Sumário

de necrose tumoral a apoptose relacionado com o factor indutor de ligando (TRAIL) induz apoptose numa variedade de linhas celulares de cancro com pouco ou nenhum efeito sobre as células normais. No entanto, o seu efeito é limitado, como alguns tipos de câncer, incluindo show de câncer de pâncreas de novo a resistência à TRAIL induziu apoptose. Neste estudo, relatam que a inibição de GSK-3 utilizando o agente farmacológico AR-18, TRAIL sensibilidade aumentada numa gama de linhas de células de cancro do pâncreas e próstata. Esta sensibilização foi encontrado para ser dependente de caspase, e ambos knock-down farmacológica e genética de GSK-3 resultou em isoformas características apoptóticas, como mostrado por clivagem de PARP e a caspase-3. Níveis elevados de intermediários reativas de oxigênio e perturbação da membrana mitocondrial ponto de potencial para um circuito de amplificação mitocondrial para a apoptose induzida por TRAIL após a inibição de GSK-3. Consistente com isto, a sobre-expressão de alvos mitocondriais anti-apoptóticos tais como Bcl-XL, Mcl-1, Bcl-2 e PANC-1 resgatado e PPC-1 a partir de células de sensibilização TRAIL. No entanto, a sobre-expressão do inibidor de caspase-8 CrmA também inibiu os efeitos sensibilizadores de inibidor de GSK-3, sugerindo um papel adicional para a GSK-3, que inibe a sinalização do receptor de morte. O tratamento agudo de ratos portadores de xenoenxertos de PANC-1 com uma combinação de AR-18 e TRAIL também resultou num aumento significativo na apoptose, tal como medido por clivagem de caspase-3. Sensibilização a TRAIL ocorreu apesar de um aumento em β-catenina devido à inibição da GSK-3, sugerindo que a abordagem pode ser eficaz mesmo em cancros com desregulado β-catenina. Estes resultados sugerem que a GSK-3 inibidores pode ser efetivamente combinado com TRAIL para o tratamento de câncer de pâncreas

Citation:. Mamaghani S, Simpson CD, Cao PM, Cheung M, Chow S, Bandarchi B, et al. (2012) glicogênio sintase quinase-3 Cells Inibição sensibiliza do cancro do pâncreas para TRAIL-induziu a apoptose. PLoS ONE 7 (7): e41102. doi: 10.1371 /journal.pone.0041102

editor: Shawn B. Bratton, da Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de dezembro de 2011; Aceito: 21 de junho de 2012; Publicação: 19 de julho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Mamaghani et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento foi fornecido pelo Instituto da Família Campbell for Cancer Research. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. Recombinante Apo2L /TRAIL humano foi um presente da Genentech, South San Francisco, CA. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A via apoptose extrínseca começa com a ligação de ligantes de receptores de morte, tais como ligando Fas, tumor fator de necrose α (TNF-α), e de necrose tumoral a apoptose relacionado com o factor indutor de ligando (TRAIL) para receptores de morte, activando uma série de sinais que podem levar a dois modos separados mas interrelacionados, de indução de apoptose. Em alguns casos, a activação da morte de receptor-4 (DR-4) e morte do receptor-5 (DR-5) leva ao recrutamento de proteínas adaptadoras para formar a morte induzir sinalização complexo (DISCO), e subsequente activação do iniciador caspases-8 ou -10 é suficiente para activar caspases efectoras 3, -6 e -7, e os resultados de apoptose [1]. No entanto, a ligação de TRAIL para DR-4 ou 5-DR e activação de caspases-8 ou -10 é frequentemente insuficiente para induzir apoptose, e requer a libertação de mediadores mitocondriais, tais como citocromo C, para amplificar o sinal de morte induzir [2]. Essa conversa cruzada entre extrínsecos e intrínsecos vias de apoptose requer caspase-8 clivagem mediada do membro da família Bcl-2 Bid [2], [3]. Truncado Bid (tBid) actua como um mecanismo de bloqueio para inibir a acção de Bcl-2 proteínas anti-apoptóticas, tais como Bcl-2, Mcl-1 e Bcl-XL, que leva à morte celular induzida por mitocôndrias [3].

