Abstract

No presente estudo, avaliamos a expressão da condutância intermediária de potássio ativado por cálcio (KCa3.1 ) canal no glioblastoma humano células-tronco-like (CSCs) e investigou seu papel na motilidade celular. Enquanto o canal KCa3.1 não é expresso em tecidos e neuronal- derivado das células gliais de indivíduos saudáveis, tanto o ARNm e proteína KCa3.1 estão presentes na população de tumor glioblastoma, e está significativamente aumentada em ambos os CSCs derivadas de U87MG linha celular estabelecida e uma linha de células primária, FCN9. De acordo com estes dados, as correntes independente de tensão e TRAM-34 potássio sensíveis imputáveis ​​ao canal KCa3.1 foram registrados na linha de células GL261 murino e várias linhas de células de glioblastoma humanas primárias. Além disso, uma corrente significativamente mais elevada KCa3.1 foi gravado em células positivas U87MG-CD133, em comparação com a subpopulação U87MG-CD133 negativo. Além disso, verificou-se que a motilidade de células tumorais está fortemente associada com a expressão do canal de KCa3.1. O bloqueio do canal de KCa3.1 com o inibidor específico de eléctrico 34 tem de facto um impacto maior sobre a motilidade das CSCs (redução de 75%), as quais expressam um nível elevado de canal KCa3.1, do que na população parental FCN9 ( redução de 32%), onde o canal KCa3.1 é expresso a um nível inferior. Resultados similares também foram observadas com as CSCs derivados de U87MG. Porque invasão de tecidos circundantes é uma das principais causas de falha do tratamento de glioblastoma, estas descobertas podem ser relevantes para o desenvolvimento futuro do romance de cancro drogas terapêuticas

Citation:. Ruggieri P, Mangino G, Fioretti B, Catacuzzeno L , Puca R, Ponti D, et al. (2012) A inibição da KCa3.1 Canais Atividade diminui a motilidade celular em células-tronco cancerosas Glioblastoma derivados. PLoS ONE 7 (10): e47825. doi: 10.1371 /journal.pone.0047825

editor: Massimo Avoli, McGill University, Canadá |

Recebido: 30 de maio de 2012; Aceito: 17 de setembro de 2012; Publicação: 22 de outubro de 2012

Direitos de autor: © Ruggieri et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da Fondazione Cassa di Risparmio, Perugia (FF) e de COFIN-MIUR (Ministero dell’Università e della Ricerca Scientifica) 812,111, 2007 (AC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Glioblastoma multiforme (GBM) é o sistema mais comum maligno Nervoso Central (SNC) de tumores em adultos, e os mais difíceis de curar, apesar dos avanços na terapia da cirurgia e adjuvante [1]. Ela representa 30 a 60% dos tumores primários do sistema nervoso central, com uma incidência de 2 a 3 casos por 100 000 pessoas por ano [2], [3]. Apenas 30% dos pacientes com GBM vivem mais de um ano após o diagnóstico, ea expectativa de vida média permanece aproximadamente 14-18 meses [4], [5]. O mau prognóstico para pacientes com GBM não melhorou significativamente nas últimas décadas, principalmente devido às dificuldades e desafios na detecção e tratamento deste tipo de câncer letal

.

Várias propriedades de câncer, incluindo glioblastoma, são influenciados por misregulation de ion expressão do canal ou da função [6] – [8]. redução da expressão de retificador para dentro canais de K [9] e aumento da expressão de canais de Na sensíveis a amilorida [10], canais de Cl activado tensão [11], e canais BK [12] foram relatados em vários gliomas, em comparação com os astrócitos normais. expressão do canal KCa3.1 também podem ser desregulamentados glioblastoma. O canal KCa3.1, também conhecido como IK1, SK4, KCNN4, IKCa é um membro da família de canais de potássio activados por cálcio (KCa), com uma condutância unitária de 20-60 pS em simétrico 150 MMK [13], [14 ]. Distingue-se dos canais funcionalmente relacionados activados pelo cálcio potássio do maior (100-200 pS; BK) e menor (2-20 pS; SK) condutância unitária por sua farmacologia, biofísica e fisiologia [13], [14]. Todos os três membros da família de canais KCa foram apresentados pelo grupo de Sontheimer para ser transcrito em células de glioma, embora apenas os canais BK foram funcionais no tumor, e a sua inibição influenciou fortemente a migração celular in vitro [15]. Recentemente nosso grupo relatou a expressão funcional do canal KCa3.1 em linhas celulares de glioblastoma e demonstraram que estes canais têm profundos efeitos na promoção da migração celular, como mostrado pelo ensaio de migração Transwell em presença de bloqueadores dos canais de KCa3.1 específicas [16]. Subsequentemente, a expressão e a actividade funcional do canal KCa3.1 foi firmemente estabelecida em duas linhas de células de glioma e em células de uma cultura primária [17].

