Humana

Abstract

via de sinalização EGFR-MEK-ERK tem um papel estabelecido na promoção do crescimento maligno e a progressão da doença em cancros humanos. Portanto identificação de alvos transcricionais que medeiam os efeitos oncogénicos da via EGFR-MEK-ERK seria altamente relevante. inibidor canceroso da proteína fosfatase 2A (CIP2A) é uma oncoproteína humana recentemente caracterizada. CIP2A promove o crescimento de células malignas e é sobre-expresso em alta frequência (40-80%) na maioria dos tipos de cancro humano. No entanto, os mecanismos que induzem a sua expressão no câncer ainda permanecem largamente inexplorado. Aqui nós apresentamos uma análise sistemática da contribuição de potenciais mecanismos regulatórios dos genes para a expressão alta CIP2A no câncer. Os nossos dados mostram que evolutivas ilhas CpG conservadas no promotor proximal CIP2A não são metilados, tanto em células normais e cancerosas. Além disso, a sequenciação da região promotora CIP2A activo de um total de sete tipos de células normais e malignas não revelou quaisquer alterações de sequência que aumentam a expressão CIP2A especificamente nas células cancerosas. No entanto, o tratamento de células cancerosas com vários inibidores da via de sinalização revelou que a expressão de ARNm CIP2A foi sensível à inibição da actividade de EGFR, bem como a inibição ou a activação de MEK-ERK via. Além disso, MEK1 siRNAs-específicos 2 /diminuição da expressão da proteína CIP2A. Série de construções CIP2A promotor-luciferase foram criados para identificar a região proximal -27 a -107 promotor responsável pela estimulação MEK-dependente de expressão CIP2A. mutagênese e cromatina experimentos adicionais imunoprecipitação revelou ETS1 como o fator de transcrição mediar a estimulação de expressão CIP2A através de via EGFR-MEK. Assim, ETS1 é provavelmente mediar expressão elevada CIP2A em cancros humanos com o aumento da actividade da via EGFR-MEK1 /2-ERK. Estes resultados também sugerem que, além de seu papel estabelecido na invasão e angiogênese, ETS1 pode apoiar o crescimento celular maligno através da regulação da expressão e proteína fosfatase 2A inibição CIP2A

Citation:. Khanna A, Okkeri J, Bilgen T, Tiirikka t, Vihinen H, Visakorpi T, et al. (2011) ETS1 Medeia MEK1 /2-Dependent superexpressão do Cancerous inibidor da proteína de fosfatase 2A (CIP2A) em células cancerosas humanas. PLoS ONE 6 (3): e17979. doi: 10.1371 /journal.pone.0017979

editor: Robert Oshima, SanfordBurnham Medical Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de novembro de 2010; Aceito: 17 de fevereiro de 2011; Publicado: 22 Março 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Khanna et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Academia da Finlândia (projetos: 217676 e 217675), Associação Internacional de Pesquisa do Câncer (projeto 08-0614), Fundação para o Instituto finlandês de Câncer (JW), Emil Aaltonen Foundation, Sigrid Juselius Foundation, o financiamento da investigação competitiva da Pirkanmaa Hospital District (projetos: 9K152 e 9L115), Programa de Pós-graduação Tampere em Biomedicina e Biotecnologia (AK), e A Científico e Tecnológico Conselho de Investigação da Turquia (TB). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados ou análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem

Introdução

a acumulação de várias alterações genéticas tem sido considerada como um pré-requisito para o desenvolvimento de câncer. Estas alterações genéticas muitas vezes resulta em sobre-expressão ou actividade de proto-oncogenes e de inibição da função do supressor de tumor [1], [2] .Portanto, a compreensão dos mecanismos pelos quais a actividade de ambos os proto-oncogenes e supressores tumorais é alterado de cancro é crucialmente importante, tanto academicamente, e para o desenvolvimento de novas abordagens para direccionar células do cancro para terapia.

