Abstract

Fundo

expressão alterada de Mcl-1, um membro anti-apoptótica de da família Bcl-2, tem sido associada com a progressão e resultado de uma variedade de doenças malignas. Temos relatado anteriormente a superexpressão de Mcl-1 proteína em cânceres orais humanos. O presente estudo teve como objetivo avaliar o significado clínico-patológico da expressão de três conhecidos Mcl-1 isoformas em tumores orais e os efeitos da segmentação Mcl-1L isoforma na quimio-sensibilidade das células cancerosas orais.

Métodos

A expressão de Mcl-1 isoforms- Mcl-1L, Mcl-1S Mcl-1ES foi analisado em 130 tumores orais emparelhados e 9 linhas celulares orais utilizando quantitativa PCR em tempo real proteínas por transferência Western. Os níveis Mcl-1 mRNA foram correlacionados com os parâmetros clínico e os resultados dos pacientes com câncer bucal. O efeito de Mcl-1L shRNA ou Obatoclax (uma pequena molécula Mcl-1 inibidor), em combinação com cisplatina na quimio-sensibilidade das células cancerosas orais também foi avaliada.

Resultados

Anti-apoptótica Mcl -1L foi predominantemente expresso, mais baixos ou indetectáveis ​​pró-apoptóticos MCL-1S e Mcl-1ES isoformas. As transcrições Mcl-1D foram significativamente sobre-expressos em todas as linhas celulares de cancro e em tumores orais 64% versus normais adjacentes (

P Art 0,02). Em pacientes com câncer bucal, alta expressão Mcl-1L foi significativamente associada com positividade nó (

P

= 0,021), o tamanho do tumor avançado (

P

= 0,013) e sobrevida global pobres (

P

= 0,002). A análise multivariada indicou Mcl-1L ser um fator prognóstico independente para os cancros orais (

P

= 0,037). Mcl-1L shRNA knockdown ou a sua inibição por Obatoclax em combinação com cisplatina sinergicamente reduziu a viabilidade e crescimento das células de câncer bucal do que qualquer tratamento sozinho.

Conclusão

Nossos estudos sugerem que a superexpressão de Mcl-1L está associada com mau prognóstico e chemoresistance em cancros orais. Mcl-1L é um fator prognóstico independente e um potencial alvo terapêutico em cancros orais

Citation:. Palve V, Mallick S, Ghaisas G, Kannan S, Teni T (2014) sobre-expressão de Mcl-1L Splice variante é associado com mau prognóstico e chemoresistance em cancros orais. PLoS ONE 9 (11): e111927. doi: 10.1371 /journal.pone.0111927

editor: Kithiganahalli N. Balaji, Instituto Indiano de Ciência, Bangalore, Índia |

Recebido: 09 de junho de 2014; Aceito: 09 de outubro de 2014; Publicação: 19 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Palve et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:.. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de boca é o câncer mais prevalente entre os homens indianos e é predominantemente associado com o hábito de tabaco de mascar prevalente no país [1]. Apesar dos avanços recentes em modalidades de tratamento como a cirurgia, a radioterapia /quimioterapia, a sobrevivência a longo prazo dos pacientes com câncer bucal não se alterou significativamente. Os fatores associados ao mau prognóstico do câncer oral incluem, apresentação em um estágio descontrolada recorrência loco-regional [2]. Por isso, é importante para elucidar os mecanismos envolvidos no desenvolvimento e progressão do câncer bucal e identificar alvos moleculares para uma melhor gestão da doença.

Os cânceres orais têm sido repetidamente associado com a desregulação de apoptose [3]. Os membros pró-apoptóticos e anti da família Bcl-2 são os reguladores-chave da apoptose celular e desempenham um papel crítico na regulação da sobrevivência celular [4]. Mcl-1 (células de leucemia mielóide-1) é um importante membro anti-apoptótica da família de genes de Bcl-2, essencial para o desenvolvimento, diferenciação, proliferação e [5]. expressão celular de Mcl-1 é rigidamente controlado por meio de vários mecanismos de transcrição e pós-transcricional [6]. Aumento Mcl-1 expressão pode produzir melhoria viabilidade moderada a curto prazo em uma ampla gama de tipos de células. Mcl-1 pode promover a sobrevivência de células, suprimindo a libertação de citocromo-c das mitocôndrias através heterodimerização e a neutralização do efectoras pró-apoptóticos BH3-somente proteínas tais como Bak e Noxas [7]. A sobre-expressão de Mcl-1 tem sido relatada numa variedade de malignidades hematopoiéticas incluindo, linfóide e tumores sólidos [8], [9]. A sobre-expressão de Mcl-1 tem sido associado a tumor agressivo, características de resistência ao tratamento e mau prognóstico no cancro da mama, gástrico, do ovário cânceres cervicais [10] – [13]

