Abstract

podoplanina (PDPN), um tipo de mucina glicoproteína transmembrana específico para o sistema linfático é expressa em uma variedade de cancros humanos, e é considerado como um factor de promoção da progressão do tumor. O objetivo deste estudo foi o de elucidar o papel molecular de PDPN na biologia de células de câncer de tireóide. expressão PDPN foi avaliada em carcinomas primários e linhas celulares de carcinoma da tiróide por RT-qPCR, Western blot, SE e IHC. Para examinar o papel do podoplanina para determinar o potencial de malignidade de uma célula (a migração celular, invasão, a proliferação, a adesão, motilidade, apoptose), foi utilizada uma linha celular de cancro da tiróide com expressão PDPN silenciados. Observamos que PDPN foi apenas expressa nas células cancerosas de 40% de carcinoma de tireóide papilar tecidos (PTC). Além disso,

PDPN

mRNA e proteína foram altamente expressa em TPC1 PTC-derivado e linhas celulares BcPAP mas não foram detectados em linhas celulares derivadas de cancro da tiróide folicular.

PDPN

knock-down diminuiu significativamente invasão celular e migração celular modestamente reduzido, enquanto a proliferação e adesão não foram afetados. Nossos resultados demonstram que PDPN medeia as propriedades invasivas das células derivadas de carcinomas papilares, sugerindo que podoplanina pode promover a progressão PTC

Citation:. Rudzińska M, Gaweł D, Sikorska J, Karpinska KM, Kiedrowski M, Stępień T , et ai. (2014) O papel da podoplanina na Biologia da cânceres diferenciados da tiróide. PLoS ONE 9 (5): e96541. doi: 10.1371 /journal.pone.0096541

editor: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique fonctionnelle de Lyon, França |

Recebido: 24 Janeiro, 2014; Aceito: 09 de abril de 2014; Publicado em: 05 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Rudzińska et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela concessão 2012/07 /B /NZ5 /02.444 a partir do Centro Nacional de Ciência, Poland. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

carcinoma diferenciado da tireóide (DTC) é o tumor maligno mais comum do sistema endócrino humano. Papilífero (PTC) e folicular (FTC) carcinomas da tiróide são duas variantes principais DTC, com o primeiro representa o tipo mais comum (80% de todos os casos de DTC) [1]. A patogênese molecular de câncer de tireóide envolve várias vias de sinalização molecular preferencialmente alteradas em PTC e FTC. PTCs carregam mutações pontuais oncogênicos em

B-RAF

e

RAS

e rearranjos cromossômicos resultando em

RET

e

TrkA

genes quiméricos, os quais pode activar a via da proteína quinase activada por mitogénio (MAPK) [2]. Ativando

BRAF

ponto de mutação V600E aparece, em média, de 45%, enquanto que

RET /PTC

rearranjos e

RAS

mutações em 10-20% dos casos PTC [3] [4],. Em FTCs, além de

RAS

mutação, o

PAX8 /PPAR

rearranjo e desregulamentação do PI3K /ATK /PTEN (fosfatidilinositol-3-quinase /ATK /fosfatase e tensina homólogo excluída no cromossomo 10) cascata de sinalização são frequentemente detectadas, que estão associados com a progressão e desdiferenciação através da activação de PI3K e AKT e inactivação ou perda de

PTEN

expressão do gene supressor de [5], [6]. Embora PTC é considerada uma lesão indolente, com prognóstico favorável, o desenvolvimento de metástases linfonodais afeta até 50% dos pacientes PTC e no desenvolvimento de metástases distantes em alguns cancros diagnosticados reduz as taxas de sobrevivência [7], [8]. Uma característica comum a expansão do tumor é a disseminação de células cancerosas primárias, que pode ocorrer

via

um número de rotas. clínicopatológicos dados mostraram que os carcinomas papilares são propensos a metastizar para os nódulos linfáticos regionais, o que sugere que as células são espalhadas

através do sistema linfático [9], [10]. Os mecanismos moleculares e os fatores genéticos envolvidos na disseminação de células PTC, que determinam o potencial metastático de câncer de tireóide papilar, permanecem largamente desconhecidos.

