Abstract

Fundo

2-zinco-glicoproteína 1 (AZGP1) é uma proteína multidisciplinar que participa em muitos funções importantes no corpo humano, incluindo a fertilização, imunorregulação e mobilização de lipídios. Recentemente, tem sido mostrado que AZGP1 também está envolvido na carcinogénese e na diferenciação do tumor. Neste estudo, nós investigamos os níveis de expressão e valor prognóstico da AZGP1 em cancros gástricos primários.

Métodos e Resultados

Foi examinada a expressão de AZGP1 em 35 emparelhado mucosa gástrica benigno adjacente canceroso e combinados por tecidos em tempo real quantitativa de RT-PCR (qRT-PCR) e western blotting. Além disso, analisamos a expressão AZGP1 em 248 pacientes submetidos a procedimentos de ressecção entre 2005 e 2007, utilizando imuno-histoquímica. As relações entre os níveis de expressão AZGP1, os fatores clínico-patológicos e sobrevida dos pacientes foram investigados. AZGP1 expressão foi significativamente reduzida em ambos os ARNm (

P

= 0,023) e os níveis de proteína (

P

= 0,019) em amostras de tecido de tumor, em comparação com a expressão em amostras de tecido não-tumorais adjacentes emparelhados . Os dados de coloração imuno-histoquímica mostrou que a expressão AZGP1 foi significativamente diminuído em 52,8% (131/248) dos casos de adenocarcinomas gástricos. análise clínico-patológica mostrou que a redução da expressão de AZGP1 foi significativamente correlacionada com a localização do tumor (

P

= 0,011), grau histológico (

P

= 0,005) e do estádio T (

P

= 0,008). curvas de sobrevida de Kaplan-Meier revelou que a redução da expressão de AZGP1 foi associada a um mau prognóstico em pacientes de adenocarcinoma gástrico (

P

= 0,009). Multivariada Cox análise identificou expressão AZGP1 foi um fator prognóstico independente para sobrevida global dos pacientes de adenocarcinoma gástrico (HR = 1,681, IC 95% = 1,134-2,494,

P

= 0,011).

Conclusões

O nosso estudo sugere que AZGP1 pode servir como um supressor de tumor candidato e um potencial biomarcador de prognóstico na carcinogênese gástrica

Citation:. Huang Cy, Zhao Jj, Lv L, Chen Yb, Li Yf, Jiang Ss, et al. (2013) diminuição da expressão de AZGP1 está associada com mau prognóstico no câncer gástrico primário. PLoS ONE 8 (7): e69155. doi: 10.1371 /journal.pone.0069155

editor: Alfons Navarro, da Universidade de Barcelona, ​​Espanha |

Recebido: 05 de março de 2013; Aceito: 05 de junho de 2013; Publicação: 23 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Fundo de Doutorado do Ministério da Educação da China (20100171110084). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é a segunda causa mais comum de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo, com 988.000 novos casos e 736,000 mortes por ano [1] – [2]. Na China, câncer gástrico foi previsto para ser o terceiro câncer mais comum em 2005, com 0,4 milhões de novos casos e 0,3 milhões de mortes relatados [3]. O tratamento do cancro gástrico inclui uma combinação de cirurgia, quimioterapia e terapia de radiação. Mas quase 60% dos pacientes afetados sucumbir ao câncer gástrico após uma ressecção curativa isoladamente ou após uma ressecção curativa com a terapia subsequente adjuvante [4]. O câncer gástrico é uma doença heterogênea, tanto a histologia ea genética; portanto, o resultado do paciente é difícil de prever usando classificações histológicos clássicos. carcinogênese gástrica é um processo multifatorial e várias etapas que envolve a ativação de oncogenes e inativação de genes supressores de tumor em diferentes fases de progressão do cancro gástrico. Recentemente, vários novos oncogenes e genes supressores de tumor associado com o cancro gástrico foram identificados. Portanto, é clinicamente importante encontrar eficientes novos alvos para o diagnóstico precoce e tratamento eficaz de câncer gástrico.

AZGP1 (2-zinco-glicoproteína 1, Zn-alfa 2-glicoproteína) é uma proteína solúvel 41 kDa com um complexo principal de histocompatibilidade-1 (MHC-1) -like dobra na sua estrutura, e foi inicialmente identificado e purificado de soro humano em 1961 [5]. O gene para AZGP1, atribuído ao cromossoma 7q22.1 através cariotipagem hibridação fluorescente, é constituído por quatro exões e intrões três [6], [7]. Utilizando estudos de imuno-histoquímica, verificou-se que AZGP1 é expresso principalmente nas células epiteliais da mama, da próstata, do fígado e de outros órgãos gastrointestinais [8]. Em linha com a sua produção por células epiteliais secretoras, AZGP1 é encontrado em vários fluidos corporais [9], [10], [11].