epidérmico receptor do factor de crescimento (EGFR) mediada por actividade da via /2-ERK MAPK MEK1 tem sido demonstrado que regulam praticamente todas aspectos envolvidos na tumorigénese. Por conseguinte, o aumento da actividade e a sobre-expressão de ambos o EGFR e o MEK1 /2 cinases tem sido observado em vários cancros humanos [3], [4], [5], [6]. Além disso, inibidores de EGFR, e Raf MEK1 /2 quinases estão em ensaios clínicos contra vários tipos de tumores sólidos, [3], [4], [7], [8]. Curiosamente, o aumento da actividade da via de MEK1 /2, devido à hiperactividade de Ras e proteínas Raf também tem demonstrado contribuir para a resistência clínica a EGFR inibidor da tirosina quinase [4], [9], [10]. Estes resultados em conjunto indicam que a inibição da actividade da via tanto a nível do receptor, e os seus efectores a jusante podem ser necessários para uma terapia eficaz anti-cancro.

ETS família de factores de transcrição incluindo Elk1, ETS1 e ETS2 são alguns dos alvos bem-conhecidos para a via de sinalização de EGFR-Ras-MEK1 /2 [11]. ETS1 e ETS2 são ambos fosforilada pela sinalização de Ras [11], [12]. ETS1 é um membro da família fundadora de fatores de transcrição ETS-domínio. Ele tem sido associada a cancro, desde a sua identificação como uma fusão com o produto oncogénico de c-Myb proto-oncogene na E26 leucemia aviária vírus [13], [14]. ETS1 é conhecida para atingir uma ampla variedade de genes [11], [12], [15], que por sua vez determina o seu papel em vários processos celulares. Pertencente a ETS1 câncer é mais conhecido por seu papel na promoção da capacidade de invasão das células tumorais, motilidade e metástase [13], [16]. Invasão promoção do papel de ETS1 é pensada para ser mediada por transcrição a regulação de genes que participam na degradação da matriz extracelular e a estimulação da angiogénese [16]. Curiosamente, embora ETS1 e outros factores de transcrio ETS-família foram sobretudo relacionada com a invasão do tumor, logo após a clonagem de ETS1 humano, Seth e colaboradores demonstraram que ETS1 superexpressão células NIH3T3 transformadas tornando-os capazes de crescimento independente de ancoragem e o crescimento do tumor in nude ratinhos [17]. Mais recentemente, também foi mostrado que ETS1 promovido fenótipo transformado celular em células humanas assim [18], [19]. No entanto, os genes alvo envolvidas na transformação celular mediada pelo ETS1 são mal compreendidos.

cancerosas inibidor da proteína de fosfatase 2A (CIP2A) é uma oncoproteína humana recentemente caracterizada [20]. CIP2A interage com e inibe a proteína fosfatase 2A (PP2A) complexo supressor de tumor e, assim, inibe a desfosforilação e subsequente degradação proteolítica do factor de transcrição MYC [20], [21]. CIP2A promove a formação de focos de Ras-induzida em fibroblastos de embrião de rato e suporta a transformação de células humanas imortalizadas [20]. Na perda de estudos de função, a depleção CIP2A foi mostrado para reduzir o tamanho global de xenoenxerto de tumor em ratinhos nus [20], [22], e a prejudicar a clonogenicidade e crescimento independente de ancoragem de células de tumor [20], [22], [ ,,,0],23], [24], [25]. Recentemente, também foi mostrado CIP2A para inibir a actividade de PP2A associada-quinase Akt e por estes meios para proteger as células de carcinoma hepatocelular humano a partir apoptose induzida por bortezomib [26]. CIP2A é expressa apenas em alguns poucos tecidos normais, mas é sobre-expresso com incidência muito alta (40-80%) em vários tipos de cancro humanas, como cabeça e carcinomas de células escamosas do pescoço (CECP), carcinomas do cólon, carcinomas gástricos, carcinomas da mama e não -Pequena cancro do pulmão de células [20], [22], [23], [24], [25]. Em adição à sua sobre-expressão em cancros, estudos recentes têm demonstrado que a imunopositividade CIP2A correlaciona com doença agressiva e /ou sobrevivência pobre paciente em vários tipos de cancro [22], [23], [24]. Com relação à regulação da expressão CIP2A, temos até agora identificados MYC como um estimulador de expressão CIP2A [24]. No entanto, outros mecanismos que contribuem para o aumento da expressão CIP2A em cancros humanos continuam a ser evasivo.