Embora o gene Mcl-1 foi estudada extensivamente em mieloma múltiplo e leucemia, há relatos raros sobre a análise Mcl-1 em cancro da cabeça e pescoço.. Estudos recentes do nosso laboratório demonstraram a superexpressão significativa de Mcl-1 proteína em linhas celulares de cancro orais, lesões pré-malignas (OSF) e tumores orais por imuno-histoquímica [14]. Nós também demonstraram alta PCNA e Mcl-1 expressão da proteína a ser associada com mau prognóstico em pacientes com câncer bucal tratados com radioterapia definitiva [15]. No entanto, a situação é complexo devido à existência de três distintos Mcl-1 isoformas com funções contrastantes nomeadamente anti-apoptótica de Mcl-1L e pró-apoptótica de Mcl-1S Mcl-1ES [16]. Curiosamente, o nosso laboratório relatou recentemente a associação de anti-apoptótica de Mcl-1L isoforma com a sobrevivência e radiorresistência de células de carcinoma escamoso oral [17].

Mcl-1 também tem mostrado desempenhar um papel na quimiorresistência de uma variedade de cancros, mas o papel de suas isoformas em chemoresistance não foi estudado em cancros incluindo cancros orais. Radiação seguido de quimioterapia é a modalidade de tratamento comum para o cancro oral e Mcl-1 sobre-expressão foi mostrado para fornecer resistência a fármacos quimioterapêuticos convencionais, como Cisplatina [18]. Vários relatórios demonstraram que Mcl-1 promove a sobrevivência de células e direccionamento de Mcl-1 através de moléculas BH3-miméticos podem induzir a morte celular em células cancerosas resistentes a cisplatina [19], [20]. Recentemente, Obatoclax, um mimético de BH3 inibidor de molécula pequena tem sido demonstrado para antagonizar a proteína de Mcl-1 e de Mcl-1 superar a resistência à apoptose mediada [21], [22]. Os nossos estudos recentes indicam Mcl-1 para ser importante para a sobrevivência das células cancerosas por via oral e, portanto, a segmentação de Mcl-1 pode ser útil no tratamento de pacientes de cancro oral. No entanto, com o melhor de nosso conhecimento, tais estudos não estão disponíveis no câncer oral. O presente estudo foi assim realizado para avaliar o significado clínico de Mcl-1 isoformas no câncer oral e a eficácia da segmentação Mcl-1 a ​​chemosensitize células cancerosas orais

in vitro

.

Materiais e Métodos

As culturas de células

Seven célula câncer bucal linhas- SCC25, QLL1 (From Dr. Park, Yonsei University College of Medicine, Coreia [23] Dr Rheinwald, Harvard Medical School, Boston [ ,,,0],24]); UPCI: SCC029B, UPCI: SCC040 UPCI: SCC074 (From Dr. S Gollin, da Universidade de Pittsburgh, PA) [25]; AW8507 AW13516 [26] foram utilizados no estudo. Além disso, um imortalizado Fetal mucosa bucal (FBM) [27] e uma queratinócitos Displásico Oral (DOK) (do Dr. Ken Parkinson, Faculdade de Medicina da rainha Mary Odontologia, Reino Unido) [28] linhas celulares também foram utilizados no estudo. As células foram mantidas em MEM ou IMDM suplementado com FBS a 10% 1% de mistura de antibiótico padrão em 5% de CO

2 incubadora a 37 ° C, como descrito anteriormente [17], [23], [29].