A metástase das células cancerosas é um processo multi-passo e vários factores celulares expressos em Os tumores podem estar envolvidos. Vários estudos realçaram a importância de factores linfangiogênicas na progressão de tumores diferentes e um número de moléculas reguladoras que participam na linf angiogénese, foram identificados [11], [12], [13]. Uma das moléculas linfangiogênicas chave é podoplanina (PDPN). PDPN humano, também conhecido como T1α -2, PA2.26, gp38 ou aggrus, é um tipo I de 38 kDa do tipo mucina transmembranar sialoglicoprote�a composta de um domínio extracelular altamente O-glicosilada, uma única região transmembranar e uma curta citoplasmática cauda [14]. Em tecidos humanos normais, podoplanina é expresso em podócitos renais, músculo esquelético, o coração, placenta, pulmão, e em outros lugares [15], [16], [17]. PDPN é expresso nas células endoteliais linfáticas (LEC), mas não em células endoteliais de sangue (BEC), e representa, portanto, um marcador específico de endotélio linfático e linfangiogénese [11]. Apesar de a especificidade da sua expressão no endotélio linfático, PDPN também tem sido detectada em vários cancros [18], [19], [20]. A função biológica de PDPN ainda não foi completamente definida, mas os dados disponíveis sugerem fortemente que pode desempenhar um papel importante como mediador de invasão de células de tumor [21]. O mecanismo pormenorizada subjacente a propagação de células diferenciadas de tumores da tiróide e progressão do câncer, e especialmente a contribuição de moléculas pró-linfangiogênicas para este processo é mal compreendida. Assim, o objetivo deste estudo foi caracterizar a expressão ea função dos podoplanina em tumores da tireóide biologia. expressão PDPN foi examinada em tumores primários e num painel de linhas celulares de cancro da tiróide derivados de papilar (TPC1 e BcPAP) e folicular (FTC133 e CGTH-W-1) carcinomas da tiróide. Nós também investigou o papel da PDPN na regulação características do fenótipo de células malignas: a proliferação, adesão, taxa de sobrevivência, mobilidade, migração e invasão. Para determinar a função desta glicoproteína transmembranar no comportamento metastático de células de cancro papilar, foi realizada RT-qPCR, imunofluorescência e imuno-histoquímica, bem como análises Westernblot, e examinadas

PDPN

knock-down em células cultivadas . Os dados obtidos sugerem fortemente que PDPN pode ser considerado um fator pró-metastático que afeta a propagação da PTC.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

O estudo foi aprovado pelo Comissão de ética de Estudos Humanos no Centro de Pós-Graduação Educação médica. As amostras de tecido foram obtidos com a autorização dos respectivos Comitês de Ética (no Centro e Instituto de Oncologia Câncer, no Memorial Hospital Copernicus, e no Centro de Pós-Graduação Educação Médica). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes envolvidos neste estudo. Nenhuma indústria deu suporte para este estudo.

amostras de tecido da tireóide e linhas celulares

Para experiências de expressão genética, frescos tecidos congelados espécimes de carcinoma papilífero de tireóide (T) e tecido tireoidiano normal adjacente do contralateral lóbulo (NT) foram coletadas no Maria Skłodowska-Curie Memorial Cancer Center e Instituto de Oncologia, no Departamento de Cirurgia Geral e endocrinológica, Copernicus Memorial Hospital (Varsóvia e Lodz, Polônia). Para a análise imuno-histoquímica (IHQ), arquivado, tecidos embebidos em parafina fixadas em formalina (diferentes daqueles usados ​​em RT-qPCR) de pacientes que tinham sido submetidos a tireoidectomia total foram usados ​​

A série de 173 tecidos arquivados composta.: 112 carcinomas papilares (94 clássica PTC com papilar ou padrão de crescimento papilar-folicular misto e 18 folicular variants- carcinoma papilar FvPTC), 27 carcinomas foliculares (FTC), 24 adenomas foliculares (FA) e 10 tecidos tireoidianos normais (NT). As amostras de tecido foram obtidos com a autorização dos respectivos Comitês de Ética (no Centro e Instituto de Oncologia Câncer, no Memorial Hospital Copernicus, e no Centro de Pós-Graduação Educação Médica).