No estudo atual, nós clonado região promotora CIP2A funcional e identificadas as regiões promotoras de mediação atividade transcricional alta CIP2A. Além disso, o uso de inibidores químicos para várias vias de sinalização e os siRNAs específicos visados, foi dissecada a função do EGFR-MEK1 /2 via na regulação da expressão CIP2A. Cromatina imunoprecipitação, mutagênese promotor e alvo siRNAs específicos foram então utilizados para identificar ETS1 como o fator de transcrição que regula EGFR-MEK1 /2-dependente expressão CIP2A em cancros humanos.

Resultados

análise bioinformática e metilação estatuto de CIP2A Promotor

Para iniciar uma análise sistemática dos mecanismos que regulam a expressão CIP2A, 1,8 sequência kb a montante do gene CIP2A local de início da transcrição previsto foi analisada utilizando o software Genomatix. A Figura 1A mostra o factor de transcrição previu locais de ligação, possuindo semelhança de matriz de 95% e uma semelhança de núcleo de 100%, em que a região genómica. Genomatix software também foi utilizado para obter a árvore filogenética do promotor CIP2A em diferentes espécies (Fig. 1B). Curiosamente, a análise da região do -1.500-450 pb com o software MethPrimer identificada uma ilha de CpG entre os nucleótidos -150 a +400 pb (azul região sombreada na Figura 1C). Importantemente, o alinhamento dos promotores CIP2A em espécies diferentes também revelou conservação de sequências ricas em CpG em que a região (Fig. S1A). A metilação dos locais de CpG nas regiões reguladoras dos genes, sugere que se correlacionam com o silenciamento transcricional. Por isso, foi colocada a hipótese de que a expressão CIP2A em tecidos normais e linhas de células [20], [22], [23], [25] pode ser silenciado devido à metilação do promotor. Para este fim, o estado de metilação da região -150 a 400 pb foram analisados ​​por sequenciação usando bissulfito. Amostras de DNA genômico recolhidos para a presente análise incluiu células recém-isoladas de sangue humano normal, os fibroblastos da pele humana cultivadas e células cancerosas cultivadas (AGS e HeLa). tratamento bissulfito do ADN genómico resultou na conversão de todas as citosinas na região promotora sequenciado para timidinas, em todas as amostras (Fig. 1D e a Fig. S1). Por conseguinte, uma vez que a metilação de ilhas CpG no promotor CIP2A não foi observada em células normais, é pouco provável que o promotor de-metilação poderia explicar o aumento da expressão em células cancerosas CIP2A.

. Identificação do factor de transcrição aos sítios com matriz de similaridade de 95% e uma semelhança de núcleo de 100% em CIP2A promotor -1802 pb usando o software Genomatix ligação. B. árvore filogenética que descreve a conservação evolutiva de promotor CIP2A. C. Identificação do putativo CpG Ilha de -150 pb para 400 pb (azul área sombreada) no promotor CIP2A usando software MethPrimer. D. Mostra os resultados da sequenciação do ADN genómico extraído a partir de sangue humano normal. Todos os locais de CpG (representados por blocos retangulares preto) que encontram-se no interior da ilha CpG foram convertidos de CG para TG quando tratadas com bissulfito, implicando, assim, que o promotor CIP2A nesses locais é não metilado.

Análise funcional e SNP de CIP2A promotor

polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) foram relatados para criar novo factor de transcrição sites sobre os promotores de genes de ligação. Especificamente, um estudo anterior demonstrou que um SNP de MMP-1 promotor criado um local de ligação ao ETS romance que a transcrição aumentada de MMP-1 em células cancerosas [27]. A fim de avaliar o estado de SNP do promotor CIP2A, uma região que contém o promotor CIP2A representado na Fig. 1A e o exão 1 (-1802 pb para 182 pb) foi sequenciado a partir de ADN genómico extraído a partir de sangue periférico humano normal, monócitos mononucleares não-malignas humanas (MN-50), fibroblastos normais humanos dérmicos (NHDFc), linha celular de fibrossarcoma humano ( HT1080), linha de células escamosas carcinoma de células (SCC7), linha de células de carcinoma cervical (HeLa) e linha de células de adenocarcinoma gástrico (AGS). Esta análise identificou vários SNPs na região analisada, mas apenas dois deles (T C a -592 em HeLa e G A a -1100 em SCC7) não foram encontrados a partir de todas as amostras normais (Fig. 2a). No entanto, como cada um destes dois SNPs foram encontrados apenas a partir de uma linha celular de cancro, mas não nos outros analisados, é improvável que eles iriam criar locais de ligação do factor de transcrição que aumentam a transcrição CIP2A geralmente no cancro. De nota, T C a -592 em células HeLa não foi documentado em bancos de dados