Evidências recentes sugerem que os glioblastomas são originários a partir de uma piscina de haste de como células que compartilham propriedades em comum com as células estaminais neuronais. comportamento stemness e capacidade migratória estão intimamente associados e regulado por mecanismos de sinalização comuns [18]. Com base nestes dados que nos propusemos a investigar se os canais KCa3.1 estão envolvidos no processo migratório das células estaminais-como isolados a partir de primário derivado do tumor e linhas celulares permanentes. Encontramos uma expressão acentuada de canais KCa3.1 ativamente funcionais na fracção enriquecida de células-tronco com propriedades semelhantes e que seu bloqueio seletivo motilidade celular drasticamente inibida.

Resultados

KCa3.1 Funcional canais são expressos no U87MG e GL261 linhas celulares

a fim de determinar os níveis de ARNm em células do cancro KCa3.1 glioblastoma, medimos a sua expressão por PCR em tempo real em duas linhas de células bem caracterizadas, o humano U87MG e o GL261 murino.

KCa3.1

mRNA é claramente detectado em ambas as linhas celulares e expressos em níveis mais elevados em comparação com os astrócitos normais humanos e de murino. Os seus níveis foram 118,47 ± 14,6 vezes mais elevados no U87MG e 76,13 ± 16,52 em células GL261 (dados não mostrados). A análise Western blot dos lisados ​​de células inteiras, realizados para avaliar a expressão de proteínas, mostraram uma banda de ~48 kDa em ambas as linhas de células co-migrando com o controlo positivo fornecido pelo produtor de anticorpos específicos (Figura 1A). A quantidade de proteína KCa3.1 detectado no U87MG é claramente superior em relação à observada a partir da linha celular de GL261. A densidade óptica (OD) medições de intensidade da banda, após a normalização, foi estimado o nível KCa3.1 no U87MG para ser de cerca de 4 vezes mais elevada do que na GL261. Também foi avaliada a frequência de células positivas nas duas linhas de células por análise de citometria (Figura 1B, C). A percentagem de células positivas foi KCa3.1 72,66% na linha de células U87MG e 37,51% em linha celular GL261. Estas frequências são relativamente alta se comparada com a de células positivas KCa3.1 (2,82%) encontradas em ratinho normal astrócitos adultos, tomadas em células de controlo (Figura 1D).

(A) Análise de imunotransferência de U87MG e GL261 mostrou uma expressão de canais KCa3.1 correlacionados com os níveis de transcrição. (B) (C) citofluorim�rica análise da KCa3.1 em U87MG, GL261 e rato normal de astrócitos adultos (NMA). As células foram incubadas com anti-KCa3.1 seguido por anticorpo anti-coelho de cabra conjugado com AlexaFluor488 como relatado na secção de Materiais e métodos. Dez mil eventos foram registrados e analisados ​​com Cyflogic. histogramas cinza: autofluorescência celular; histogramas a negro: AlexaFluor488-conjugado de cabra anti-coelho sozinho; histogramas verdes: anti-KCa3.1 (D) decurso de tempo típico da corrente a partir de uma célula KCa3.1 GL261, gravado a partir de curvas IV a 0 mV, em condições de controlo, após a aplicação de DC-EBIO (100 ^ M) + ionomicina ( 500 nM), e após a aplicação de 3 mM TRAM-34 na presença contínua de DC-EBIO + ionomicina. rampas de voltagem foram aplicados a cada 5 s. círculos preenchidos são pontos de dados obtidos imediatamente antes das curvas IV mostrados no painel E. (E) curvas Representante IV obtidos através da aplicação de rampas de tensão de -100 a +50 mV a partir de um potencial de realização de 0 mV, em condições de controle (CTRL), na sequência a aplicação de DC-EBIO + ionomicina, e após a adição de um eléctrico de 34 na presença contínua de DC-EBIO + ionomicina. (F) Média KCa3.1 densidade de corrente medido no rato NMA, como controlo, em linhas de células de glioblastoma U87MG e GL261 a 0 mV, avaliado como a diferença entre a densidade de corrente de pico em DC-EBIO + ionomicina e a corrente residual a seguir à adição de Tram-34 (cf. círculos preenchidos no painel D).