Oral tecidos

Este estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board of Tata Memorial Centre e Sharad Pawar Dental College, na Índia. consentimentos informados por escrito foram obtidas de todos os participantes do estudo. amostras de tratamento naïve primárias orais tumorais e seus tecidos normais adjacentes foram obtidas de 130 pacientes submetidos a cirurgia de Cabeça e Pescoço e Unidade a partir do Repositório de Tecido Tumoral ICMR Nacional, Tata Memorial Centre, Mumbai, na Índia. tecidos orais inflamadas (n = 20) foram coletadas como tecidos normais saudáveis ​​de pacientes submetidos a procedimento cirúrgico menor dental no Departamento de Patologia Oral, Sharad Pawar Dental College, Wardha, na Índia. Todos os tecidos foram imediatamente congelados em azoto líquido e armazenado a -80 ° C até à análise. As características clinicopatológicas da coorte estão ilustrados na Tabela 1.

isolamento de RNA e PCR em tempo real

ARN a partir de sedimentos de células e tecidos foram extraídos utilizando o reagente TRI (Sigma, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. O RNA foi dissolvido em água tratada com DEPC e ADN contaminante foi removido por tratamento com ADNasel (Sigma, EUA). a integridade de ARN foi analisada por electroforese em e as amostras foram conservadas a -80 ° C até análise, como descrito anteriormente [17]. O ADNc foi sintetizado com 500 ng de ARN total, utilizando um kit de síntese de primeira cadeia de cDNA (MBI Fermentas, Canadá) de acordo com as instruções do fabricante. O cDNA foi então submetido para quantitativa PCR em tempo real utilizando Taqman universal PCR mestre mix (ABI, 4.304.437) ea MCL-1 isoformas específicas sondas de expressão gênica (ABI,

Mcl-1L

: Hs00172036_m1;

Mcl -1S

: Hs00766187_m1

Mcl-1ES

: 4.331.348). A amplificação foi realizada em ABI-7900HT tempo real do sistema de PCR (Applied Biosystems, EUA). GAPDH (ABI, Hs99999905_m1) foi utilizado como controle interno para normalizar a variação da amostra entre em RNA a eficiência de amplificação. Todas as reacções de amplificação foram realizadas em triplicado, usando água tratada com DEPC como controlos negativos. A análise de dados de expressão de genes foi feita usando a Comparativo C

T método de quantificação relativa [30].

Western blotting

As proteínas foram extraídas a partir de sedimentos de células e tecidos de tumor, tal como descrito anteriormente [14]. Resumidamente, 30 mg de tecido congelado foi pulverizado em amp mortais pilão utilizando azoto líquido, dissolvido em ProteoJET refrigerada Mammalian Cell Reagente de Lise contendo ProteoBlock Cocktail de Inibidor de Protease (Fermentas, EUA) e sonicado em gelo. Os lisados ​​de tecido ou de células foram clarificados por centrifugação a 14000 rpm a 4 ° C. A estimativa de proteínas foi realizada pelo método de Bradford. Os lisados ​​de tecido /células (30-50 ug) foram resolvidas em géis de 12% SDS-PAGE e transferidas para membranas de PVDF (Millipore, EUA). As membranas foram bloqueadas com leite desnatado a 5% em TBS durante 2 horas. e incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo monoclonal de ratinho contra Mcl-1D (1:1000) (Santa Cruz Biotechnology, EUA). As membranas foram retirados e sondado com anticorpo policlonal de coelho contra a ß-actina (1:2000) (Santa Cruz Biotechnology, EUA) como controlo de carga. Os anticorpos secundários utilizados foram conjugados com peroxidase de rábano IgG (1:5000) (Santa Cruz Biotechnology, EUA). As proteínas foram visualizadas com kit de quimioluminescência aumentada (GE Healthcare, EUA). análise de densitometria de películas de raios-X desenvolvido foi realizada utilizando o software ImageJ (NIH, Bethesda, MD).

Mcl-1L knockdown

A expressão de Mcl-1 L foi regulada negativamente por clonagem de Mcl-1L shRNA cassete no sistema lentiviral pTRIPZ de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems, EUA). Uma sequência de oligonucleótido não-direccionamento foi clonado como controlo. As partículas virais foram gerados por co-transfecção das construções recombinantes Mcl-1LshRNA-pTRIPZ e embalagens plasmídeos em células HEK293FT. Além disso, três linhas celulares de cancro orais ou seja AW8507, UPCI: SCC029B UPCI: SCC040 foram transduzidas ea seleção estável foi feito usando marcador de seleção puromicina. A expressão para shRNA foi induzida pela doxiciclina e postar 72 horas. de tratamento, os níveis de 1L-Mcl foram avaliados por qRT-PCR e transferência de Western. O silenciamento específico de Mcl-1 L foi confirmada em três experiências independentes.