TRAIL também podem ligar-se dois conjuntos de receptores de engodo não-funcionais, em cujo caso, a indução de apoptose é bloqueadas [1]. O balanço entre a morte indução de receptores e receptores de engodo é um determinante principal da indução de apoptose nas células alvo [4]. Em contraste a TNF-α e Fas, TRAIL parece mostrar uma maior especificidade para a indução de apoptose em células tumorais in

in vivo

, correspondentemente com menos toxicidade para o hospedeiro [1], [4], [5], [ ,,,0],6]. Embora o mecanismo exacto de especificidade de alvo por TRAIL não é conhecido, a falta de toxicidade em células normais é, em parte, atribuído à expressão inferior de receptores de morte (DR-4 e DR-5) e o aumento da expressão de receptores de engodo na superfície as células normais [4], [7]. Em contraste, uma variedade de cancros mostram um aumento da expressão de receptores de DR-4 e -5, tornando-os susceptíveis à apoptose induzida TRAIL- [3]. Enquanto o efeito tumoricida de TRAIL é promissor, tem efeitos limitados e muitos tumores são resistentes a TRAIL [5], [8], [9], [10], [11].

Os trabalhos anteriores por nossa laboratório e outros sugerem que o NF-kB é regulada positivamente pelo glicogénio sintase quinase-3 (GSK-3) e está envolvida na quimio-resistência, a sobrevivência de células de cancro, crescimento e metástase [12], [13], [14]. A GSK-3 induzida por inibição efeitos anti-de sobrevivência em células de cancro do pâncreas, associados com a regulação negativa da actividade de NF-kB e a diminuição da expressão de genes alvo anti-apoptóticos tais como XIAP, Bcl-XL, e ciclina D1 [14].

GSK-3 também pode proteger as células de citotoxicidade mediada por TNF-α, indicando que a GSK-3 desempenha um papel no bloqueio de receptor de morte mediada por apoptose [15], [16], [17]. Curiosamente, os efeitos inibidores de GSK-3 foram estendidos para outros receptores de morte, tais como TRAIL e Fas [18], [19]. A inibição de GSK-3 foi mostrado para potenciar apoptose induzida por TRAIL em linhas celulares de cancro da próstata e de hepatoma humano [10], [20]. No decurso de experiências descritas no nosso trabalho anterior, observou-se que a GSK-3 inibição bloqueou a activação de NF-kB por TNF-α [14]. Uma vez que a activação de NF-kB foi anteriormente sugerida para suprimir a apoptose induzida por TRAIL em células de cancro pancreático [21], esta descoberta sugere que o potencial para a inibição de GSK-3 para sensibilizar cancro pancreático a TRAIL. Neste relatório, nós testamos se GSK-3 inibição teve um efeito sensibilizante na apoptose induzida por TRAIL ambos os

in vitro

usando pancreática e linhas celulares de cancro da próstata e

In vivo

usando PANC-1 xenotransplantes .

Materiais e Métodos

linhas celulares e Reagentes

linhas de células de adenocarcinoma do pâncreas PANC-1 e BxPC-3 (ATCC, Rockville, MD) foram mantidas como descrito anteriormente [ ,,,0],14]. PPC-1 Linhas celulares de cancro da próstata foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS, 100 unidades /mL de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina, a 37 ° C e 5% de CO2 em ar.

Apo2L humana recombinante /TRAIL foi um presente da Genentech, South San Francisco CA. O inibidor de caspase geral z-VAD-fmk era de Alexis-Enzo Life Sciences, Inc. Plymouth Meeting, PA.

transfecções estáveis ​​

Para estudos superexpressão, pcDNA3.1-Myc constrói contendo anti marcadores -apoptotic: Bcl-2, Bcl-XL, CRMA, e MCL-1, que contém pcDNA3.1-Sua construção tag foram utilizadas (Sidnet, Toronto, Canada):

células PANC-1 e PPC-1. foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) com 0,95 ug /poço de ADN. Os transfectantes foram seleccionados com G418 durante 14 dias para gerar clones estáveis, como descrito anteriormente [22]. A funcionalidade das proteínas expressas foi confirmada utilizando o ensaio de indução de apoptose estaurosporina [23].

Ensaio de Proliferação Celular

O efeito dependente da dose de AR-A014418 (AR-18) (sintetizado de costume, Toronto Research Chemicals Inc., North York, Ontario, Canada), TRAIL (rh-TRAIL, R D systems, Inc., Minneapolis, MN) e sua combinação em PANC-1, BxPC-3 e células PPC-1 e seus as variantes geneticamente modificadas foi avaliada por o corante sulfo-rodamina B (SRB) (Invitrogen, Carlsbad, CA), ensaio de ligação, como descrito anteriormente [14], em triplicado e repetidos seis vezes.