a expressão funcional de canais KCa3.1 em U87MG e células de glioblastoma GL261 foi verificada com medições de patch-clamp no todo-cell perfurada configuração. TEA (3 mM) e octanole (1 mM) estavam presentes em todas as soluções para bloquear a BK e os canais de junções de hiato, geralmente co-expressas com canais KCa3.1 em células de glioblastoma (ver Métodos, [16]). Uma experiência típica que ilustra o protocolo utilizado para avaliar a corrente KCa3.1 é mostrado na Figura 1E e F. As células foram repetidamente estimuladas com rampas de voltagem de -100 a +50 mV de um potencial de manutenção de 0 mV, e a corrente KCa3.1 foi avaliada aplicando primeiro o activador de canal de KCa3.1 /SK DC-EBIO (100 uM) mais ionomicina (500 nM; CC-EBIO ionomicina +), e em seguida adicionando o inibidor do canal KCa3.1 específica Tram-34 (3 uM) na presença contínua de DC-EBIO + ionomicina. Em ambas as linhas celulares, após a perfusão extracelular com DC-EBIO + ionomicina, observou-se o desenvolvimento de uma corrente independente de tensão, com um potencial de inversão (quer dizer -85 ± 3 mV para células GL261, n = 3, e -82 ± 4 para as células U87MG, n = 4) perto do potencial de equilíbrio K em nossas condições de gravação (-90 mV). A corrente DC-EBIO + ionomicina induzida teve na maioria das células de uma fase transitória inicial que antecede a um patamar sustentado. Tanto o transitória e sustentada componentes pode, de facto, ser atribuída ao actual KCa3.1, como eles nunca foram observados aquando da aplicação de DC-EBIO + ionomicina em células Tram-34-pré-incubadas. O KCa3.1 a densidade de corrente média de U87MG e as células GL261 (transiente mais sustentada, avaliada a 0 mV) foi de 16,2 ± 5,0, n = 18, e 11,5 ± 3,9, n = 7, respectivamente. Em contraste, há um eléctrico de corrente 34 sensível DCEBIO + Ionomicina-activado foi observada em astrócitos de rato normal adultos (n = 7) (Figura 1G).

A indução de neuroesferas e CD133, seguida da activação do KCa3.1 canais expressão, na Linha U87MG celular

a seguir, procurou examinar a expressão ea função dos canais KCa3.1 em células U87MG cultivadas em meio permissiva células-tronco. Condicionado celular foi avaliada por microscopia óptica e por citofluorimetria verificar o aparecimento de neuroesferas e CD133

+ células, que foram monitorizados até três semanas depois (Figura 2A, B, C). CD133 é um marcador da maioria das células estaminais do tipo de tumor, especialmente em tumores cerebrais [19]. CD133

+ células acumuladas para um máximo de 6,3% (Figura 2D), após 10 dias de condicionamento (U87MG-NS), e eles ainda eram positivos após 16 dias (4,6%, dados não mostrados).

(A) imagem de microscopia de fase mostra células U87MG e U87MG neuroesfera subconfluentes derivada após 7 (B) e 14 dias (C) do meio isento de soro condicionado. (D) A análise de citometria de fluxo de CD133 em U87MG e U87MG-NS. As células foram coradas com conjugado com PE anti-CD133 (1) ou histotipo anticorpos emparelhados como descrito na secção Materiais e métodos. Dez mil eventos foram registrados e analisados ​​com Cyflogic. histograma Gray: autofluorescência celular; histograma preto: controlo isotópico; histograma de laranja: anti-CD133 (1) (E) Análise de imunotransferência de U87MG e U87MG-NS mostrou uma expressão de canais KCa3.1 correlacionados com os níveis de transcrição. (F) O contraste de fase (topo) e imunofluorescência (inferior) imagens de células U87MG-NS mecanicamente dissociadas seguintes 30 min de incubação com o anticorpo anti-CD133, mostrando CD133