A morte celular por PI coloração

PI (iodeto de propídio, Santa Cruz Biotechnology, CA) a coloração foi feita para a detecção de células morte nas três linhas celulares de cancro orais (AW8507, UPCI: SCC029B UPCI: SCC040) após diferentes combinações de tratamentos. Resumidamente, as células foram recolhidas por tripsinização, coloca-tratamentos diferentes, conforme descrito anteriormente. As células foram lavadas com PBS e 10 ul de PI foi adicionado. As células foram então incubadas durante 2 min na obscuridade e analisada a 488 nm, num citómetro de fluxo (FACS Calibre, BD, EUA).

Ensaio MTT

As células foram semeadas a 2000 células por poço em placas de 96 poços contendo DMEM com FBS a 10%. Após 24 horas, as células eram ou não tratada ou tratada com diferentes concentrações de cisplatina (0,025-10,0 g /mL) (MP Biomedicals, índia) ou Obatoclax (0, 1,0-10,0 nM) (Selleck Chem EUA). As concentrações inibidoras 50% (IC50) para a cisplatina e Obatoclax foram calculadas a partir das curvas de sobrevivência para todas as linhas celulares. DMSO contendo meio serviu como o respectivo controlo. A seguir à incubação das células com Obatoclax e /ou cisplatina durante 72 h, o crescimento celular foi avaliada pelo teste MTT, como por instruções do fabricante (Sigma, EUA). Resumidamente, o meio gasto foi removido e 50 ul de solução de MTT (1 mg /ml) foi adicionado a cada poço. As placas foi incubado durante 4 horas a 37 ° C em CO

2 incubadora e os cristais de formazano em células viáveis ​​foram dissolvidos usando sulfóxido de dimetilo (DMSO, 100 uL por poço). A placa foi agitada num agitador orbital durante 10 min e a absorvância foi medida a 540 nm, utilizando o comprimento de onda de referência de 690 nm num leitor de microplacas (Spectramax, EUA). Cinco poços foram usadas para cada concentração de fármaco, e a experiência foi repetida três vezes. Numa outra experiência, para avaliar se a combinação dos tratamentos iria conseguir a inibição do crescimento superior ao tratamento individual, as células cancerosas orais foram tratadas com doxiciclina para knockdown Mcl-1 expressão ou Obatoclax (5 nM) para inibir a Mcl-1 actividade, seguida de cisplatina numa concentração mais baixa do que a dose CI50. Todos os experimentos foram realizados em triplicata

Trypan azul ensaio Microscopia Confocal

As células foram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 5 x 10

4 por poço. A expressão de Mcl-1 foi alvo quer por tratamentos doxiciclina ou Obatoclax ou em combinação com Cisplatina, tal como descrito acima. As células foram trypsinzed após 48 horas. de tratamento e de azul de tripano foi realizada (0,4%) de coloração. O número de células viáveis ​​foram contadas utilizando um hemocitómetro e comparado com o controlo não tratado. Os dados são apresentados a partir de três experiências independentes. A imagem latente de células após diferentes tratamentos foi realizada utilizando um microscópio invertido com Browser LSM Imagem 4.2 software (Carl Zeiss, EUA).

A análise estatística

A análise estatística foi feita usando uma versão licenciada do pacote de software SPSS 15.0. Correlacionar estatisticamente a expressão de Mcl-1 isoformas com os parâmetros clínico, os dados foram dicotomizados em dois grupos a saber: a Mcl-1 isoforma altas expressadores e baixos expressadores. Para efeito de comparação a expressão de Mcl-1 isoformas em normais e tecidos saudáveis ​​adjacentes histologicamente normais significa foram utilizados. A correlação entre os parâmetros clínico (sexo, idade, localização, hábitos, tamanho, nó, metástase, recorrência) foi feito usando o teste do qui quadrado (χ

2). As curvas de Kaplan-Meier foram utilizadas para avaliar a sobrevida global ea diferença entre os grupos foi calculado com Log Rank teste de significância. Os parâmetros preditivos na análise univariada foram incorporadas análise multivariada por meio do teste de riscos proporcionais de Cox para identificar os fatores que foram preditores independentes de sobrevivência. O software Graphpad Prism5 foi usado para traçar gráficos e os dados de dois ampères semelhante e; grupos diferentes foram analisados ​​estatisticamente pelo t de Student test teste de Mann Whitney. A variação entre as médias dos grupos foi analisada por análise unidireccional da variância (ANOVA). Os dados são apresentados como média ± DP. O valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

