Abstract
A gestão do câncer de próstata hormônio-refratário representa um grande desafio no tratamento deste tumor, e identificação de antagonistas do receptor de androgénio Novel é necessário para tornar o tratamento mais eficaz. Analisou-se a actividade de dois antagonistas do receptor de andrógeno novos, (
S
) -11 e (
R
) -9, em
in vitro
e
in vivo
modelos experimentais de cancro da próstata hormono-sensível ou resistente à castração (CRPC).
In vitro
experimentos foram realizados em LNCaP, LNCaP-AR, LNCaP-Rbic e células cancerosas humanas da próstata VCaP. A actividade citotóxica foi avaliada por SRB e absorção de BrdU, AR transactivação por ensaio de repórter de luciferase e de PSA níveis por ensaios Tempo real de RT-PCR e ELISA. marcadores relacionados com a progressão do ciclo celular foi avaliado por Western blot.
In vivo
experiências foram realizadas em ratinhos SCID xenoenxertados com células com diferentes sensibilidades ao tratamento hormonal. Em células LNCaP e LNCaP sensíveis-AR-hormonais, o último expressando níveis de receptores de androgénio elevados, (
R
) -9 e (
S
) -11 exibiu um efeito citotóxico mais elevada comparada com a do composto de referência ((
R
) -bicalutamide), também na presença de androgénio sintético R1881. Além disso, o efeito citotóxico produzido por (
R
) -9 foi maior do que a de (
S
) -11 das duas células LNCaP-AR e VCaP hormona-resistente. Observou-se uma redução significativa nos níveis de PSA após a exposição a ambas as moléculas. Além disso, (
S
) e -11 (
R
) -9 síntese de ADN inibida bloqueando o aumento induzido por androgénio nos níveis de proteína ciclina D1.
In vivo
estudos sobre o perfil toxicológico dos (
R
) -9 não revelou a presença de eventos adversos. Além disso, (
R
) -9 inibiu o crescimento tumoral em vários
In vivo
modelos, xenotransplantes especialmente LNCaP-Rbic, representante da doença recorrente. Nossos
in vitro
resultados destacam a atividade antitumoral das duas novas moléculas (
R
) -9 e (
S
) -11, tornando-os uma opção potencialmente atrativa para o tratamento da CRPC
Citation:. Tesei a, Leonetti C, Di Donato M, Gabucci E, Porru M, Varchi G, et al. (2013) Efeito de pequenas moléculas de modulação do receptor do andrógeno (SARM) no câncer de próstata humano Models. PLoS ONE 8 (5): e62657. doi: 10.1371 /journal.pone.0062657
editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Itália |
Recebido: 12 de dezembro de 2012; Aceito: 25 de março de 2013; Publicado em: 08 de maio de 2013
Direitos de autor: © 2013 Tesei et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Gabriella Castoria e Marzia Di Donato recebeu fundos da Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC-IG11520) e Ministero Italiano per la Ricerca Scientifica (PRIN 2010NFEB9L_002). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e ter o seguinte conflito a declarar para Anna Tesei , Greta Varchi e Andrea Guerrini. Drs. Anna Tesei, Greta Varchi e Andrea Guerrini são inventores no pedido de patente (# WO /2010/092546), que é baseado nos achados descritos neste estudo. Existem atualmente não há produtos em desenvolvimento ou comercializado a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
O câncer de próstata é o segundo câncer mais freqüentemente diagnosticado e a sexta maior causa de morte por câncer entre os homens em todo o mundo [1]. Nos países desenvolvidos, incluindo a Itália, é a neoplasia maligna mais comum em homens e perdendo apenas para o câncer de pulmão em termos de mortalidade por câncer [2], [3]. A cirurgia, radioterapia e /ou privação de androgénio são as terapias clínicas mais eficaz nas primeiras fases da doença. Em particular, a terapia hormonal leva à remissão, que dura tipicamente de 2 a 3 anos. No entanto, o câncer de próstata frequentemente metástase para os ossos e quase sempre progride para um estado independente de androgénios, com um prognóstico pobre e uma sobrevida média variando de 10 a 20 meses [4]. Até à data, a maior parte da investigação sobre o cancro da próstata tem sido orientada no sentido andrógenos, concentrando-se principalmente sobre as formas de diminuir andrógenos circulantes e de inibição do receptor de andrógeno (AR) funcionalidade.