+ e CD133

– células (indicado por grosso e setas finas, respectivamente). (G) lote de barras mostrando os KCa3.1 média densidade de corrente medido a 0 mV em CD133

+ e

CD133 – células U87MG-NS. As experiências foram realizadas como descrito na legenda da Figura 1D-F. * Teste de ANOVA, p . 0,05

Para verificar as propriedades estaminais-como de U87MG-NS foi realizada PCR em tempo real para examinar a expressão de

nestin e

GFAP.

Alterações na expressão de

nestina, um marcador de células-tronco neurais, e

GFAP

, um marcador de astrócitos diferenciadas, são indicativos de diferenciação

em vitro

de células-tronco semelhantes derivadas de glioblastoma [1]. Em comparação com U87MG sem tratamento,

nestina

expressão foi aumentado de 2,68 ± 0,56 vezes (p 0,001), enquanto que

GFAP foi encontrada para diminuir (0,516 ± 0,05, P 0,05). Estes resultados foram confirmados por imunofluorescência da U87MG e U87MG-NS com anticorpos contra CD133, GFAP e nestina (veja os dados suplementares).

Em seguida, examinaram a expressão do canal KCa3.1 no U87MG-NS. A expressão de

KCa3.1

ARNm foi de 2,02 ± 0,10 vezes mais elevado do que nas células não tratadas (p 0,001). Além disso a quantidade de proteína KCa3.1 detectado no U87MG-NS é maior do que no U87MG (a razão OD é 1,8), como esperado a partir dos níveis elevados de ARNm (Figura 2E). A análise electrofisiológica executada no CD133

+ células derivadas de U87MG-NS também demonstrou a maior actividade dos canais nestas células. Especificamente, foram realizadas medidas de patch-clamp na utilização de células negativas ou positivas CD133, após coloração com anticorpos anti-CD133 por imunofluorescência (Figura 2F). Como mostrado na Figura 2G, ambas as células exibido KCa3.1 correntes, tal como avaliado através da aplicação do protocolo padrão na configuração da célula completa. Notavelmente, CD133

+ células foram encontrados para expressar um nível significativamente mais elevado de KCa3.1 densidade de corrente (21,3 ± 3,7 pA /pF, n = 7, vs 8,1 ± 3,5 pA /pF, n = 5, respectivamente; p 0,05).

o subconjunto de CD133

+ U87MG células expressam níveis mais elevados de

KCa3.1

mRNA

Uma vez que o foco principal dos nossos estudos é a

KCa3.1

expressão do canal em células de tumor cerebral com propriedades tronco-like, que, em seguida, dirigido a nossa investigação no sentido de CD133

+ subpopulações fracionado a partir de U87MG-NS. Usando células de classificação obtivemos frações celulares com até 32% de CD133

+ células (Figura 3) e com um nível de

CD133

transcrições mais de 11 vezes maior (11,63 ± 3,23, p 0,001 ).

KCa3.1

nível de ARNm em fracções enriquecidas com CD133, também ensaiadas por PCR em tempo real, foi cerca de 4 vezes mais elevada (3,99 ± 0,195, p 0,05). Que em subconjuntos CD133-empobrecido

análise de citometria de fluxo de U87MG-condicionado NS foram realizadas por coloração das células com o anticorpo anti-CD133 conjugado com PE como relatado na secção de materiais e métodos. Percentagem de CD133

+ células antes (painel esquerdo) e após o procedimento de triagem (painel da direita) são mostradas em vermelho. Dez mil eventos foram adquiridos e analisados ​​utilizando software FACs diva.

O KCa3.1 inibidor específico TRAM-34 reduz a motilidade do U87 MG-NS

Temos demonstrado anteriormente que a modulação de fluxos de iões através dos canais da membrana é essencial para a estimulação da motilidade celular de glioblastoma. Desde TRAM-34 inibe selectivamente corrente de iões através dos canais KCa3.1, testamos a hipótese de que prejudicar a corrente de íons com TRAM-34 teria um efeito sobre

in vitro

motilidade do U87MG-NS (avaliado por fibronectin- Os ensaios de Transwell revestido). Como mostrado na Figura 4A, verificámos que Tram-34 na concentração de 1 e 3? M motilidade inibida por 49,5% ± 21,52 (n = 10, p 0,001), e 65,4% ± 27,46 (n = 10, p 0,001 ), respectivamente.