A.. Identificados polimorfismos de nucleotídeo único no -1.802-182 região de promotor CIP2A a partir de células indicadas. Duas alterações específicas linha celular de cancro foram observados, nomeadamente G /A a -1101 em linha de células SCC-7 e T /C a -592 na linha celular de HeLa. B. Ensaio de Luciferase Relativa que mostra a actividade relativa de -1802 pb do promotor CIP2A em comparação com os promotores oncogénicos bem conhecidos como EGFRLuc e 5xJunLuc. C. Ensaio de Luciferase mostram a comparação da actividade entre o tipo selvagem (WT) e promotor CIP2A os mutantes indicados SNP. D. ensaio de luciferase que mostra a actividade de promotores CIP2A indicados. alta actividade basal é mediada pela primeira 392 pb do promotor, a partir da qual, quase dois terços do que era devido ao primeiro 108 pb. B-D, Mostrado é a média + SD de três experiências independentes.

Para iniciar caracterização funcional de promotor CIP2A, -1802 pb para 182 pb 5 ‘região a montante do gene CIP2A que foi analisado para SNPs acima, foi clonado no vector para criar pGL4.10 CIP2A construção repórter de luciferase do promotor (-1802CIP2ALuc). A região promotora foi amplificado a partir do ADN genómico de células AGS, e este clone particular, abrigado nucleótidos A na posição -98 e T na posição -1487 (Fig. 2A). A fim de estimar a actividade transcricional relativa do fragmento de promotor clonado CIP2A, comparou-se a actividade de luciferase de -1802CIP2ALuc ao promotor /luciferase construções conhecidas como sendo activo em células de cancro. Como mostrado na Fig. 2B, atividade -1802CIP2ALuc era ou equivalente, ou claramente superior actividade da EGFRLuc [28] ou mínima 5xJunLuc [29] promotores respectivamente. Com base nesse resultado, concluímos que a clonado -1802 pb para 182 pb 5 ‘região a montante do gene CIP2A contém um promotor CIP2A ativa

Em seguida, a construção -1802CIP2ALuc foi utilizado para analisar se o SNPs 592 T C e 1100G A, acima identificados, foram funcionais. Para este fim, 592 T C e 1100G A mutações foram introduzidas para -1802CIP2ALuc por mutagénese específica de sítio e a actividade de construções mutantes foi comparada com o tipo selvagem em células 1802CIP2ALuc AGS. Em comparação com o tipo selvagem, não houve alteração visto na actividade de luciferase CIP2A com a 1100 G Um clone mutante, enquanto 592 T C clone mutante mostrou uma diminuição acentuada na actividade da luciferase (Fig 2C).

Finalmente, a fim de caracterizar as regiões no promotor CIP2A que medeiam a sua elevada actividade de transcrição, 5′-várias deleções do promotor /repórter foram clonados. A comparação das actividades basais destas construções de deleção em células AGS revelou que as regiões entre -392 e -1802 não parecem conter locais de ligação do factor de transcrição que contribuem grandemente para a actividade basal elevada de promotor CIP2A (Fig. 2D). Curiosamente, a actividade da luciferase de alta -392CIP2ALuc foi significativamente reduzida quando mais 57 nucleótidos foram eliminados resultando na construção -335CIP2ALuc (Fig. 2D). Isto parece ter sido causada pela exposição de um domínio de repressão de transcrição, tal como seguidamente eliminação de -335CIP2ALuc para -108CIP2ALuc resultou novamente em aumentou significativamente a actividade da luciferase (Fig. 2D). Curiosamente, este promotor CIP2A 108 pb foram responsáveis ​​por mais de 50% da actividade de luciferase produzida pelo -1802CIP2ALuc (Fig. 2D).

Tomados em conjunto, estes dados apresenta primeira análise funcional da região promotora CIP2A. Além disso, estes resultados sugerem fortemente que SNPs no promotor CIP2A não contribuem significativamente para CIP2A superexpressão no câncer.