Antiandrogens, classificados como compostos esteróides ou não-esteróides , inibir a actividade de androgénio ao bloquear competitivamente a interacção entre a testosterona e /ou di-hidrotestosterona (DHT) e AR. antiandrogénios esteróides, entre os quais o acetato de ciproterona é o mais representativo, ter sido recentemente objecto de muita discussão por causa de seus efeitos colaterais, similar às que foram induzidas por terapia de castração [5]. Existe também a preocupação sobre a sua aparente hepatotoxicidade do uso a longo prazo e complicações tromboembólicas causado pelo seu potencial de ação progestogenica [6].
antiandrogénios não esteróides, como a bicalutamida (Casodex®), flutamida (Eulexin®) e nilutamida (Nilandron®) parecem ser melhor tolerada do que seus análogos esteróides e são actualmente os únicos meios disponíveis de evitar a castração no tratamento endócrino de câncer de próstata [5]. Esses compostos são frequentemente referidos como “anti-androgénios puros”, porque eles ligam-se exclusivamente à AR. Bicalutamida é o melhor tolerados destas drogas, [7] – [9], mas, como os outros dois, que actua como um agonista quando as mutações AR ocorrer (W741C e H874Y) e /ou nos casos de AR sobre-expressão, como ocorre em hormona cancro da próstata refractário. Agora existe um consenso geral sobre o papel fundamental da AR na etiologia e progressão do câncer de próstata (PC), mesmo quando ele evolui de a doença resistente à castração (CRPC) sensível andrógeno-. Isto é apoiado por evidência que Ar expressão é preservada na maioria dos espécimes de cancro da próstata, independentemente da fase e grau, e pelo facto de apenas uma pequena proporção de pacientes CRCP detectar a perda de expressão do AR, presumivelmente através promotor AR metilação [10]. Além disso, os estudos sobre amostras de tumor de pacientes com CRPC revelaram vários mecanismos utilizados pelas células de tumor para reactivar sinalização AR,
por exemplo
amplificação AR ou mutação, as alterações na expressão de enzimas envolvidas na esteroidogénese, e a produção de androgénio intracrine [11 ] – [25]. Apesar do benefício clínico de ambas as terapias hormonais de primeira e segunda linha, o anti-androgénios mais utilizados, incluindo bicalutamida, têm baixa afinidade AR [26]. Estas descobertas levaram à busca de novas moléculas com maior AR-afinidade, a fim de aumentar a eficácia clínica.
O presente estudo pré-clínico teve como objetivo investigar a actividade e mecanismos de acção de novas pequenas moléculas orgânicas capazes de funcionar como antagonistas do receptor de androgénio em células LNCaP, que abrigam uma mutação no codão 877 do domínio de ligação ao ligando de AR [27], e em diferentes linhas de células representativas de condições CRPC.
Materiais e Métodos
drogas e Substâncias Químicas
Pure (
R
) -bicalutamide (o enantiómero activo do antiandrogénio não esteróide, Casodex®) e compostos (
S
) -11 e (
R
) -9 foram diretamente sintetizados por processos altamente diastereosselectivos (pedido de patente n. WO2010 /116342A2 e não. WO2010 /092546A1 [28]), a partir de (D) -málico, (D) e -phenylglicine (D) -fenilalanina, respectivamente. (
S
) e -11 (
R
) -9 foram dissolvidos em acetona e etanol (10 mM), respectivamente, ao passo que o metiltrienolona androgénio sintético R1881 (Chemos-GmbH, Regenstauf, Alemanha ) foi solubilizado em DMSO (35,2 mM) e armazenado a -20 ° C até à sua utilização. Casodex® foi adquirido de Sigma-Aldrich (Milão, Itália).