Para estudos funcionais que usamos tireóide linhas celulares de carcinoma papilar derivados (TPC1 e BcPAP) e folicular (FTC133 e CGTH-W-1) carcinomas da tiróide e SV40-imortalizado linhagem humana epitelial da tiróide Nthy-ori 3-1 (adiante designada para nós como NTHY) para representar normal da tireóide células. As linhas celulares foram obtidas a partir da Colecção Alemã de Microrganismos e Culturas de Células (BcPAP e CGTH-W-1), e a partir da Colecção Europeia de Culturas de Células (FTC 133 e Nthy-ori 3-1). A linha celular TPC1 [22] foi gentilmente cedido pelo Dr. M. Santoro (Universidade de Nápoles Federico II, Itália) [23]. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 completo suplementado com 10% (v /v) de FBS (Roche, Suíça), com a excepção de FTC133 células, as quais foram cultivadas em DMEM completo /F-12 suplementado com 10% de FBS (Vida Technologies, Invitrogen, EUA). Todas as células foram incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera.

isolamento do ARN e em tempo real (RT) -qPCR

O ARN total foi isolado a partir da tiróide humana espécimes e linhas de cancro da tiróide células usando um Kit de RNA Mini (a a biotecnologia, a Polónia), de acordo com o protocolo recomendado, bem como a integridade do RNA foi verificada por eletroforese em gel de agarose. O ARN total (1 ug) foi utilizada para a síntese de cDNA com uma elevada capacidade de ADNc de Transcrição Reversa Kit (Life Technologies, Applied Biosystems, EUA). Expressão do humano

PDPN

e

18S rRNA genes

foi quantificado por RT-qPCR utilizando o ADNc como molde nas reacções que contêm o corante específico de cadeia dupla de ADN-SYBR Green I e Maxima Fluoresceína RT -qPCR Mix master (Thermo Scientific, Canadá) e oligonucleótidos iniciadores específicos (listados abaixo), como descrito anteriormente [24].

PDPN

(NM_006474)

Encaminhar : 5′-CGAAGATGATGTGGTGACTC-3 ‘

Reverso: 5′-CGATGCGAATGCCTGTTAC-3′

18S rRNA

(NM_02255)

Forward: 5 ‘ ‘

Reverso: 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′ -CCAGTAAGTGCGGGGTCATAAG-3.

Amplification, aquisição de dados e análise de dados foram realizados utilizando o Sistema de Detecção de PCR IQ5 real-Time e software (Bio- Rad, EUA).

PDPN silenciando com pequena interferência RNA (siRNA)

células TPC1 foram transfectadas com siRNA (concentração final 30 nM) segmentação humana

PDPN

, (siPDPN forma Life Technologies, Ambion, EUA) e um controlo negativo universal siRNA (Sigma-Aldrich, EUA) utilizando Lipofectamina 2000 (Life Technologies, Invitrogen, EUA) em Opti-MEM (Roche, Suíça);, 5′-CGAAGACCGCUAUAAGUCUTT-3 ‘ , de acordo com os protocolos recomendados. A eficiência de

PDPN

inibição do gene foi avaliada 48 horas após a transfecção por RT-qPCR, Western blotting e imunofluorescência. A experiência foi repetida quatro vezes.

Western blotting

As células recolhidas foram lavadas duas vezes com gelada tamponada com fosfato salino (PBS) e ressuspensas em 1% de NP-40 tampão de lise (150 mM cloreto de sódio; 1,0% de NP-40; 0,5% de desoxicolato de sódio; SDS a 0,1%; Tris 50 mM, pH 8,0) suplementado com 1% de inibidor de protease e um inibidor de fosfatase cocktails% (Roche, Suíça). As proteínas nos lisados ​​celulares foram quantificadas e amostras de 30 ^ g foram resolvidos em 8% de gel SDS-PAGE e depois electro-transferidas para membranas de nitrocelulose (Bio-Rad, EUA). As membranas foram bloqueadas por incubação com leite magro a 5% em TBS (0,1% de Tween-20) durante 1 h à temperatura ambiente, em seguida, incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo monoclonal de ratinho anti-podoplanina primário (D2-40, diluída 1:1000; AbD Serotec, EUA). Após lavagem intensiva, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário de cabra anti-ratinho purificado por afinidade conjugado com HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, EUA). Os sinais de bandas reactivas foram visualizadas por detecção de quimioluminescência aumentada (SuperSignal