Regulação da expressão CIP2A pelo EGFR-MEK1 /2 via

Os resultados acima sugerem que CIP2A expressão pode ser regulada de forma positiva por vias de sinalização que estimulam a sua actividade promotora do gene. Para abordar se conhecidas vias de sinalização oncogénicos tinha papel na regulação da expressão CIP2A, AGS células foram tratadas com os inibidores e activadores da via química bem definida. Enquanto que a inibição de qualquer um ou p38 de PI3-cinases de SB23580 ou LY294002, respectivamente, não regular em níveis de ARNm CIP2A, ambos inibidores de EGFR MEK1 /2 e (PD98059 e AG1478) a diminuição da expressão de ARNm CIP2A (Fig. 3A). Além disso, o tratamento das células com éster de forbol de TPA, um activador bem caracterizado da via de sinalização de MEK1 /2-ERK, a expressão aumentada de ARNm CIP2A mais de três vezes (Fig. 3A). Como mostrado na Fig. 3B, os efeitos de ambos AG1478 e TPA sobre a expressão do mRNA CIP2A já era evidente 6 horas após o tratamento o que sugere um modo de acção directa. De modo a mapear a região de promotor CIP2A que é responsiva à actividade da via EGFR-MEK1 /2, as células transfectadas com vários comprimentos de CIP2A construções do promotor de luciferase foram tratados com AG1478 ou TPA, e a actividade da luciferase, em comparação com o tratamento de controlo de DMSO, foi medida como uma leitura da actividade do promotor. Como mostrado nas Figs. 3C e D, o tratamento AG1478 diminuiu, enquanto o tratamento TPA aumentou a atividade da luciferase de todos, exceto o mais curto construção -27CIP2ALuc.

A. A análise quantitativa por PCR (qPCR) que mostra os níveis de ARNm CIP2A extraído de células AGS tratados com DMSO, SB23580 (20 uM), LY294002 (10 uM), PD98059 (20 uM), AG1478 (10 uM) e TPA (100 nM) em 24 h ponto de tempo. Enquanto uma diminuição no nível de ARNm CIP2A foi observada com PD98059 e AG1478 tratamentos, o tratamento com TPA os níveis aumentados de mRNA em células CIP2A AGS. B. Análise de qPCR mostrando regulação dependente do tempo dos níveis de ARNm em células CIP2A AGS tratados com DMSO, AG1478 (10 uM) e TPA (100 nM) para os pontos de tempo indicados. C e D de luciferase ensaios que mostram a actividade das deleções do promotor CIP2A indicado nas células tratadas tanto com DMSO, AG1478 (10 uM) ou TPA (100 nM) durante 24 h. (*,

P Art 0,05; n.s. = não significativo). B-D. É mostrada a Média + DP de três experiências independentes.

Tomados em conjunto, estes resultados mostram que a expressão está positivamente CIP2A regulated` pelo EGFR-MEK1 via 2 /e que a região sensível para as mentiras actividade da via entre -27 pb e -672 pb no promotor CIP2A.