Constructos
ADNc que codifica para a de tipo selvagem foi hAR em pSG5 [29]. A construção 3416, contendo quatro cópias do tipo selvagem slp-HRE2 (59 TGGTCAgccAGTTCT-39), foi clonado no sítio NheI em pTKTATA-Luc [30].
linhas celulares e Cultura
as linhas celulares derivadas de cancro da próstata humano LNCaP e VCaP foram obtidas a partir da American Tissue Culture Collection (Rockville, MD, EUA). A linhagem celular LNCaP-AR, derivado de LNCaP e engenharia para expressar de forma estável níveis elevados de AR, foi gentilmente cedido pelo Dr. Charles L. Sawyers (Howard Hughes Medical Institute investigador no Memorial Sloan Kettering Cancer Center, em Nova York, E.U.A.). O (
R)
subclone -bicalutamide resistentes de células LNCaP (LNCaP-Rbic) foi isolado em nosso laboratório através da cultura de linha celular parental LNCaP durante 50 semanas com 20 mM de (
R
) – bicalutamida.
VCaP células foram mantidas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (Mascia Brunelli SpA, Milão, Itália). células LNCaP e LNCaP-AR foram mantidas em meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS) e 1% de glutamina (Mascia Brunelli S.p.A., Milão, Itália). células LNCaP-Rbic foram mantidos da mesma forma suplementado com (
R
) -bicalutamide. A menos que indicado de outra forma, as células foram utilizadas na fase de crescimento exponencial em todas as experiências. As células COS 7 foram crescidas em DME suplementado com vermelho de fenol, 5% de soro fetal de vitelo (FCS), insulina (6 ng /ml), L-glutamina (2 mM), penicilina (100 U /ml), estreptomicina (100 U /ml) e hidrocortisona (3,75 ng /ml). As células foram tornadas quiescentes utilizando fenol-vermelho livre de DMEM e soro de vitelo tratado com carvão dextrano. Todos estes procedimentos foram descritos anteriormente [31] – [33].
transfecção, translocação nuclear e transativação Ensaio
Para a análise AR translocação (Fig. S5), COS-7 células a 70 % de confluência foram transfectados com 1 ug de plasmídeo purificado utilizando o reagente Superfect (Qiagen, Hilden, Alemanha). As células foram então tornadas quiescentes e deixado não estimuladas ou estimuladas com 10 nM de R1881 durante 60 min na ausência ou na presença dos compostos estudados. Para o ensaio de transactivação (Fig. S4), as células COS-7 foram plaqueadas a 70% de confluência em fenol-vermelho livre de DME contendo soro despojado-carvão a 5%. Após 48 horas, as células foram transfectadas por Superfect com 0,8 ug de 3416-pTK-TATA-Luc, isoladamente ou com 0,2 ug de plasmídeo pSG5-Har-expressam. Após 18 horas, as células transfectadas foram estimuladas com 10 nM R1881 (dissolvido em 0,001% de etanol, concentração final) durante 24 horas na ausência ou presença dos compostos indicados. As células de controlo foram tratados apenas com o veículo. Os lisados celulares foram preparados e a actividade de luciferase foi medida utilizando um sistema de ensaio de luciferase (Promega). Os resultados foram corrigidos usando a atividade CH110-expressou-galactosidase.
AR ligando de ligação de Estudos de deslocamento em células LNCaP
células LNCaP foram mantidas conforme relatado anteriormente [32] e fez repouso utilizando fenol livre de vermelho soro médio e dextrano despojado carvão [32]. As células a 70% de confluência foram incubadas por adição de 10 nM de [3H] R1881 (98 Ci /mmol; Perkin Elmer) ao meio na ausência ou na presença do excesso indicada de compostos de rádio-inerte. Após uma incubação de 4 horas a 37 ° C, as células foram lavadas três vezes com PBS arrefecido em gelo e recolhido por raspagem suave na câmara fria usando 600 ul de PBS gelado contendo 0,05% de EDTA (w /v). O número de células em uma aliquota de 100 uL foi contado. Uma alíquota (200 ul) da suspensão de células foi apresentado em duplicado para a extracção de radioactividade intracelular usando 500 ul de etanol gelado (100%) durante 1 hora [33]. Após 24 horas a 37 ° C, a radioactividade foi contada num contador de cintilação líquida. A ligação não específica de [3H] R1881 foi determinada em poços separados, adicionando o excesso de R1881 não marcado indicada de ao meio de incubação.