® Oeste Dura, Pierce Chemical, EUA) como previamente descrito [25]. Como um controlo de carga, as membranas foram incubadas com anticorpo monoclonal anti-actina β (diluído 1:5000; Sigma-Aldrich, EUA), de uma maneira idêntica

imunofluorescente coloração

Células cultivadas. em lamelas de vidro foram fixadas com metanol gelado, bloqueadas com soro de cabra a 2% /2% de BSA, e depois incubadas com o anticorpo primário anti-rato podoplanina D2-40 monoclonal (01:50; AbD Serotec, EUA). Após várias lavagens, as células foram incubadas com DyLight

TM549-conjugado anti-IgG de ratinho (Jackson ImmunoResearch Laboratories, EUA). As células foram contrastadas com o corante nuclear DAPI e visualizados com um microscópio de fluorescência (AxioObserver D1, Zeiss, Alemanha), utilizando uma lente de imersão em óleo de 100x.

imuno-histoquímica (IHQ)

análise de coloração imuno-histoquímica foi realizado em 4 mm de espessura de tecidos, da tiróide e embebidas em parafina fixadas com formalina arquivados: PTC (112 casos), FTC (27 casos), FA (24 casos), e NT (10 casos). As secções foram deparaffinised e recuperação de antigénio induzida por calor foi realizada em solução de recuperação de alvo (TRS, pH 9,0; DAKO, Dinamarca), aquecimento durante 20 minutos numa panela de pressão. As lâminas foram então incubadas com anticorpo anti-D2-40 podoplanina durante 1 h à temperatura ambiente. Após a lavagem, Envision + reagente de anticorpo foi aplicado (DAKO, Dinamarca). As reacções foram reveladas utilizando diaminobenzidina (DAB) como substrato cromogénico. As secções foram contrastadas com hematoxilina, montado e examinado sob um microscópio de luz. Os controlos negativos foram preparados seguindo o mesmo procedimento, mas omitindo-se a incubação com o anticorpo primário. IHC coloração foi avaliada por dois observadores independentes (MK e BC) e teve como “negativo” ou “positivo”, de acordo com a intensidade relativa de coloração PDPN. Os dados de imuno-histoquímica foram submetidos à análise estatística.

Ensaios

migração e invasão celular

A migração celular ea atividade invasão foram determinados utilizando um Boyden inserir câmara (8 mícrons tamanho dos poros, cultura celular BD Falcon ™ inserções, EUA) e BD BioCoat Matrigel Invasion Câmara 8 mícrons (BD Bioscience, EUA), respectivamente. As células foram colhidas e ressuspensas em meio isento de soro, depois contadas com um contador celular automático EVA (Nano ENTEK, Coreia). Um total de 2 × 105 células ressuspensas em meio RPMI 1640 (para ambos os ensaios de migração e invasão) foram adicionados às câmaras e incubou-se durante 24 h a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO2. meio RPMI suplementado com 10% de FBS foi usado como o quimioatractor. As células que tinham migrado ou invadem através da membrana foram fixadas e coradas utilizando um kit Diff-Quik (Medion Diagnostics, Suiça), visualizados em ampliação de 40x com um microscópio Olympus BX41 e contadas. Cada experimento foi realizado em triplicado e repetidas três vezes.

In vitro

cicatrização de feridas ensaio de motilidade

Os riscos de dimensões comparáveis ​​foram feitas em monocamadas de células confluentes (cultivada em 6- bem placas) usando um estéril 200 mL ponta da pipeta. As monocamadas foram então lavadas com PBS para remover as células destacadas e os resíduos celulares, e em seguida, novamente cheio com meio de crescimento e incubadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera. As placas foram observadas e fotografadas sob um microscópio de luz (10x, AxioObserver D1, Zeiss, e 20x Nikon Diaphot 300) a cada 3 horas para determinar a velocidade de encerramento de feridas. A largura das feridas em cada ponto de tempo foi medida em 5 campos independentes, utilizando o software ImageJ (www.rsbweb.nih.gov). A distância de migração de células foi determinado medindo a largura da ferida dividido por dois e subtraindo este valor da largura de meia-ferida inicial [26]. Distância foi quantificada como se segue: Com a lente de 10x, um pixel = 1,026 m; com a lente de 20x, 1pixel = 0,43 uM.