Caracterização de MEK1 /2 quinase região sensível sobre o promotor CIP2A

a fim de validar a contribuição de MEK1 /2 cinases na regulação positiva da expressão CIP2A, as células foram tratadas com AGS UO126, um inibidor de MEK1 mais específico e potente /2 do que a PD98059 anteriormente utilizado, e a expressão da proteína foi estudada CIP2A 48 horas pós tratamento. Como mostrado na Fig. 4A, UO126 dependente da dose, a diminuição da expressão da proteína CIP2A. Além disso, dois diferentes ARNsi contra ambos MEK1 e MEK2 diminuição da expressão de proteína em células CIP2A AGS (Fig. 4B). É importante salientar os efeitos não foram linha celular específica quer como MEK1 /2 inibição expressão da proteína CIP2A inibida química ou à base de siRNA também em PC-3, linha celular de cancro da próstata (Fig. S2). Para diminuir a região MEK1 /2-sensível sobre o promotor CIP2A, AGS células transfectadas com uma série de construções repórter luciferase CIP2A foram tratados com UO126 (20 uM) e as actividades de luciferase foram medidas 48 horas após o tratamento. Em linha com os resultados observados com tratamentos AG1478 e TPA, diminuiu a actividade da luciferase de todos os outros constructos excepto o -27CIP2ALuc foi observado em células tratadas UO126 (Fig. 5a). Para restringir ainda mais a região de MEK1 /2-sensível sobre o promotor CIP2A, várias construções promotoras adicionais CIP2A luciferase foram clonados (Fig. 5B). A comparação das actividades basais destas novas construções em conjunto com as construções promotor seleccionado já analisado na Fig. 2D, ainda confirmado que existem duas regiões um promotor de activação repressivas no promotor CIP2A entre -27 pb e -400 pb (Fig. 5B). No entanto, independentemente da actividade basal do repórter, o tratamento UO126 inibiu a actividade de todos os repórteres, incluindo -108CIP2ALuc, com uma notável excepção do construto -27CIP2ALuc (Fig. 5C). Por conseguinte, estes resultados demonstram que MEK1 /2-cinases regulam positivamente a actividade do promotor tanto CIP2A e a expressão da proteína. Além disso, estes resultados identificam 81 pb entre -108 pb e -27 como uma região MEK1 /2-responsivos no promotor CIP2A.

A. Western blot mostrando efeito dependente da concentração de inibidor MEK específico, U0126, nos níveis de proteína CIP2A nas células AGS a 48 alínea h tempo. B. Western blot que mostra o efeito de ambos MEK1 e MEK2 siRNAs nos níveis de proteína CIP2A nas células AGS às 72 horas ponto de tempo.

A. ensaio de luciferase que mostra a actividade de diferentes promotores de comprimento CIP2A quando tratados com DMSO e U0126 (10 uM) durante 24 h, identificar a região sensível a MEK a situar-se entre -672 pb para -27 pb do promotor CIP2A. B. Ensaio de luciferase que mostra a actividade basal indicado promotores CIP2A. C. Ensaios de luciferase que mostra a actividade de diferentes promotores de comprimento CIP2A quando tratados com DMSO e U0126 (10 uM) durante 24 h, ainda mais estreitamento região sensível a MEK ser entre -108 e -27 pb do promotor pb CIP2A (*,

P Art 0,05; **,

P Art 0,00; ns = não significativo). Mostrado é a média + SD de três experiências independentes.

EGFR-MEK1 /2 via regula a expressão CIP2A através ETS1

A fim de identificar o fator (s) de transcrição mediando o estimulador efeitos de EGFR-MEK1 /2 caminho na regulação da expressão CIP2A, nós revertido para a análise bioinformática feito para a região entre -27 pb para -108 pb (Fig. 1A). Fora dos factores de transcrição previstos para se ligarem a esta região, ETS1 tem um papel estabelecido como um efector a jusante da MEK1 /2 via de [11], [12]. Portanto, o próximo criado mutantes para estes locais ETS1 e comparou a actividade de luciferase do -108CIP2ALuc construções de abrigar as mutações ao do tipo selvagem. Os dois locais ETS e a estratégia de mutação está representada na fig. 6A, B. Tal como mostrado na Fig. 6C, a mutação de qualquer um dos locais de ETS1 diminuiu drasticamente a actividade do promotor CIP2A. Para investigar se ETS1 medeia a regulação CIP2A MEK1 /2-dependente, células transfectadas com o tipo selvagem e mutante ETS1 (local 1) construções -108CIP2ALuc foram tratados com AG1478, UO126 ou TPA. Enquanto a actividade -108CIP2ALuc tipo selvagem foi significativamente inibida por AG1478 (Fig. 6D) ou UO126 (Fig. 6E) e, inversamente, activados por TPA (Fig. 6F), o promotor ETS1 mutante não responder significativamente a estes tratamentos.