AZGP1 é uma proteína multidisciplinar que participa em muitas funções importantes no corpo humano, incluindo a fertilização [11], immunoregulation [12] e mobilização de lipídios [13], [14], [15]. AZGP1 também está associada a caquexia cancerosa. AZGP1 tem um nível elevado de amino-ácido de homologia de sequência com o factor-a mobilização de lípidos derivadas de tumores [14], e num modelo de ratinho de tumores produtores de AZGP1, AZGP1 estimulada lipólise em adipócitos que conduzem a caquexia [16]. Recentemente, tem sido mostrado que AZGP1 também está envolvido na carcinogénese e na diferenciação do tumor. ensaios de proteínas e expressão de mRNA têm mostrado uma relação entre os níveis AZGP1 eo grau histológico de tumores de câncer de mama [17], [18]. Além disso, diversos estudos sugerem que AZGP1 é um potencial marcador de soro de cancro da próstata [9], [19]. Além disso, tem sido mostrado que actua como AZGP1 um romance supressor de tumor no cancro pancreático [20]. No entanto, até agora o estatuto de AZGP1 e valor prognóstico desta proteína em cânceres gástricos primários expressão não foram relatados.

Neste estudo, foram analisados ​​o nível de expressão AZGP1 em cânceres gástrico, utilizando em tempo real RT quantitativa -PCR (qRT-PCR), transferência de western e imuno-histoquímica. Além disso, foi identificada a relação entre a expressão AZGP1 e as características clínico-patológicas do câncer gástrico, e avaliamos o valor prognóstico da expressão AZGP1 para a sobrevivência pós-ressecção de pacientes com câncer gástrico.

Resultados

mRNA AZGP1 Expressão Analisado com qRT-PCR

Os níveis de transcrição de AZGP1 foram determinados com ensaios de qRT-PCR usando 35 pares de espécimes ressecados (amostras de tecido do tumor e amostras de tecidos não tumorais adjacentes combinados) de pacientes com câncer gástrico. Os níveis de ARNm AZGP1 foram significativamente reduzidos em amostras de 28 (80%) de tecido de tumor em comparação com as amostras de tecido não-tumoral adjacentes correspondentes (

P

= 0,023, Figura 1).

A expressão relativa de AZGP1 em tecidos tumorais do cancro gástrico em comparação com tecidos não tumorais adjacentes (n = 35) avaliada por qRT-PCR (

P

= 0,023).

AZGP1 Expressão Analisado por Western Blotting

os níveis de proteína AZGP1 nas amostras de cancro gástrico ressecados foram determinados por western blotting. Os resultados mostraram uma banda para AZGP1 a 41 kDa, e a quantidade de proteína presente AZGP1 foi medida por densitometria e altura. Consistente com os resultados de qRT-PCR, uma diminuição na expressão AZGP1 foi observada em 25 (71,4%) dos tecidos de tumor gástrico em comparação com os tecidos não tumorais adjacentes correspondentes (

P

= 0,019, Figura 2A). Oito pares de tecidos de tumor gástrico representativos e os tecidos não tumorais adjacentes combinados foram mostrado na Figura 2B.

(A) Os níveis de expressão de proteína AZGP1 relativa era significativamente diminuído nos tecidos de cancro gástrico em comparação com o não-anexa adaptada tecidos tumorais (n = 35,

P

= 0,019); (B) Os resultados representativos de análise western blot da expressão da proteína AZGP1 em oito tecidos de câncer gástrico (T) e os tecidos não tumorais adjacentes correspondentes (N).

Análise imunohistoquímica da expressão AZGP1 em Câncer Gástrico as amostras de tecido e sua relação com o clinico-patológica Características

a fim de confirmar as descobertas da biologia molecular e investigar os clinicopatológicas os papéis prognóstico da expressão AZGP1, foi realizada análise imuno-histoquímica em 248 seções câncer gástrico embebidos em parafina. A expressão positiva de AZGP1 foi localizado no citoplasma (Figura S1). Entre as 248 amostras de cancro gástrico, 117 (47,2%) apresentaram expressão elevada AZGP1 (AZGP1 ++ ou AZGP1 +++), ao passo que os restantes 131 casos (52,8%) mostraram baixa expressão AZGP1 (AZGP1- ou AZGP1 +) (Figura 3, Tabela 1). tecidos gástricos normais mostrou a coloração positiva forte AZGP1 (Figura 3A)

(A) tecidos gástricos normais, pontuada como AZGP1 (+++);. (B) cancro gástrico, pontuada como AZGP1 (+++) ; (C) cancro gástrico, pontuada como AZGP1 (++); (D) cancro gástrico, pontuada como AZGP1 (+); cancro gástrico e (E), marcado como AZGP1 (-). ampliação original: A – D × 200.