A viabilidade celular ensaio

Para avaliar a proliferação celular, o número de células viáveis ​​a 24 e 48 h após a transfecção com o siARN foi determinada utilizando um 2, 3-bis- (2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -2H-tetrazólio-5-carboxanilida (XTT) kit de proliferação de células de tetrazólio (EZ4U, Biomedica GmbH, Áustria). Resumidamente, os poços de placas de 96 poços foram semeadas com 8 × 10

3 células (5 repetições). Em seguida, 25 ul de reagente de mistura XTT foram adicionados a cada poço e a absorvância no comprimento de onda de teste (450 nm para medir a produção de formazano) e o comprimento de onda de referência (620 nm) foi medida a diferentes pontos de tempo, utilizando um leitor de microplacas Labsystems Multiscan RC (Thermo Fisher Scientific, EUA).

a apoptose ensaio

a apoptose foi avaliada utilizando um anexina V-FITC Apoptosis Detection Kit (Abcam, UK) seguindo o protocolo recomendado. Resumidamente, as células colhidas foram lavadas com PBS, incubadas com FITC-anexina V e iodeto de propidio, durante 5 min à temperatura ambiente e, em seguida, examinado por citometria de fluxo (FACSCantoII, BD Biosciences, EUA). O experimento foi realizado três vezes.

A análise dos dados

Todos os experimentos foram realizados pelo menos três vezes. Os dados são apresentados como a média ± SEM. A significância estatística foi determinada utilizando o teste não paramétrico de Mann-Whitney e teste t emparelhado (GraphPad, Prizm, EUA). A

valor P

de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. modelo de regressão logística multivariada foi utilizada para examinar a associação entre variáveis ​​independentes e podoplanina expressão tumoral.

Resultados

expressão

proteína PDPN e localização celular

A expressão de podoplanina foi avaliada em primeiro lugar em amostras de tecido de tumor da tireóide arquivados. A análise imuno-histoquímica foi realizada numa série de 173 tecidos embebidos em parafina (112 PTC, 27, FTC, 24 e 10 NT FA) utilizando um anti-anticorpo monoclonal podoplanina D2-40. No tecido normal, a coloração da tiróide PDPN estava ausente em células foliculares e anticorpo anti-PDPN marcados unicamente e fortemente apenas as células endoteliais linfáticas nos numerosos vasos linfáticos, que serviu como um bom controlo interno (Figura 1A; um). Todas as amostras de FTC e FA analisados ​​eram negativos para PDPN imunorreactividade (Fig 1A;. B, c). A maioria dos PTCs examinadas também foram negativos para a rotulagem PDPN (Fig 1A;. D). No entanto, 40% (45 de 112) dos PTCs mostrou imunomarcação positiva para podoplanina (Fig 1A;. E-l). Vários intensidade de etiquetagem PDPN (de moderada a forte) foi observada no citoplasma das células tumorais e na maioria dos casos, a coloração foi distribuído uniformemente em todo o cancro. Em contraste, as células dos tecidos peritumorais (considerados como “tecido da tiróide normal”) foram completamente PDPN negativo (ver figura 1A;. E, J, K, L). Nestes margens do tecido da tireóide normais livres de tumor, o anticorpo D2-40 rotulados exclusivamente e fortemente os vasos linfáticos de diferentes tamanhos e formas. A associação de expressão PDPN no tumor amostras de tecido com dados clínico-patológico foi avaliada pelo modelo de regressão logística multivariada e resumidos na tabela 1. expressão citoplasmática PDPN não foi estatisticamente diferente entre os pacientes com maior ou menor tamanho do tumor (PT) ou histológica (FvPTC

vs

clássico PTC) subtipo. Embora tenha havido um maior número de casos (9 tumores positivos entre 17 testadas) com expressão citoplasmática podoplanina induzida no grupo pT3 e a intensidade da coloração foi acentuado em todos os tumores positivos, o número de casos no grupo era demasiado pequeno para ser analisados ​​estatisticamente. No entanto, a expressão da proteína podoplanina foi significativamente correlacionado com a idade do paciente. Os pacientes mais velhos PTC (≥45) apresentaram maior frequência (69%

vs

31%) PDPN neoexpression queridos, em seguida, mais jovens ( 45), (odds ratio ajustada 4, 95% intervalo de confiança 1,76-9,2,