A expressão de Mcl-1 isoformas em linhas de células orais

análise de qRT-PCR revelou, alta expressão predominante de. anti-apoptótica isoforma Mcl-1L sobre baixa ou indetectável pró-apoptóticos e Mcl-1S Mcl-1ES expressão em todas as linhas celulares orais (Figura 1A). Mcl-1L foi encontrado para ser significativamente sobre-expresso tanto em ARNm nível da proteína em todas as sete linhas celulares de cancro orais (SCC25, UPCI: SCC029B, UPCI: SCC040, UPCI: SCC074, QLL1, AW8507 e AW13516), em comparação com FBM linha de células DOK displásicos (Figura 1)

(a) A expressão de Mcl-1D Mcl-1S de ARNm em linhas de células orais; Mcl-1 níveis ES foram indetectáveis ​​(* P≤0.03) (b) a expressão da proteína MCL-1L em linhas de células orais.

A expressão de MCL-1 isoformas em tecidos orais

qRT-PCR análise revelou (p≤0.02) elevada expressão significativa de Mcl-1 L de mRNA em 64% (84/130) dos tumores orais de diferentes sublocais em comparação com tecido normal (Figura 2A). Além disso, não foi observada diferença significativa entre a expressão Mcl-1L de tumores de diferentes subsites. A expressão relativa de Mcl-1L isoforma foi ~ 5 vezes mais elevada do que Mcl-1S e ~ 10 vezes superior à de Mcl-1ES isoforma em tumores orais (dados não mostrados). Da mesma forma, a análise de Western blot mostrou alta expressão de proteína de Mcl-1 L em tumores oral versus tecidos normais adjacentes (Figura 2B).

(a) Expressão de ARNm de Mcl-1 L em tumores orais normais versus de diferentes sublocais (* P≤0.02); (B) a expressão da proteína Mcl-1L no adjacente normal versus tumores

Correlação de Mcl-1 expressão com os parâmetros clínico resultado

A análise univariada revelou correlação significativa de expressão alta Mcl-1L com positividade nó (p = 0,021) e tumores avançados (p = 0,013). No entanto, não foi observada correlação significativa entre a expressão de Mcl-1 isoformas e sexo, idade, fumo /hábitos alcoólicos, local primário diferenciação de pacientes de cancro oral (Tabela 2). Notavelmente, a baixa expressão de pró-apoptóticos MCL-1S isoforma mostrou uma tendência à significância positiva com tumores pouco diferenciados (p = 0,053).

Correlação de Mcl-1 expressão com a sobrevida global

As curvas de sobrevivência Kaplan-Meier de expressadores baixa e alta de Mcl-1L mostrou uma diferença estatisticamente significativa (p = 0,002). Os pacientes que expressam alta anti-apoptótica Mcl-1L apresentaram sobrevida global pobres versus aqueles expressando baixo Mcl-1D (Figura 3A). Inversamente, os doentes que expressam elevados pró-apoptóticos Mcl-1S exibiram significativamente melhor sobrevivência global (p = 0,051), em comparação com os que têm baixos Mcl-1S (Figura 3b). Notavelmente, a proporção relativa de Mcl-1L /MCL-1S também mostrou uma correlação positiva (p = 0,006) com os pobres sobrevida global dos pacientes com câncer bucal (Figura 3C). Além disso, a análise univariada também revelou sobrevida global pobres de nódulo positivo contra pacientes nó negativos orais câncer (p = 0,003). Os outros parâmetros como idade, tabagismo /hábitos alcoólicos e diferenciação não influenciou significativamente a sobrevida global desses pacientes.

estimativas (AC) de Kaplan-Meier de sobrevida global de pacientes com câncer bucal com baixa ou alta expressão de Mcl- 1 isoformas; (D) A análise multivariada dos pacientes com câncer bucal