Ensaio in vitro Chemosensitivity
Sulforodamina B foi utilizado (SRB) de ensaio de acordo com o método por Skehan et al. [34]. Resumidamente, as células foram recolhidas por tripsinização, contadas e colocadas em placas a uma densidade de 5000 células /poço em placas de 96 poços de microtitulação de fundo plano (100 ul de suspensão de células /poço). As experiências foram executadas em octuplicate e cada experiência foi repetida três vezes. A densidade óptica das células foi determinada a um comprimento de onda de 490 nm por um leitor de placas colorimétrico. As curvas de resposta de dose foram criados por software Excel e 50% da concentração inibidora (IC
50) Os valores foram determinados graficamente a partir das parcelas.
quantitativa PCR em tempo real
O ARN celular total foi isolado utilizando RNeasy Minikit (Qiagen). Um micrograma de ARN foi transcrito de forma inversa em ADNc utilizando iScript (BioRad, Hercules, CA) de acordo com as instruções do fabricante. PCR em tempo real foi realizado utilizando o sistema de cor única MyiQ Real-Time PCR Detection (BioRad) e corante SYBR Green I química. O gene β2-microglobulina endógena expressa de forma estável foi amplificado como um controle de qualidade e quantidade de RNA de entrada. Primers para GAPDH amplificação mRNA, frente 5′-CGCTACTCTCTCTTTCTGGC-3 ‘, reverso 5′-AGACACATAGCAATTCAGAAT-3’; HPRT frente 5’AGACTTTGCTTTCCTTGGTCAGG -3 ‘, reverso 5′- GTCTGGCTTATATCCAACATTCG -3’; PSA frente 5’GCAGCATTGAACCAGAGGAG -3 ‘, reverso 5′- CCATGACGTGATACCTTGA -3’) foram projetados usando Beacon Software Designer (Versão 7.2, BioRad). PCR em tempo real foi realizada em reacções em triplicado com um volume final de 25 ml, contendo 50 ng de molde de ADNc, SYBR verde mistura, e 200 nM de iniciadores directo e reverso. As amostras foram mantidas a 95 ° C durante 10 minutos e 30 segundos, seguido de 40 ciclos de amplificação a 95 ° C durante 15 segundos, e em seguida a 60 ° C durante 30 segundos para GAPDH, HPRT e PSA. especificidade do produto foi controlada por análise de ponto de fusão. a eficiência de amplificação, que nunca variada por 5% em diferentes experiências, foi utilizada para determinar a expressão relativa de ARNm obtido utilizando Gene Expression Macro Software (Versão 1.1) (BioRad). A quantidade de ARNm foi normalizada para os genes GAPDH e de referência endógenos HPRT, e expressa como o n-vezes níveis relativos a amostras não tratadas.
reacções de RT-PCR em tempo real foram efectuadas em triplicado e o coeficiente de variação ( CV), calculado a partir dos três valores de Ct, foi sempre 1,5%. A reprodutibilidade da expressão de ARNm relativa foi calculada a partir dos resultados de duas experiências nas quais o procedimento foi realizado em diferentes produtos retrotranscrição derivados da mesma amostra de mRNA. CV foi sempre. 10%
determinação dos níveis de PSA
kit Um ELISA PSA fornecido pela Abnova (Taiwan Corporation, Taiwan) foi utilizada de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de PSA foi medida por espectrofotometria a 450 nm em meio de cultura.
BrdU incorporação
Depois de
in vivo
rotulagem com 100? M BrdU (Sigma), células quiescentes em lamelas foram fixadas e permeabilizadas. incorporação de BrdU foi analisada por imunofluorescência usando diluído (1:50 em PBS) monoclonal de ratinho anti-BrdU anticorpo (clone BU-1, a partir de GE Healthcare), como relatado anteriormente [35]. foi detectada utilizando anticorpo de ratinho diluído (1:200 em PBS) de anticorpos de cabra anti-ratinho conjugado com vermelho Texas (Jackson Laboratories).
Análise por imunofluorescência
células em lamelas foram fixadas e permeabilizadas [36 ]. De tipo selvagem hAR ectopicamente expressa em células COS-7 foi visualizado [37] utilizando o anticorpo policlonal de coelho anti-C19 (Santa Cruz). O anticorpo primário foi detectado utilizando (1:100 em PBS) de anticorpos diluídos vermelho do Texas-conjugado de cabra anti-coelho (Jackson Laboratories). Lamelas foram finalmente coradas com Hoechst 33258, invertido e montado em Mowiol (Calbiochem). Os campos foram analisados com um DMBL Leica (Leica Microsystems S.r.l., Milão, Itália) microscópio de fluorescência, utilizando uma objectiva de óleo HCXPL Apo 63 ×. As imagens foram capturadas com a câmera DC480 (Leica) e adquiriu usando FW4000 software (Leica), como descrito [36], [37].