P

. 0,001)

A. detecção imuno-histoquímica de podoplanina foi realizada em secções de tecido embebidas em parafina. resultados de positividade representativos obtidos com anti-PDPN D2-40 anticorpo monoclonal. (A) coloração exclusiva e forte dos vasos linfáticos no tecido normal da tireóide; (B) adenoma folicular (FA) de tecido negativo para podoplanina; (C) carcinoma da tiróide folicular (FTC) de tecido negativo para podoplanina; (D) carcinoma papilífero de tireóide (PTC) caso negativo para podoplanina; (E-l) intensa coloração citoplasmática de PDPN em células PTC. Em E, J e I intensa coloração de PDPN em células tumorais, com o negativo margem peritumoral para podoplanina e forte coloração dos vasos linfáticos como um controlo positivo interno. ampliação original: 100x-um, um-encastrado -100x; b-200x, b-inserção -100x; C-200x; d-200x, 100x e-f-100x, 200x g-; H-200x, 100x-i, j-200x, 200x-K, l-400X. De 112 casos PTC, 45 (40%) mostraram expressão ectópica podoplanina nas células cancerosas. a expressão de ARNm PDPN Relativa B. em 21 PTCs (T) e tecidos normais emparelhadas (NT) analisados ​​por RT-qPCR. PDPN e 18S rRNA níveis de transcrição foram quantificadas e normalizadas podoplanina contra a do gene de manutenção (ARNr 18S). Os resultados são apresentados como a média ± SEM, **

P

. 0,001

A nossa análise foi ampliado por uma investigação da

PDPN

gene expressão em série de removido cirurgicamente PTC /NT emparelhado tecidos utilizando RT-qPCR. Em 14 dos 21 casos analisados ​​PTC /NT, um significativamente maior (

P Art 0,001) nível de

PDPN

transcrição foi detectada em amostras PTC comparados com os correspondentes tecidos normais da tireóide (Fig . 1B). Nos restantes 7 pares PTC /NT, o nível de

PDPN

mRNA nos tecidos PTC foi igual ou até menor do que em tecidos normais emparelhados.

Expressão e localização celular de PDPN em câncer de tiróide linhas celulares

Para investigar o papel funcional da podoplanina em biologia celular da tireóide examinamos uma linha de células normais da tireóide (NTHY), e um painel de papilar (TPC1 e BcPAP) e folicular (FTC133 e CGTH- W-1) tiróide derivados de linhas celulares. O nível de

PDPN

ARNm foi muito baixa em células imortalizadas NTHY (Fig. 2a). Nas células de carcinoma da tiróide, diferenças notáveis ​​na relação foram observados

PDPN

transcrição nível entre células originárias da PTC e FTC. células TPC1 e BcPAP exibiu o mais alto nível de

PDPN

expressão de mRNA entre todas as linhas de células de carcinoma da tiróide testados. Em contraste, o

PDPN

transcrito não foi detectada nas linhas celulares de carcinoma derivadas de FTC133 e CGTH-W-1 foliculares (Fig. 2A). Em média, o nível de

PDPN

ARNm nas linhas celulares PTC foi mais do que três vezes mais elevada do que nas células de controlo NTHY.

. a expressão de ARNm PDPN em linhas celulares de cancro da tiróide humana. RT-qPCR foi usada para avaliar os níveis de transcrição do podoplanina codificação no ARN total preparado a partir de células de controlo, NTHY TPC1 PTC-derivado e linhas celulares, e BcPAP FTC133 FTC-derivado e linhas celulares CGTH-W-1. Os dados de quatro experiências independentes realizadas em triplicado são expressos como a média ± SEM, **