(a) análise quantitativa da invasão celular com ensaio de câmara de Boyden revestidos por fibronectina está descrito na secção de Materiais e métodos. Diferentes concentrações de Tram-34 (1 e 3 uM) inibiu a motilidade celular de um modo dependente da dose. A inibição foi estatisticamente significativa em comparação com células não tratadas (*** p 0,001). As barras são a média ± SD. (B, C, D) campos microscópicos representativos de U87MG-NS glioblastoma células estaminais do tipo que tenham migrado durante 48 horas através de um filtro de tamanho de poro de 8 um, na ausência (B) e na presença de 1 ^ M (C) e três ? M (D) TRAM-34.

KCa3.1 Canais estão ausentes em Adultos saudável do cérebro e cerebelo, mas altamente expressa em amostras de tumores de glioblastoma e linhas celulares derivadas primárias

Para determinar se nossas descobertas podem ser relevantes para o estudo dos tumores cerebrais, estendemos nossas investigações à expressão do canal KCa3.1 de astrócitos humanos normais (NHA), secções embebidas em parafina de tumores gliais humanos, e três linhas de células de glioblastoma humanas primárias (CRL8 , FCN9 e MZC12). Os níveis de expressão muito KCa3.1 diferiu entre as amostras investigadas. A mudança de dobragem média relativa ao NHA foi 318,9 ± 21,13 para CRL8, 176 ± 34,64 (FCN9) e 57,6 ± 2,4 (MZC12) (p 0,001), nas três linhas de células primárias (Figura 5A). coloração imuno-histoquímica revelou que os canais KCa3.1 estavam ausentes na matéria branca do cérebro normal, excepto para as células endoteliais dos vasos sanguíneos (Figura 5B), enquanto que foram altamente expressos em secções de três tumores diferentes (Figura 5C, D, E). Um astrocitoma de grau I é mostrado na Figura 5F com coloração positiva KCa3.1 confinada a zonas enriquecidas em novos vasos sanguíneos. Na Figura 5G uma secção de tecido de pulmão normal é mostrado como controle positivo

(A) PCR em tempo real em três linhas primárias de células humanas de glioblastomas (CRL8, pista 1;. FCN9, pista 2; MZC12, pista 3) demonstrou que os transcritos KCa3.1 expressão é superior em comparação com NHA (pista 4). (B-G) Coloração imuno-histoquímica em tecido cerebral humano normal revelou a presença de proteína KCa3.1 apenas em células endoteliais de vasos sanguíneos (B), enquanto que foi observada uma coloração difusa em tumores de grau elevado (CRL8, C; FCN9, D, MZC12, E ) e um sinal de KCa3.1 apenas na área neo-vascularização (GLIO baixo grau, F). Como controlo positivo utilizou-se o tecido pulmonar fisiológico (L). (H) de tempo típico da corrente registada a -40 mV a partir de uma célula FCN9, aplicando a cada repetitivos (5S) rampas de voltagem de -100 a +100 mV. 3 mM de TEA e 1 mM octanole foram adicionados para bloquear o canal BK por junções de hiato e, respectivamente, geralmente co-expressa com canais KCa3.1 em células de glioblastoma (21; 22). DC-EBIO (100 M) + ionomicina (0,5 M) e DC-EBIO + ion 3? M TRAM-34 foram aplicados em sucessão para verificar a expressão funcional de correntes KCa3.1 (texto cf). (I) relações Representante I-V em presença de DC-EBIO + ionomicina e DC-EBIO + ionomicina + TRAM-34. Os dados no painel (H) e (I) são da mesma experiência.