Lisados e Análise Western Blot
Os lisados celulares (a 2 mg /ml de concentração de proteína) foram preparados como anteriormente descrito [32]. A ciclina D1, CDK4 e p27 foram detectadas utilizando os anticorpos apropriados [38]. AR foi detectado, utilizando os anticorpos anti-AR policlonais de coelho (C-19; Santa Cruz), como relatado [36] proteínas imuno-reactivas foram revelados utilizando o sistema de detecção ECL (da GE Healthcare)
In vivo
Experimentos
de cinco a seis semanas de idade do sexo masculino SCID CB-17 ratos /IcrHanHsd-Prkdcscid foram adquiridos de Harlan Laboratories (Correzzana, Itália). ratinhos nus idade CD-1 machos de seis a oito semanas (nu /nu) foram adquiridos a Charles River Laboratories (Calco, Itália). Todas as experiências com animais foram realizados no Biotério (Safu) de Regina Elena National Cancer Institute em Roma, Itália. No momento em que foram realizados os experimentos, não houve Comitê de Ética ativa de Pesquisa Animal da Regina Elena National Cancer Institute. No entanto, o Biotério do Instituto tinha recebido autorização total para realizar experimentos in vivo a partir do Ministério da Saúde italiano, que também aprovou o presente estudo. Todos os procedimentos que envolvem animais e seus cuidados foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, que estão em conformidade com a legislação nacional (DL nº 116, GU, Suppl 40, fevereiro 213 18, de 1992;. Circolare No. 8, GU, Julho de 1994) e as leis internacionais (Directiva 86/609 CEE, JO L 358. 1, 12 de dezembro de 1987; Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório, United States National Research Council, 1996). Os animais foram sacrificados por razões éticas por deslocamento cervical quando os tumores atingiram uma média de 3,0 g de peso ou quando se tornou moribunda durante o período de observação.
Para (
R
) -9 testes toxicológicos , ratos saudáveis foram tratados por via oral por sonda esofágica diariamente com 10, 25, 50 e 100 mg /kg de (
R
) -bicalutamide ou (
R
) -9, durante 28 dias consecutivos. Para as experiências de actividades anti-tumor, os ratinhos foram injectados subcutaneamente no flanco com VCaP, LNCaP e células de cancro de próstata LNCaP-RBic em 10
6 células /murganho em 100 uL de solução composta de 50% de Matrigel e meio isento de soro a 50%. Após aproximadamente 1 mês (quando uma massa de tumor de 5-150 mg foi evidente) os ratinhos foram distribuídos aleatoriamente, divididos em grupos e o tratamento foi iniciado. Os ratinhos foram tratados oralmente por sonda esofágica diário para.
4 semanas consecutivas com (
R
) -bicalutamide, (
R
) -9 Casodex® ou a 10 mg /kg . Os compostos foram dissolvidos em 80% de PEG-400 e 20% de Tween-80. Os ratinhos de controlo foram tratados com o veículo durante o mesmo período de tratamento. Foram testados cinco ratos para cada grupo. O tamanho do tumor foi medida três vezes por semana em duas dimensões por um compasso de calibre e tumor de peso foi calculada usando a seguinte fórmula: a b ×
2/2, em que a e b são o diâmetro de longo e curto do tumor, respectivamente.
antitumoral eficácia dos tratamentos foi avaliada pelos seguintes pontos finais:% TWI, a percentagem de inibição peso do tumor; (B) atraso do crescimento tumoral, avaliada como T-C, em que T e C são os tempos médios para os tumores tratados e de controlo, respectivamente, para atingir o tamanho equivalente (
i.e. 1000 mg.); c) a estabilização, regressão ou resposta completa evidenciado pela palpação.