P

0,001. B. podoplanina níveis de proteína em linhas celulares de cancro da tiróide humana. Os extractos de proteína (30 ug) foram submetidas a análise de mancha de Western com anti-PDPN D2-40 anticorpo monoclonal e o anticorpo β-actina como um controlo de carga. C. Análise de imunofluorescência da expressão podoplanina em TPC1, BcPAP, FTC133 e linhas celulares de cancro CGTH-W-1 da tiróide. PDPN foi visualizado por coloração com anti-anticorpo monoclonal D2-40 PDPN seguido pelo anticorpo secundário conjugado com DyLight549 (vermelho), e os núcleos foram contrastadas com DAPI (azul). Ampliação 1000x.

expressão da proteína podoplanina e localização celular em linhas celulares de cancro da tiróide

Para corroborar os resultados RT-qPCR, realizamos Western blot e imunofluorescência análises para avaliar a expressão da proteína PDPN e determinar a sua localização celular em linhas celulares de cancro da tiróide. Os níveis de proteína podoplanina estimados por immunoblotting foram totalmente consistentes com os resultados de RT-qPCR. PDPN proteína foi fortemente induzida em linhas celulares e TPC1 BcPAP, mas não foi detectada em células originárias FTC-(Fig. 2B). Análise por imunofluorescência confirmou os altos níveis de PDPN em células TPC1 e BcPAP. A proteína foi localizada principalmente nas membranas celulares e no compartimento citoplasmático de linhas celulares originárias PTC (Fig. 2C). Os FTC133 e CGTH-W-1 linhas foram negativos para PDPN imunocoloração, novamente validar os dados RT-qPCR.

Efeito do PDPN no fenótipo de células malignas

À luz da sua pro-invasiva propriedades relatadas em outros tipos de tumores humanos bem como os elevados níveis detectados em amostras PTC, nós investigamos se próximo PDPN está envolvido na migração e invasão de células de tumor da tiróide. células TPC1 foram transfectadas com siRNA segmentação

PDPN

(TPC1 /siPDPN) e com um controle universal siRNA negativo (TPC1 /siNEG). Qualquer posterior down-regulação da podoplanina foi avaliada utilizando RT-qPCR, métodos blotting e imunofluorescência ocidentais. Apenas -15% do inicial

PDPN

transcrição nível foi detectada em células TPC1 /siPDPN 48 h após a transfecção, o que confirma que o siRNA específico produzido silenciamento eficaz de

PDPN

(Fig. 3A). blotting e imunofluorescência ocidentais demonstraram a knock-down da expressão do gene podoplanina nestas células. Como mostrado na Fig. 3B e 3C, a proteína PDPN foi detectado apenas em TPC1 células transfectadas com o ARNsi de controlo negativo. A proliferação celular, adesão e sobrevivência foram então avaliados para as células TPC1 transfectadas com o

PDPN

espec�icos e controle siRNAs. Nenhum aumento na taxa de proliferação de células com silenciadas

PDPN

foi encontrado em comparação com as células de controlo (Fig. 3D, painel esquerdo). Nós também não observaram diferenças nas propriedades de adesão de

PDPN

-silenced e controle células (Fig.3E). Além disso, não houve diferença no número de viáveis ​​( 90%) as células, apoptóticas e necróticas entre células TPC1 tratadas com siRNA específicos e não-específicos (Fig. 3D, painel da direita), sugerindo que a expressão de PDPN não faz aumentar a susceptibilidade destas células à apoptose.

a. análise de RT-qPCR dos níveis de mRNA PDPN em TPC1 células cancerosas da tireóide 48 h após a transfecção com 30 nM siRNA específico para PDPN (siPDPN) ou um controlo negativo siRNA (siNEG). Os resultados foram normalizados para o nível de rRNA 18S e barras representam a alteração média na dobra PDPN transcrição abundância em células transfectadas com siPDPN em comparação com células transfectadas com siNEG. Os resultados são representativos de quatro experiências independentes. Os dados são apresentados como a média ± SEM, **