A análise multivariada

Entre as duas isoformas (Mcl-1D MCL-1S). Analisadas, theMcl-1L expressão influenciou o global sobrevivência de pacientes com câncer bucal. A variável Mcl-1L, que tinha emergido significativa na análise univariada, foi examinada usando o modelo de regressão de Cox na análise multivariada (Figure3d). Os pacientes que expressam alta Mcl-1L exibiram menor sobrevida global e maior risco 3.2 do tempo de sobrevivência pobres, em comparação com aqueles que expressam baixo Mcl-1D (p = 0,037). Isto implica que Mcl-1L é um fator prognóstico independente para o câncer bucal

shRNA mediada baixo regulação da Mcl-1L

Nos três linhas celulares de cancro orais (AW8507, UPCI:. SCC040 UPCI: SCC029B) transduzidas com as partículas lentivirais Mcl-1L shRNA-pTRIPZ, a expressão Mcl-1L foi reprimidos com sucesso tratamento pós doxiciclina. Os poços de controlo representam as células sem tratamento com doxiciclina. O PCR quantitativo em tempo real e análise de Western blot confirmou a regulação para baixo de Mcl-1L, tanto a nível de ARNm e de proteína, em todas as três linhas de células de cancro (Figura 4). No entanto, os níveis de Mcl-1S Mcl-1ES permaneceu inalterada (dados não mostrados)

(a b). ShRNA mediada regulação negativa de Mcl-1L ARNm proteína em AW8507, UPCI: SCC040 células de câncer bucal SCCC29B em comparação com o controle

Efeito da Mcl-1L knockdown . /ou cisplatina na morte celular

A indução de morte celular foi analisada por coloração PI seguido por análise FACS em três linhas de células de cancro orais (AW8507, UPCI: SCC040 UPCI: SCC029B) adicionar tratamentos diferentes, conforme descrito anteriormente. O knockdown shRNA mediada de isoforma expressa abundantemente Mcl-1D ou o tratamento com cisplatina revelou a indução de morte celular em todas as linhas celulares. A morte celular induzida no AW8507, UPCI: SCC040 UPCI: SCC29B, pós Mcl-1L knockdown foi de 31% (SD 2.5), 27% (SD 1.5) e 24% (SD 3.5) ou pós Cisplatina tratamento foi de 50% (SD 2.1), 42% (SD 2.7), e 46% (DP 3,1), respectivamente. Além disso, shRNA mediada knockdown Mcl-1L seguido por tratamento com cisplatina em conjunto mostrou 78% (SD, 1.2), 71% (SD 1.8) e 82% (SD 2.0) de morte celular, respectivamente. Os tratamentos combinados de Mcl-1L knockdown e cisplatina mostraram um aumento estatisticamente significativo (p 0,05) diferença na indução da morte de células como comparado a apenas um dos tratamentos (figura 5b), assim, sugerindo um efeito sinérgico dos tratamentos combinados em morte celular.

Efeito de BH3 mimético Obatoclax e /ou cisplatina sobre a viabilidade celular e crescimento

Figura 6a ilustra imagens de microscopia confocal representativos de células AW8507 tratados com cisplatina e /ou Obatoclax. É interessante notar que os tratamentos combinados de Obatoclax A cisplatina demonstrou aumento da morte celular, em comparação com os tratamentos individuais. Além disso, o ensaio de exclusão de azul de tripano de corante foi realizado para determinar o efeito na viabilidade celular em linhas celulares de cancro orais (AW8507, UPCI: SCC040 UPCI: SCC029B) após diferentes tratamentos. Notavelmente, o mimético de BH3 Obatoclax ou cisplatina pode reduzir com sucesso a viabilidade celular em todas as três linhas de células de cancro. Além disso, a combinação de Obatoclax e cisplatina em conjunto de forma significativa (p 0,05) reduziu a viabilidade das células, em comparação com quer isoladamente tratamentos. O tratamento combinado de Obatoclax A cisplatina apresentaram uma redução de 3-7 vezes na viabilidade celular em comparação com os tratamentos individuais (Figura 6B). Além disso, o ensaio de proliferação MTT também revelou um aumento significativo (p 0,05) redução no crescimento celular (2-4 vezes) após o tratamento combinado de cisplatina e Obatoclax em comparação com quer os tratamentos por si só (Figura 6c) que dessa forma, sugerindo um efeito sinérgico da . tratamento combinado sobre a viabilidade celular e crescimento das células cancerosas orais

(a) imagens representativas microscópicos confocal de células AW8507 postar tratamentos diferentes; (B) Avaliação da viabilidade celular por cento das células cancerosas orais postar diferentes tratamentos através do teste de trypan corante azul de exclusão (* P 0,05, vs. tratamentos individuais); (C) Análise de proliferação de células de cancro oral após diferentes tratamentos de ensaio MTT. (* P 0,05, vs. tratamentos individuais).