Ética Declaração
Todos os procedimentos que envolvem animais e seus cuidados foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, que estão em conformidade com a legislação nacional (DL n . 116, GU, Suppl 40, 213 18 de fevereiro de 1992;. Circolare No. 8, GU, Julho de 1994) e as leis internacionais (CEE Directiva 86/609, JO L 358. 1, 12 de dezembro de 1987; Guia para Cuidado e Uso de Animais de laboratório, United States National Research Council, 1996).
análise estatística
Para a análise do ensaio de proteína PSA, as diferenças entre os valores observados após os vários tratamentos foram analisados usando teste t de Student para observações desemparelhados
a
P
valor. 0,05 foi considerado significativo. Para a análise das experiências de PCR quantitativa em tempo real, ANOVA de uma via com o pós-teste de Dunnett foi realizada utilizando o GraphPad Prism Versão 4.00 para Windows (GraphPad Software, San Diego, Califórnia, EUA). Dados obtidos a partir de incorporação de BrdU, ARE-luc ensaios de gene repórter e translocação nuclear foram analisados por emparelhado
t-teste
. A
P
valor 0,05 foi considerado significativo. Para
in vivo
experimentos, o teste t de Student (não emparelhado, bicaudal) foi utilizado para comparar valores médios (Software Primer de Bioestatística, McGraw-Hill, New York, NY, EUA). As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando
P
. 0,05
Resultados
Estrutura Composto
O nosso trabalho centrou-se na identificação de potenciais compostos de chumbo de um nova classe de moduladores selectivos de receptor de androgénio (SARMs), sintetizados por uma inovadora metodologia e altamente diastereosselectiva, para posterior desenvolvimento pré-clínico e clínico. As actividades antagonistas e agonistas de cerca de 30 não esteróide diferente, ligandos sintéticos AR através de um estudo da relação estrutura-actividade foram já descritos [28]. Em particular, avaliou o
in vitro
atividade antitumoral de duas novas moléculas propanamida bicalutamida-like, (
S
) -11 e (
R
) -9, ( Fig. 1A). As suas estruturas químicas que diferem das de bicalutamida na presença de um átomo de azoto em vez do grupo hidroxilo no átomo de carbono central, e em que o substituinte no estereocentro quiral,
por exemplo
. um grupo benzilo e um grupo fenilo, respectivamente. Além disso, (
S
) -11 é caracterizada pela presença de uma porção de hidantoina, o que influencia ainda mais o seu impedimento estérico.
(A), a estrutura química e do peso molecular (MW) de (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11 e (
R
) -9. (B) ligando AR obrigatório análise de deslocamento em células LNCaP. As células quiescentes LNCaP foram incubadas com 10 nM de [3H] R1881 na ausência ou na presença do excesso indicada (de 0,5 uM a 4 mM) de compostos de rádio inertes. radioactividade intracelular foi analisada. Inserir no painel B mostra os locais de ligação de AR doseadas em 10
3 células incubadas com 10 nM de [3H] R1881 (R1881 *) na ausência ou na presença de excesso não marcado indicada de (
R
) -9, (
S
) -11 ou (
R
) -bicalutamide (
R
) -bic. Dados a partir de três experiências diferentes foram recolhidas e ligação residual foi calculada e expressa como% do total de locais de ligação de AR.
n
= número de experimentos. A significância estatística dos resultados foi também avaliado pelo emparelhado
t
de teste e valores de P 0,005 foram considerados significativos. Nenhuma significância foi atribuída à diferença na ligação residual entre as células incubadas com 10 nM de [3H] R1881, na presença de (
S
) -11 ou (
R
) -9 e aqueles incubadas com 10 nM de [3H] R1881, na presença de (
R
) -bicalutamide ((
R
) -bic). As células LNCaP foram também incubadas com 10 nM de [3H] R1881 na ausência ou na presença de 100 vezes em excesso (1 uM) não marcada de R1881 ou Casodex®. Residual ligação foi de 13% e 14% para não marcado R1881 ou Casodex®, respectivamente.