Inset

: relação Eu-V da corrente KCa3.1 obtido subtraindo as rampas atuais registrados no DC-EBIO + ion + TRAM-34 do que o registrado em DC-EBIO + ion. (G) Lote relatar a densidade de corrente KCa3.1 a 0 mV (avaliadas como no painel I) medido nas três linhas celulares de glioblastoma primárias. Uma vez que em várias células de uma corrente de K dependentes da voltagem de activação para potenciais de membrana mais elevado do que -20 mV estava presente, nestes casos, as medições da densidade de corrente KCa3.1 foram realizadas a -40 mV, e a densidade de corrente foi então avaliada a 0 extrapolada mV assumindo uma relação linear de corrente e tensão. * Teste de ANOVA, p . 0,05

estudos funcionais em linhas de células primária Glioblastoma

A expressão funcional de canais KCa3.1 nas três linhas de células de glioblastoma primário foi verificada com patch- as medições da braçadeira na configuração de célula inteira perfurada (Figura 5H, I, L). Em todas as células testadas (CRL8, n = 8; FCN9, n = 5, e MZC12, n = 4) a corrente KCa3.1 foi identificada como a corrente exterior activada por perfusão extracelular de DC-EBIO + ionomicina, e inibido pela KCa3.1 inibidor TRAM-34 (3 M) de canal selectivo (Figura 5H, I). Figura 5L, que mostra a densidade de corrente média KCa3.1 avaliada nas três linhas de células, indica que a linha de células CRL8 tem uma densidade significativamente mais elevada do que as linhas celulares FCN9 e MZC12. Observe que ao contrário de linhas celulares estáveis, em células primárias correntes KCa3.1 para construir a trama ter sido tomada a -40 mV em vez de 0 mV porque neste mais despolarizada tensão de uma voltagem-DRK corrente significativa foi, por vezes, apresentar que foi sensata inibida por a solução de activação KCa3.1 DC-EBIO + ionomicina. Portanto, para permitir uma comparação directa com as densidades de corrente KCa3.1 avaliadas em linhas de células de glioblastoma, os dados mostrados na Figura 5 L são dadas a 0 mV. Os dados foram obtidos por extrapolação ajuste linear da relação IV na faixa de tensão -100 /-40.

A motilidade de subpopulações de células-tronco semelhantes derivadas de linhas celulares primárias são fortemente inibida por TRAM-34

Última examinamos o

KCa3.1

expressão do mRNA e da capacidade de migração sob tratamento TRAM-34 em uma linha de células primárias (FCN9) e suas propriedades estaminais-como subcultura clonal derivada com (2B5) [ ,,,0],20].

KCa3.1

transcrição de ARNm e a expressão da proteína foi encontrado para ser aumentada em células 2B5 em comparação com FCN9 (1,5 vezes ± 0,2, p 0,05 para o ARNm, e ver Figura 6B para imunotransferência). Uma diferença significativa entre as duas linhas celulares também foi encontrado por citometria de fluxo (a intensidade de fluorescência média de 1061,97 e 1716,37 para KCa3.1 foi encontrada em FCN9 e 2B5, respectivamente). A percentagem de células positivas também estavam diferente entre as duas linhas de células (51,86% em FCN9 e 70,68% em 2B5). Além disso, a forma do histograma (isto é, uma curva de Gauss bimodal em sobreposição 2B5 como comparado a uma curva de Gauss em FCN9) revela a presença de células 2B5 de uma subpopulação que expressam níveis elevados de KCa3.1, que está ausente em FCN9 (Figura 6A). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o clone 2B5 derivado de haste-expressa como níveis KCa3.1 mais elevadas do que as células parentais FCN9.

(A) análise de citometria de fluxo de KCa3.1 em FCN9 (painel superior) e 2B5 derivado clone (painel inferior). As células foram coradas com anti-KCa3.1 seguido por AlexaFluor488-cabra conjugada com anti-coelho. Dez mil eventos foram registrados e analisados ​​com software Cyflogic. histogramas Grey: autofluorescência celular; histograma verde anti- KCa3.1; histograma preto: AlexaFluor488 conjugado cabra-anti Coelho. (B) A análise de imunotransferência de FCN9 e 2B5 mostrou uma expressão aumentada de canais KCa3.1 na subcultura clonal derivada caracterizam propriedades tronco-like (2B5). (C) Análise quantitativa da invasão de células realizada em revestido de fibronectina câmara de Boyden, usando 3? M TRAM-34. Os resultados, representados como percentagem de inibição de motilidade em comparação com células não tratadas, foram estatisticamente significativas (*** p 0,001). As barras são a média ± SD.