Discussão

No presente estudo, avaliamos a expressão de Mcl-1 isoformas (Mcl-1L, MCL-1S Mcl-1ES) em tumores orais em comparação com tecidos normais, para determinar se eles seriam úteis como marcadores prognósticos em pacientes com câncer bucal. Até agora, há poucos dados disponíveis sobre o papel de Mcl-1 isoformas na patogênese do câncer oral. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a correlacionar a expressão dos três Mcl-1 isoformas com os parâmetros clínico de pacientes com câncer bucal. O nosso estudo demonstra alta expressão significativa de anti-apoptótica de Mcl-1L na maioria das linhas celulares de cancro e tumores orais (64%) em comparação com os indivíduos saudáveis ​​correspondentes. Também demonstramos que a alta expressão Mcl-1L foi significativamente associada com o mau resultado de pacientes com câncer bucal. Além disso, visando Mcl-1L por shRNA ou Obatoclax em combinação com cisplatina poderia sinergicamente induzir a morte celular em células de câncer bucal. Assim, a sobreexpressão de Mcl-1 L pode representar um mecanismo importante que contribui para a sobrevivência de células de cancro oral, contribuindo, assim, no desenvolvimento e progressão do cancro oral.

A desregulação dos genes de apoptose regulação tem sido relatada a tocar uma tecla papel no desenvolvimento e progressão de várias malignidades humanas. O anti-apoptótica de Mcl-1 é um membro importante da apoptose regulação da família Bcl-2 e foi mostrada para ser sobre-expresso em uma variedade de cancros incluindo, colo do útero, ovário, pâncreas, hepatocelular, do pulmão de células não pequenas, os cancros de células germinativas testiculares e melanomas [8]. Notavelmente, o presente estudo, pela primeira vez demonstra superexpressão de Mcl-1L variante de processamento em linhas maioria dos tumores orais em comparação com tecidos normais. Há apenas um único relatório de análise Mcl-1 isoformas o seu significado clínico medida em carcinomas de células renais claras [31]. Em contraste com os nossos resultados, este estudo no entanto demonstrou uma associação de baixa expressão Mcl-1L com fenótipos agressivos em carcinomas renais de células claras. Além disso, não há informações disponíveis sobre a expressão de Mcl-1 isoformas em cancros orais. No presente estudo, a correlação de Mcl-1 isoformas e os parâmetros clínico de pacientes com câncer bucal, revelou associação significativa de Mcl-1L variante de processamento com o tamanho do tumor avançado (p = 0,013) e linfonodo positivo (p = 0,021). análise de sobrevivência de Kaplan-Meier de baixo contra altos expressadores de Mcl-1L mRNA mostrou que a alta expressão Mcl-1L foi significativamente associada à sobrevida global pobres (p = 0,002). Como observado no presente estudo de Mcl-1 isoformas, de expressão elevada de proteína de Mcl-1 e a sua associação com o pior prognóstico foi demonstrada no colo do útero, gástrico, do pulmão e do ovário [11] – [13], [32]. No entanto, um estudo anterior de nosso laboratório não conseguiu encontrar a associação acima no nível de proteína Mcl-1 [14]. O presente estudo foi realizado para elucidar o perfil de expressão de Mcl-1 isoformas em linhas de células orais e uma grande coorte de tumores, o que demonstrou a associação de expressão anti-apoptótica Mcl-1L com o prognóstico no câncer oral. Este é o primeiro estudo, demonstrando a correlação de Mcl-1L variante de processamento com o resultado de pacientes com câncer bucal e Mcl-1L como um marcador de prognóstico independente para os cancros orais.