Análise de Citometria de Fluxo a apoptose de

medição combinada de potencial de membrana mitocondrial, geração de intermediários reactivos de oxigénio (ROI), e integridade da membrana externa por citometria de fluxo foi como previamente descrito [24]. PANC-1, BxPC-3, e as células PPC-1 foram tratados com AR-18 (25 uM) durante 24 h seguido por TRAIL (10 ng /mL) durante 24 h, com um único agente ou de controlos não tratados. As células foram coradas com (40 nM) DiIC1 (5) (Invitrogen, Carlsbad, CA) e diacetato de dichlorodihydrofluorescin (H2-DCFDA) (5 uM) (Invitrogen, Carlsbad, CA), e iodeto de propídio (PI) a uma concentração final de 1 mg /mL.

knockdown genética de GSK-3

GSK-3 geneticamente isoformas foram derrubados nas células PANC-1 transfectadas com ARNsi contra a GSK-3 e α p isoformas utilizando um inverso protocolo de transfecção como descrito anteriormente [14].

Pancreatic Cancer Xenoenxerto modelo

os experimentos foram realizados de acordo com os regulamentos do Conselho canadense de animal Care e orientação institucional para o bem-estar animal. PANC-1 foram estabelecidos xenoenxertos subcutaneamente nos flancos de ratinhos de 6 semanas de idade, macho ratinhos imunodeficientes combinados graves (SCID), e deixou-se crescer até cerca de 10 mm na maior diâmetro. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula: comprimento x largura

2 × 0,5 [25]. Os ratinhos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos (n = 5) para receber AR-18 20 mg /kg (5 mg /ml em DMSO) duas vezes por dia durante dois dias, seguindo-se um período de repouso de 24 h antes de injecção i.p. injeção de TRAIL 25 mg /kg, ou grupos de agentes ou de controle de veículos individuais. Os animais foram pesados ​​e avaliados quanto a sinais de toxicidade diariamente, e sacrificados no dia 5. Os tumores foram excisados, peças congeladas rapidamente, fixadas com formalina ou lisadas, tal como descrito abaixo.

imunotransferência

procedimento de transferência de Western foi realizada como descrito anteriormente [14], utilizando anticorpos policlonais de coelho anti-caspase-3 clivada, β-catenina, a PARP clivada, Bcl-2, Bcl-XL, (tecnologia de sinalização, Danvers, MA celular), e anticorpo monoclonal de ratinho contra a GSK-3 α /β (Biosource Inc., Camarillo, Canadá).

a imuno-histoquímica e Captura de imagem

Os tecidos de fígado, rins e tumores foram fixados em formalina, embebidos em parafina e processado como 4 mm seções. Cortes seriados foram imunocoradas usando H E e caspase-3, como descrito anteriormente [26] e visualizados sob um microscópio Olympus BX41 usando 4X e ampliação de 40x lentes objetivas

A quantificação da caspase-3

lâminas coradas para a caspase-3 clivada foram analisados ​​de forma cega para obter um H-score. A intensidade da coloração de cada amostra foi avaliada em relação à intensidade de uma lâmina de controlo de ratos que receberam tratamento com veículo. Uma pontuação de 1+ indicado fraca coloração em relação ao fundo, 2+ = coloração moderada e 3+ = coloração forte. intensidade da coloração foi relatada ao mais alto nível de intensidade observada em todos os elementos de tecido. Para comparação de coloração entre os tecidos, os resultados foram quantificados por cálculo de um H-score que considera completa tanto intensidade de coloração e a percentagem de células coradas com uma gama específica de intensidades. A H-pontuação total foi calculado multiplicando a intensidade na percentagem de células coradas positivamente (H = P x I) tal como descrito anteriormente [26].

Análise estatística

Para investigar o possível sinérgico efeito da combinação de AR18 com TRAIL, a interacção entre os dois tratamentos com drogas foi testada por encaixando-a um modelo que considera o facto de algumas experiências não foram realizadas ao mesmo tempo. Os valores de densidade óptica (por SRB) foram log transformados para estabilizar a variância dos resíduos. Os valores resultantes foram analisados ​​por meio da comparação entre as diferentes concentrações de cada droga utilizando modelos de regressão linear. A interacção droga foi considerada sinérgica quando o efeito da combinação da droga foi significativamente maior do que a soma dos efeitos de ambos os fármacos, e sub-aditivo quando era menor do que. Os efeitos do tratamento foram comparadas pelo teste t de Student e as diferenças entre as médias foram consideradas significativas quando P ≤ 0,05. A análise foi realizada com a ajuda do software de “R”, tal como descrito anteriormente [14]. Os resultados foram expressos como média ± SE.

A análise estatística dos escores-H completa foi realizada utilizando o teste t de Student bicaudal com os dados desemparelhados de igual variância. A significância estatística foi considerada quando o valor p = 0,05.

Resultados

GSK-3 Inibição sensibiliza TRAIL- resistentes células do cancro do pâncreas à apoptose

Tratamento de PANC-1 e BxPC-3 células com RA-18 (25 e 50