Uma redução significativa da motilidade foi induzida por 3 mM TRAM-34 em ambas as linhas celulares. A redução observada na 2B5 células (75%) foi, porém, muito maior do que em FCN9 células. (32%; Figura 6c)

Discussão

Junto com a maioria dos tumores sólidos constituídos de células cancerígenas heterogêneas como bem como vasculaturas, elementos estromais e células inflamatórias [21], GBMs exibir notável heterogeneidade intratumoral e hierarquia celular. Cada vez mais provas também apoia firmemente o conceito de que uma subpopulação de células cancerosas na massa tumoral tem maior potencial para a iniciação e repovoamento [22] câncer – [27]. Estas células são conhecidas como células-tronco cancerosas (CSCs) ou células iniciadoras de tumores como eles compartilham diversas propriedades críticas com células-tronco típicos, incluindo a capacidade de auto-renovação, diferenciação multi-linhagem, e manteve a proliferação [28] – [31] . De acordo com a literatura recente, as células-tronco glioma também promovem radiorresistência, tumor angiogênese [32], [33] e dirigir metástase [34]. Um grande problema com as células GBM é a sua natureza altamente infiltrativa. Como consequência, a invasão de células de cancro agressivo GBM para o tecido normal do cérebro e da medula espinal, muitas vezes impede a remoção completa das células tumorais [35]. Migração começa quando uma célula responde a um sinal externo que leva à polarização e a extensão de um “líder frente” na direcção do movimento [36]. A evidência crescente mostra que os canais de iões são componentes necessários da maquinaria complexa responsável pela migração de células. Especificamente, os canais iônicos tornar a migração possível através de fluxos osmóticos e consequente encolhimento e inchaço do corpo celular. Eles encontram-se tanto no lado traseiro da célula e na parte da frente levando, em que eles também exercem um papel invasiva através de acidificação da área de ECM e promoção da actividade proteolítica metaloproteinase [37]. A violação da arquitectura homeostático epitélio, juntamente com a aquisição de um fenótipo migratória, é um momento chave na progressão tumoral de todos os tumores sólidos. Ainda não é claro se é principalmente o componente celular da haste do tumor, já exibindo propriedades invasivas in vivo, o qual adquire o fenótipo migratório [34]. conhecimento limitado está disponível sobre as propriedades migratórias de células tumorais glioma in vitro em relação com a atividade do canal KCa3.1. O canal KCa3.1 é predominantemente activa no bordo traseiro da célula [38], e facilita o inchaço celular e encolhimento em células de tumor durante a migração [37]. Além disso, o canal KCa3.1 foi envolvido na resposta migratória solicitado por CXCL12, o ligando quimiocina de CXCR4 [39]. Recentemente demonstrámos que a inibição da densidade de corrente de ambos os canais de cloreto e KCa3.1 em U87MG impede quase completamente a migração, sem afectar a proliferação [40]. canais de iões têm sido investigados em células estaminais a partir de diferentes tipos de tecidos normais, como canais KCa3.1 em células estaminais mesenquimais derivadas da medula óssea do rato [41]. No entanto, a relação conhecimento para canais iônicos em CSCs em vez disso é muito limitado [41]. Isto levou-nos a investigar a presença ea função do canal KCa3.1 em CSCs de glioblastoma humano e como eles se relacionam com o fenótipo celular nessas células.

Primeiro, mostramos que transcrições de canal KCa3.1 são expressos em diferentes tipos de células em cultura, tais como estabelecidas de forma permanente e linhas de células primárias. Os níveis registados pelo Real-Time PCR são até 118 vezes maior no U87MG, 76 vezes no GL261, e 318,9, 176, e 57,6 vezes em três linhas de células primárias, em comparação com os astrócitos normais. diferenças mais baixas, mas igualmente significativas foram encontradas entre os CSCs e a contraparte parental U87MG e a linha de células primárias FCN9. As diferenças na intensidade de fluorescência de anticorpo canal -bound KCa3.1 e a fracção de células positivas foram também observadas, pela primeira vez, por citofluorimetria.