A. Diagrama esquemático do fragmento de 108 pb do promotor CIP2A que mostra a localização de dois locais de ligação ETS1 previu que se sobrepõem. B. Os resultados da sequenciação de ETS-1 mutantes local de ligação do promotor CIP2A criado usando mutagênese. A sequência no topo representa a sequência de tipo selvagem (ler de 5 ‘para a extremidade 3’), enquanto que a sequência abaixo representa a sequência mutada (ler de 5 ‘para a extremidade 3’). A mudança induzida na sequência é mostrado dentro da caixa retangular. C. ensaio de luciferase comparando a actividade de qualquer tipo selvagem -108CIP2ALuc ou indicado ETS ligação mutante local -108CIP2ALuc constrói. D, E F. Os ensaios de luciferase, comparando a actividade de qualquer tipo selvagem ou -108CIP2ALuc ETS1 Local1 mutante -108CIP2ALuc constrói após o tratamento com DMSO, AG1478 (10 uM; D), UO126 (10 uM; E) ou TPA (100 nM; F) durante 24 h. (*,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01; n.s. = não significativo). É mostrada a média + SD de três experiências independentes.

Em conjunto, estes resultados identificam dois locais ETS1 funcionais do promotor CIP2A proximal. Além disso, estes resultados sugerem fortemente que a estimulação /2-MEK1 dependente da actividade do promotor CIP2A é mediada por factores de transcrição ETS-família.

ETS1 liga-se ao promotor CIP2A e regula a sua expressão em células cancerosas

para verificar que as proteínas não ETS ligar ao promotor CIP2A em MEK1 /2 forma dependente da actividade, foi realizada a experiência de imunoprecipitação com o anticorpo cromatina ETS1 e amplificação do pb -66 a +20 fragmento pb do promotor CIP2A. Como mostrado na Fig. 7A, ETS1 imunoprecipitação resultou no processo de enriquecimento de cerca de 4 vezes de CIP2A promotor ocupação, em comparação com o controlo de IgG. Curiosamente, na mesma experiência CIP2A enriquecimento foi ainda mais forte do que UNQ9419, um alvo ETS1 estabelecido que foi utilizado como um controlo positivo [30]. Além disso, o enriquecimento do promotor CIP2A foi significativamente inibida pelo tratamento das células com U0126. Além disso, enquanto que a inibição da CIP2A enriquecimento por UO126 foi estatisticamente significativa, a inibição de enriquecimento UNQ9419 não foi (Fig. 7A).

. ensaio de imunoprecipitação da cromatina de se ligar ao promotor ETS1 CIP2A em DMSO ou UO126 células tratadas. promotor UNQ9419 é mostrado como um controlo positivo. (*,

P Art 0,05; **,

P Art 0,01; n.s. = não significativo). ensaio B. luciferase comparando a actividade de qualquer tipo selvagem -1802CIP2ALuc ou indicado ETS ligação mutante local -1802CIP2ALuc constrói. C, D E. A análise de transferência de Western dos níveis de proteínas e CIP2A ETS1 em qualquer AGS (C), as células transfectadas com mexidos PC-3 (D) ou LNCaP (E) (SCR.) ou ETS-1 siRNAs específicos durante 72 h.

os resultados acima demonstraram que elementos ETS mediam em grande parte basal e atividade MEK-suscitou de promotor -108CIP2ALuc mínima (Fig. 6). A fim de determinar se estes elementos ETS são essenciais para a actividade do promotor de comprimento completo CIP2A mutado que estes locais no -1802CIP2ALuc e a sua actividade em comparação com a do tipo selvagem. Como mostrado na Fig. 7B, a mutação de qualquer um dos locais de ETS1 diminuiu drasticamente a actividade do promotor -1802CIP2ALuc. Além disso, a fim de verificar que ETS1 regula a expressão da proteína endógena CIP2A, dois diferentes ARNsi específico para ETS1 foram transfectadas em células e lisados ​​celulares AGS foram imunotransferidas 48 horas depois para CIP2A, ETS1 e os níveis de actina. Como mostrado na Fig. 7C, uma diminuição dos níveis de proteína CIP2A foram observados com ambos os siRNAs específicos ETS1. Além disso, ETS1 regulada positivamente CIP2A expressão em linhas celulares de cancro da próstata LNCaP (Fig. 7e) PC-3 (Fig. 7D) e. Juntos, estes resultados fornecem evidência experimental de betão ETS1 sendo o factor de transcrição mediar EGFR-MEK1 /2 regulação dependente de CIP2A em células cancerosas.