Mcl-1 é fortemente regulada na transcrição, postar níveis de transcrição e tradução [6] e o mecanismo exato de Mcl-1 sobre-expressão em cânceres orais não é conhecido. O pró-apoptótica Mcl-1S isoformas Mcl-1ES foram expressos a níveis baixos ou indetectáveis ​​em comparação com a predominantemente expresso Mcl-1 L e não se correlacionam com os parâmetros clínico de pacientes de cancro oral. Notavelmente, as curtas pró-apoptóticos Mcl-1S única liga-se a Mcl-1L possivelmente neutralizar a sua função anti-apoptótica [33]. Além disso, o recentemente identificado isoforma pró-apoptótica de Mcl-1ES também podem ligar-se e neutralizar a função anti-apoptótica de comprimento completo Mcl-1L isoforma, que é expressa em níveis muito baixos ou indetectáveis. Nós, portanto, analisaram os rácios relativos de MCL-1L /MCL-1S isoformas, que revelou uma correlação positiva significativa com os pobres sobrevida global dos pacientes, o que implica que a baixa expressão da MCL-1S Mcl-1ES em cancros orais é possivelmente insuficiente para neutralizar completamente a alta expressão de anti-apoptótica isoforma Mcl-1L. Para o melhor de nosso conhecimento, este é o primeiro estudo quantificar a expressão dos três Mcl-1 isoformas e sua correlação com os parâmetros clínico resultado de pacientes com câncer bucal. Nossos resultados também são suportados pelos relatórios anteriores em câncer gástrico e do colo do útero demonstrando a associação entre a expressão da proteína de alta Mcl-1 com o tamanho do tumor, grau histológico, comprometimento de linfonodos, metástase mau resultado clínico [11], [34]. Além disso, o significado prognóstico da expressão elevada de proteína de Mcl-1 também foi demonstrada em cancros da mama, do ovário, cancro do pulmão de células não pequenas e várias malignidades hematológicas [10], [13], [35].

Mcl -1 é sobre-expresso numa variedade de tumores malignos humanos e proposto para ser um potencial alvo terapêutico [8]. Mcl-1 sobre-expressão também parece ser um factor chave na resistência de vários tipos de cancro para os tratamentos convencionais, incluindo radioterapia e quimioterapia. A regulação para baixo de Mcl-1 tem sido mostrado para sensibilizar as células de neuroblastoma de células citotóxicas de quimioterapia e de melanoma resistente ao Fas apoptose mediada [36], [37]. Além disso, em nosso estudo, shRNA mediada baixo regulação da Mcl-1L tem mostrado chemosensitize células cancerosas orais (AW8507, UPCI: SCC040 UPCI: SCC029B) para Cisplatina indicando um papel crucial para Mcl-1 em resistência ao tratamento em cancros orais . Estudos de segmentação de Mcl-1 através de terapia anti-sentido também têm demonstrado que as células de carcinoma hepatocelular chemosensitize

in vitro

[38], [39]. Embora este estudo indica a depleção de expressão de Mcl-1 L de 90% a 20% por shRNA (4A) uma morte celular mínima (25%) foi observada. Isto sugere que, além de Mcl-1 pode haver outros fatores que contribuem para a sobrevivência das células após o tratamento Cisplatina. Vários outros estudos também relataram proteínas como Survivin [40], Oct4 Nanog [41], MUC4 [42], secretário Kin17 [43], etc. desempenhando um papel importante na chemoresistance de células de carcinoma epidermóide de boca. No entanto, este é o primeiro estudo que correlaciona a associação de Mcl-1L variante de processamento com chemoresistance de câncer oral.

Estudos recentes do nosso laboratório demonstraram um papel para Mcl-1L isoforma em radiorresistência de células de carcinoma epidermóide de boca e como fator prognóstico na predição de sobrevida livre de doença de pacientes com câncer bucal tratados com radioterapia definitiva. [15], [17]. Assim, a depleção de Mcl-1 parece ser um pré-requisito para rádio /quimio sensibilizar células cancerosas que sobre-expressam a proteína de Mcl-1, para promover a apoptose. Várias tentativas têm sido feitas para alvejar as proteínas da família de anti-apoptótica de Bcl-2, incluindo Mcl-1 em tumores usando uma variedade de inibidores. Entre estes, o inibidor mais promissora, um mimético de BH3 ABT-737 não foi capaz de ultrapassar a resistência, devido à sobre-expressão de Mcl-1. Novos estudos indicam que, Mcl-1 infra-regulação só pode potenciar ABT-737 letalidade em células de leucemia [44]. No presente estudo, uma panela de Bcl-2 inibidor de molécula pequena, Obatoclax (GX15-070) que é conhecida por antagonizar Mcl-1 e de Mcl-1 superar a resistência à apoptose mediada foi utilizado [21]. Obatoclax foi mostrado para sequestrar proteínas anti-apoptótica da família Bcl-2 e sobre-regular a expressão de PUMA, Noxas Bim que induziu ainda mais a apoptose em células neoplásicas mastro [45].