P Art 0,001. análise de mancha B. ocidental de proteínas podoplanina e p-actina em TPC1 células antes (0 h) e 48 h após a transfecção com siPDPN e controlar siNEG. C. coloração por imunofluorescência da proteína podoplanina em células transfectadas com TPC1 siPDPN e controlar siNEG. As células foram coradas com anti-PDPN D2-40 anticorpo monoclonal seguido por anticorpo secundário DyLight549 conjugada (vermelho), e contrastadas com DAPI (azul). 1000x de ampliação. D. Efeito da PDPN sobre a viabilidade celular. D, painel esquerdo. A proliferação foi medida a 24 e 48 h após a transfecção de células com TPC1 siPDPN ou controlar siNEG. As células cultivadas em placas de 96 poços foram tratadas com reagente XTT mistura e formação de formazano foi medida a 450 nm para determinar o número de células viáveis. Os dados são expressos como a média ± SEM de pelo menos três experiências independentes realizadas em quintuplicado. D, painel direito. A apoptose foi medida às 48 h após transfecção de células com TPC1 siPDPN ou controlar siNEG. As células foram recolhidas e coradas com FITC anexina V e iodeto de propídio, seguido por citometria de fluxo. As medições representativas da percentagem de anexina V + células são apresentados. Cada barra representa a média ± SEM de pelo menos três experiências independentes efectuadas em quadruplicado. E. Função de podoplanina na adesão celular. TPC1 células transfectadas com visor siPDPN capacidade de adesão comparáveis ​​às de células transfectadas siNEG. Resumidamente, 8000 células transfectadas foram semeadas em poços de placas de 96 poços. Após incubação durante 24 ou 48 h, as monocamadas de células foram lavadas, fixadas com 4% de formaldeído durante 15 minutos e coradas com violeta de cristal (Merck, EUA). As células coradas foram lisadas por tratamento com SDS a 2%, em seguida, a intensidade da mancha libertada foi quantificada por espectrofotometria a 550 nm utilizando um leitor de microplacas Labsystems Multiscan RC (Thermo Fisher Scientific, Canadá). Os dados representam três experiências separadas.

Migração e invasão

Para analisar como reduzida expressão PDPN afeta o potencial migrative de células TPC1, foi realizada uma

in vitro

zero ferida ensaio de cura com células transfectadas com siPDPN ou com controle siNEG. Um zero foi feita em monocamadas de células semeadas e quaisquer diferenças na cicatrização de feridas foram monitorados. Em três experiências independentes, a cura por aumento da motilidade celular foi encontrada para ser mais rápida do que para as células de controlo para o

PDPN

-silenced células (Fig. 4A). A mobilidade das células transfectadas foi, em seguida, avaliada utilizando um ensaio de migração de câmara. Como esperado, a migração de células com reduzido

PDPN

foi claramente alterada (Fig. 4B, painel esquerdo), sendo, em média, 2 vezes mais baixa do que a de células de controlo. Então, foi investigado o efeito de

PDPN

knock-down no potencial invasivo das células, utilizando o ensaio de invasão de Matrigel. Silenciamento do

PDPN

gene prejudicada profundamente a capacidade invasiva de células TPC1 (Fig. 4B, painel da direita). Em cada realizada replicar experimental, observou-se uma redução consistente e forte na invasão do

PDPN

células -silenced, em comparação com os controlos ou as células TPC1 parentais (dados não mostrados).

UMA. ferida zero ensaio de cura. imagens de luz do microscópio representativa mostrando cicatrização de feridas em monocamadas de células TPC1 transfectadas com siPDPN ou controlam siNEG, a 0 e 24% de FBS como um quimioatractor e após 24 h, as células que tinham migrado através da membrana de tamanho de poro de 8 um foram coradas e fotografou a ampliação de 40x. A proporção de células que migram são apresentadas em forma de gráfico. Os dados são apresentados como a média ± SEM de pelo menos três experiências separadas, **

P

0,001. B, painel da direita. A capacidade de invasão de células transfectadas com TPC1 siPDPN ou controlo siNEG foi analisada por adição de células para um BD BioCoat Matrigel Invasão Secção 8 mícrons. O reservatório inferior foi preenchida com 10% de FBS como um quimioatractor e após 24 h, as células que se tinham movido através do Matrigel à superfície inferior da membrana foram fixadas, coradas e fotografado na ampliação de 40x. A proporção de células invasivas é apresentada na forma de gráfico. Os dados são apresentados como a média ± SEM de pelo menos três experiências separadas, ***

P

. 0,0001

Tomados em conjunto, estes dados demonstram que podoplanina actua como um proinvasive