ligação de deslocamento Estudos
O primeiro avaliou a capacidade de (
S
) e -11 (
R
) -9 para deslocar especificamente a actividade de ligação do ligando de AR nas células LNCaP inteiros. Para este fim, as células quiescentes foram incubadas com 10 nM de [3H] R1881 na ausência ou na presença do excesso indicada de compostos de rádio-inerte. As células foram tornadas quiescentes por tratamento de soro com dextrano-carvão vegetal para remover esteróides livres e, em seguida, recolhido por gentilmente raspagem para preservar a ligação do AR membrana, a fim de considerá-lo como parte dos resultados de ligação. Os resultados das diferentes experiências independentes foram analisadas, revelando que ambos (
S
) e -11 (
R
) -9 compostos deslocado o [3H] R1881 de ligação em cerca de 45% e 80% quando utilizado em 0.5 uM e 1 uM, respectivamente (Fig. 1B e inserção). Quase total de [3H] R1881 deslocamento foi detectado quando cada composto foi utilizada a 2 uM ou 4 uM (Fig. 1B e inserção). Dados semelhantes foram observados utilizando R1881 não marcado ou Casodex® (Fig. 1B legenda) ou quando a análise de deslocamento de ligação foi realizado em células COS que expressam ectopicamente-hAR (dados não mostrados). O anti-andrógeno (
R
) -bicalutamide substancialmente comportou-se como (
S
) -11 e (
R
) -9, embora foi um pouco mais eficaz do que (
S
) -11 e (
R
) -9 em deslocar a ligação quando usado em baixas concentrações (0,5 ou 1 uM) ligando AR. De um ponto de vista estatístico (Fig. 1B lenda), estas diferenças parecem insignificantes. No geral, estes resultados indicam que (
S
) -11 e (
R
) -9 compostos ligam AR.
citotóxica Atividade in vitro
em seguida, avaliou o
in vitro
atividade citotóxica de (
R
) -9 e (
S
) -11 em um painel de linhas celulares de cancro da próstata em diferentes fases da hormona capacidade de resposta e representativas de diferentes características patológicas do câncer de próstata humano (Fig. 2).
A atividade citotóxica de (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11and (
R
) -9 em linhas celulares de cancro da próstata humano LNCaP, LNCaP-Rbic, LNCaP-AR e VCaP após uma exposição de 144 horas, medidos pelo ensaio de SRB (média de três experiências independentes). As concentrações (mm) de (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11 e (
R
) -9 causando 50% de diminuição na sobrevivência celular (IC
50) são mostrados à direita das curvas.
as células foram expostas a concentrações de droga escalares que variam de 0,02 uM a 20 uM durante 144 horas. (
R
) -bicalutamide não apresentaram curvas de dose-efeito na linha celular LNCaP-Rbic resistentes ou em células abrigando VCaP elevados níveis de tipo selvagem AR. Embora uma tendência dose-efeito fraco foi observada nas linhas celulares que expressam naturalmente AR (LNCaP) ou células de engenharia para sobre-expressar o receptor (LNCaP-AR), IC
50 (2 ^ M), apenas foi observada em linha de células LNCaP (Fig . 2).
(
S
) -11 apresentaram uma actividade modesta em todos, mas a concentração mais elevada (20 pM) em que se observou um modesto efeito citotóxico em células de capnografia, (Fig. 2 ). Nas outras linhas celulares foi detectado um forte efeito citocida com
50 valores IC variando de 11,2 mM a 13 mM. (
R
) -9 produziu um efeito semelhante ao de (
S
) -11 em apenas LNCaP-Rbic mas induziu um efeito dose-dependente e citotóxica forte nas outras linhas celulares, natural ou artificialmente expressar AR, sempre alcançando IC
50 valores, mesmo em células capnografia, (6 M).
Influência sobre hormonal estímulo
Nós também investigou a interferência dos antiandrogénios no efeito de R1881 em LNCaP ingénuos e linhas de LNCaP-AR derivado, este último manipuladas para expressar níveis mais elevados de AR de tipo selvagem ((Fig. 3A). a exposição prolongada a 10 nM R1881 aumento da proliferação celular das linhas de cancro da próstata em cerca de 1.5- 2,5 vezes. a exposição concomitante de células para R1881 e -bicalutamide (
R
), (
S
) -11 ou (
R
) -9 por 72 horas suprimiu o estímulo de crescimento determinado por o androgénio sintético. em particular, (
R
) -9 provou ser o mais eficaz na inibição da estimulação proliferativo hormonal, a partir de uma concentração de 5 ^ M. Além disso, como esperado, um aumento significativo (
P
0,01) nos níveis de PSA foi observado no meio de cultura de células LNCaP (43%) e LNCaP-AR (62%) as células depois de uma exposição de 48 horas a 10 nM do androgénio sintético R1881 (fig. S1). Em contraste, todos os compostos Antiandrogen utilizados a concentrações de PSA secreção inibida 20 uM em meio de cultura de ambas as linhas celulares. Em particular, ambos (
R
) -9 e (
S
) -11 causado uma redução nos níveis de PSA significativamente maior (
P
0,01) do que a produzida por (
R
) -bicalutamide (
P Art 0,01).
