, pois as listas de genes freqüentemente deixam de ser reproduzida. Em contraste, análises via têm provado ser reprodutível, e trazer significado biológico para genes de expressão de matrizes [43]. Numerosas vias classicamente envolvidas na oncogénese CRC foram regulados positivamente em EOCRC esporádica, tais como MAP-cinase, mTOR e VEGF /angiogénese, mas vias relacionadas com a sinalização do factor de crescimento também são envolvidos (EGF, receptor do HGF e PDGF). Também identificamos

CTNNB1

como um dos mais over-expressos genes em MSS-pacientes jovens em comparação com pacientes MSS-velhos e usados ​​imuno-histoquímica para demonstrar que isso leva a um excesso de ativação de beta catenina em EOCRC esporádica.