No cérebro de murídeo adulto normal a corrente KCa3.1 tem apenas foi relatado em microglia activada [42], do capilar cerebral células endoteliais [43], células de Purkinje [44], e numa subpopulação de astrócitos envolvidas no acoplamento neurovascular [45] – [47] [8]. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que em cérebro de murídeo a expressão funcional do canal KCa3.1 se limita a subpopulações de células astrocíticos específicos. Consequentemente, nós aqui informar que os astrócitos normais do rato adulto praticamente não expressam atual KCa3.1. Esta conclusão também é consistente com a fracção muito baixo (cerca de 2,5%) de células positivas KCa3.1 encontrados por análise FACS em astrócitos normais. Também foi investigada a presença de canais de K Ca activados por immunoistochemistry em secções de tecido a partir de ambas as amostras normais e de tumor humano. O canal KCa3.1 apresentado com uma difusa e forte coloração apenas nas amostras de tumores de alto grau.

expressão Canal permitiu-nos a examinar a questão do papel do canal KCa3.1 sobre a capacidade migratória celular por realizando Transwell ensaios de motilidade, na presença e ausência de um inibidor específico do canal. Foram observadas diferenças marcantes na capacidade de migração sob o efeito do inibidor do canal KCa3.1, TRAM-34. Em um artigo anterior, descobrimos que 3? M TRAM-34 inibiu U87MG motilidade por 58,5% [40]. Neste trabalho nós mostramos que a mesma concentração de bloqueador do canal reduziu a motilidade do U87MG-NS, a subpopulação derivado da haste-como de U87MG, em 66%.

Com o emprego de técnicas de patch-clamp também temos sido capazes para investigar diferenças de actividade entre CD133 actuais fracções positivas e negativas presentes na população U87MG-NS. Isso nos permitiu estimar um K atuais 2,6 vezes maior no CD133

+ amostra. Mesmo mais surpreendente foi a redução da motilidade 2B5 (-75%), sob o efeito de um eléctrico de 34 em comparação com a redução observada na FCN9 (-32%). A queda observada na motilidade bem correlacionado com os níveis de expressão do canal de KCa3.1 nas duas linhas de células, devido à maior sensibilidade de 2B5 para um eléctrico de 34. A correlação encontrada parece mais significativo à luz do facto de que o canal KCa3.1 é apenas um de um número de diferentes tipos de canais de iões que promovem a mobilidade celular. No geral, nossos resultados mostram que a expressão do canal KCa3.1 e função são mais pronunciadas nas populações menos diferenciadas, favorecendo um papel mais influente sobre o fenótipo motilidade.

A capacidade altamente invasivo in vivo é uma característica da haste células. Além disso, também a hipótese de que existem dois tipos de CSCs, um estacionárias e móveis outro [48]. Isso levanta a questão de saber se a redução do fluxo de iões operado por TRAM-34 altera a motilidade celular diretamente ou através de um sinal de agir de acordo com o interruptor fenotípica de papelaria para o celular, através de uma via regulamentar desconhecido. Esta última hipótese é atraente tendo em vista as observações muito recentes que demonstram que o bloqueio do complexo do canal de sódio da membrana do plasma inibe a proliferação de células de glioma, além de migração, e que esta muito provavelmente envolve alterações no programa de expressão do gene através de um mecanismo ainda não resolvidas [49]. Também para os canais KCa3.1 não podemos excluir uma ligação entre a modulação da atividade atual e reprogramação expressão do gene. Esta questão permanece sem solução.

Materiais e Métodos

Cell Cultures

O mouse estabelecida e linhas de células de glioblastoma humano, (GL261 e U87MG) foram cultivadas, respectivamente, em D-MEM F -12 e D-MEM (Invitrogen) suplementado com 1% de ácidos aminados não essenciais, 1% de L-glutamina, 100 UI /ml de penicilina, 100 UI /ml de estreptomicina e 10% de soro fetal de vitela (FCS, Flow Laboratories) a 37 ° C C em 5% de CO

2 humidificada em atmosfera de ar. Rato e culturas de glioblastoma humano U87MG GL261 e foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Rochville, MD, EUA). Astrocitoma primária MZC12, CRL8 e FCN9 (OMS grau IV) foram feitas em um trabalho anterior pelo nosso grupo a partir de amostras tumorais de pacientes [50]. Detalhes de aprovação da comissão institucional e consentimento informado dos pacientes são citados na referência acima.