Finalmente, de modo a revelar se o status de EGFR-MEK-ETS1 expressão componentes da via e CIP2A em cancros humanos, que se refere à base de dados Oncomine (www.oncomine.org). Esta análise revelou M6 subtipo de leucemia mielóide aguda como um tipo de cancro em que CIP2A e genes representativos de cada nível da via (EGFR, MEK2 e ETS1) foram significativamente regulada positivamente em dois estudos de leucemia genoma de largura diferentes [31], [32] ( Fig 8)

A, B, C .. D. database analysis Oncomine de perfis de expressão de gene para genes da via EGFR-MEK-ETS1 revelou M6 subtipo de leucemia mielóide aguda como um tipo de cancro em que CIP2A e genes representativos de cada nível da via são significativamente regulada positivamente (**,

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Discussão

a caracterização sistemática recente de mutações somáticas em 441 tumores humanos identificados receptor do factor de crescimento de sinalização para MEK1 via /2-ERK para ser um dos as vias mais significativamente alterados através de cancros humanos [33]. Além disso, a inibição da forma oncogénica de B-Raf em melanomas malignos humanos por uma pequena molécula inibidora demonstrada eficácia clínica já muito promissora no estudo clínico fase I [7]. Com base nos resultados destes estudos e ampla dos dados anteriores demonstram função oncogénica da activação da via de MEK1 /2-ERK mediada por EGFR, é evidente que a identificação de efectores oncogénicas da atividade da via é importante. Neste estudo foi demonstrado que CIP2A é um novo alvo oncogénica regulada positivamente pela actividade da via de MEK1 /2-ERK induzida por EGFR. Após a sua clonagem original [34], e a caracterização funcional adicional [20], CIP2A foi demonstrada para promover o crescimento de células malignas utilizando vários modelos de células de cancro humano [20], [22], [23], [24], [25 ]. Além disso, a proteína CIP2A tem sido mostrado a ser sobre-expressa com uma frequência muito elevada em diferentes tipos de malignidades humanas. Exceto câncer humano de mama, onde CIP2A é sobre-expresso em 40% das amostras dos pacientes [22], em todos os outros tipos de câncer estudados a freqüência é entre 65 a 87% dos pacientes [20], [23], [24], [25]. Isso faz com que a sobre-expressão CIP2A em conjunto com a activação da via de MEK1 /2-ERK como uma das alterações mais frequentes em cancros humanos. No entanto, antes do presente estudo, os mecanismos através dos quais a expressão CIP2A é induzida em células cancerosas humanas foram muito mal compreendidos.

De modo a identificar os mecanismos responsáveis ​​pela elevada expressão basal de CIP2A em células de cancro humanas, temos neste estudo analisou sistematicamente contribuição de vários mecanismos reguladores potencial de genes que foram mostrados anteriormente para afectar a expressão do gene em cancros humanos. Embora não tenhamos exclusivamente excluir que seja promotor metilação ou SNPs funcionais no promotor CIP2A pode contribuir para a alta expressão de CIP2A em câncer, nossos dados não indicam que esses mecanismos, muito provavelmente, não são relevantes para a regulação da atividade do promotor CIP2A. A fim de identificar as regiões de promotor funcionalmente envolvidos na regulação da expressão CIP2A em células cancerosas, que criado um total de 10 promotoras construções repórter eliminação. Os dados apresentados nas figuras 2D e 5B permitiu-nos concluir que a região do promotor entre -335 pb e -392 pb contém um forte elemento promotor de activação, Considerando que a região entre -108 pb e -204 pb contém um elemento repressor forte. Além disso, os dados mostram, que a região promotora a montante de -417 pb não contribuem de forma significativa para a elevada actividade basal do promotor CIP2A estudado em células AGS, enquanto que, a região do promotor entre -27 e -108 pb pb tem um elemento activador muito forte representando, pelo menos, 50% do total da actividade do promotor de -1802 pb. Para além da regulação do promotor, um outro mecanismo importante que contribui para a expressão da proteína é a modificação da sua vez sobre a taxa ou a sua estabilidade. CIP2A foi previamente demonstrado ser muito longa vida proteína em linha de células de carcinoma hepatocelular [26]. Portanto, a elucidação dos mecanismos que contribuem para a estabilidade CIP2A em células cancerosas será uma questão relevante a ser abordada no futuro.

Nossos experimentos posteriores com o promotor CIP2A identificados dois sítios de ligação ETS, se sobrepõem entre -60 pb para