(a) Avaliação por ensaio SRB do acitivity antitumoral das concentrações escalares de (
R
) -bicalutamide, (
S
) -11 ou (
R
) -9 em LNCaP hormone-responsive e células LNCaP-AR AR-superexpressão, na presença ou não do androgénio sintético, R1881 (10 nM). As barras representam a média de duas experiências independentes. (B), (C) Avaliação dos níveis de mRNA do gene da PSA após uma exposição de 24 horas a concentração diferente de (
S
) -11 (C) ou (
R
) –
9
(D), na presença ou ausência de R1881 (pontos são a média de dois experimentos independentes, *
P Art 0,05).
também investigamos a modulação no início de actividade transcricional AR exercida pelas duas novas moléculas em tempos de exposição e as concentrações não capaz de induzir morte celular massiva.
observou-se um aumento significativo nos níveis de ARNm de PSA (
P 0,01) em ambas as linhas celulares após uma exposição de 24 horas a 10 nM R1881 (Fig 3 aC).. Uma exposição de 24 horas para (
S
) -11, sozinho ou em combinação com R1881, induziu uma modesta redução nos níveis de ARNm de PSA em ambas as linhas celulares. Por outro lado, uma exposição de 24 horas para (
R
) -9 sozinho induziu uma redução significativa da expressão de ARNm de PSA em LNCaP e LNCaP-AR a partir de menor concentração usada (0,5 uM). Quando uma exposição de 24 horas de R1881 precedida de que (
R
) -9, uma redução significativa na expressão de ARNm de PSA em relação à que é exibida por células expostas a R1881 sozinha foi observada a partir de 0,5 uM e em células LNCaP a partir de 5 uM em LNCaP-AR, respectivamente, (
P
0,005). Os dados obtidos parecem indicar que (
R
) -9 para concentrações baixas é mais eficaz do que (
S
) -11 na inibição da actividade de transcrição de AR.
efeito sobre a incorporação de BrdU
foi avaliado o efeito de ambos os compostos sobre a síntese de ADN induzida por androgénio de células de LNCaP em três experiências diferentes. (
R
) -9 (Fig. 4A) e (
S
) -11 (Fig. 4B) incorporação de BrdU inibiu significativamente estimulada por 10 nM R1881 tratamento de células LNCaP tornadas quiescentes utilizando fenol meio vermelho-livre e soro tratado com carvão dextrano. O efeito inibidor foi semelhante ou ainda mais forte do que a obtida usando o mesmo intervalo de concentração (10-20 uM) de Casodex (Fig. 4 A e B) ou (
R
) -bicalutamide (Tabela 1). (
R
) -9 e incorporação de BrdU (
S
) -11, mais uma vez significativamente inibida estimulada por 10 nM R1881 tratamento de células LNCaP-AR tornadas quiescentes como descrito acima para LNCaP (Fig. S2).
a e B, as células LNCaP quiescentes em lamelas foram deixados sem tratamento (controlo) ou tratadas durante 18 horas com o androgénio sintético R1881 (10 nM) na ausência ou na presença dos antagonistas indicadas (utilizada a 10 ou 20 uM). Depois de
in vivo
pulsando com 100 M BrdU, incorporação de BrdU foi analisada por imunofluorescência e expressa como% de núcleos totais. Em A e B, os números no topo de cada barra representa a média de três experiências independentes (
n = 3
), com o desvio padrão (SD) 1. A significância estatística dos resultados em A e B foi avaliada com o
t
pareado.
P valores
foram 0,005 para as células estimuladas com 10 nM R1881. FIG.