Com base nas categorias que definimos nos métodos acima mencionados, os dados mostraram que a baixa expressão da AZGP1 foi significativamente correlacionada com a localização do tumor (

P

= 0,011), grau histológico (

P

= 0,005) e do estádio T (

P

= 0,008), mas não com a idade, sexo, tamanho do tumor, radical ressecção, estado nodal (fase N) ou o estado de metástase (M palco). As micrografias são mostrados na Figura 3.

Correlação entre AZGP1 Expressão Baseado em imuno-histoquímica e paciente sobrevivência

O tempo médio de sobrevivência dos 248 pacientes com câncer gástrico foi de 45 meses (intervalo de 2-89 meses) . A taxa de sobrevida global ea taxa de sobrevida em 5 anos foram significativamente melhorados no grupo alta expressão AZGP1 que o grupo de baixa expressão [64,2% vs. 49,5% (taxa de sobrevida global) e 65,1% vs. 50,4% (taxa de sobrevida em 5 anos), respectivamente,

P

= 0,009, Figura 4].

expressão baixa de AZGP1 correlacionada com a sobrevivência pobre paciente. Os pacientes no grupo de expressão alta AZGP1 exibiu significativamente melhor sobrevida do que o grupo de baixa expressão AZGP1 (log-rank test:

P =

0,009).

uni e multivariada Análises

uni e multivariadas foram realizadas para comparar o impacto de expressão AZGP1 e outros parâmetros clínico-patológicos no prognóstico. Com base em uma análise univariada, que incluiu todos os 248 pacientes, 8 fatores foram encontrados para ter associação estatisticamente significativa com a sobrevida global. Esta análise levou seguintes fatores em consideração: a localização do tumor, tamanho do tumor, grau histológico, os níveis de expressão AZGP1, estágio TNM (7ª edição classificação TNM) e se ou não uma ressecção radical foi realizada (Tabela 2). Todos os 8 fatores foram incluídas em um modelo de riscos proporcionais de Cox multivariada para ajustar os efeitos das covariáveis. Com base neste modelo, a localização do tumor, os níveis de expressão AZGP1, estágio T e estágio N do tumor foram confirmadas como fatores prognósticos independentes (Tabela 2).

Discussão

gástrica câncer continua sendo um dos males humanos mais mortais. Mesmo com os avanços no diagnóstico e terapêutica, o prognóstico para câncer gástrico ainda é sombrio [1], [21]. O resultado clínico do cancro gástrico depende de uma série de características de tumor, tais como crescimento tumoral, diferenciação, invasão e metástase distante, os quais são regulados por uma variedade de genes relacionados. Por conseguinte, considera-se geralmente que as alterações genéticas que conduzem à activação de oncogenes e a inactivação de supressores tumorais são as causas subjacentes da patogénese do cancro. O ganho sequencial de oncogenes e perda de supressores de tumor fornecer a base necessária para a progressão passo a passo de tumores sólidos do início até a transformação e progressão do tumor [22], [23], [24]. Anteriormente, AZGP1 foi reportado como possuindo propriedades supressoras de tumores em cancro da mama, cancro da próstata, cancro do pâncreas e alguns outros tumores malignos [17], [20], [25]; no entanto ainda não foi avaliado o papel da AZGP1 no câncer gástrico primário. O nosso estudo indicou que a expressão AZGP1 foi significativamente reduzida em ambos os níveis de mRNA e proteína em amostras de tecido de tumor, em comparação com a expressão em amostras de tecido não-tumorais adjacentes emparelhados. Consistente com nosso estudo, Brysk MM et al. também demonstraram que os níveis AZGP1 são mais elevados em tecidos orais normais do que em tumores oral [26]. Gagnon S et al. Também se mostrou que AZGP1 estava presente em glândulas hiperplásicas benignas em 91,1% dos casos, mas em apenas 40,7% (componente pouco diferenciado) a 48,5% (bem diferenciada componente) de adenocarcinomas prostáticos e apenas 8% de metástases [27]. Os resultados deste estudo apoiam a hipótese de que AZGP1 pode servir como um supressor do tumor em alguns tipos de cancro.

Para validar ainda mais esta redução de expressão AZGP1 no cancro gástrico primário, foi realizada a análise imuno-histoquímica com um anticorpo anti-coelho hAZGP1. Observamos menor expressão de AZGP1 imunocoloração no câncer gástrico proximal ou total em comparação com os tecidos de câncer gástrico distantes. Alguns estudos têm demonstrado que pacientes com câncer gástrico proximal têm uma sobrevida pior do que pacientes com câncer gástrico distantes [28]. Estes dados sugerem que a baixa expressão da AZGP1 no cancro gástrico está associada com fenótipos mais malignas. Além disso, descobrimos que a diminuição da expressão de AZGP1 foi associada com adenocarcinomas pouco diferenciados (G3 vs G1 /G2), indicando que AZGP1 pode induzir a diferenciação de cancro gástrico. Estes resultados são consistentes com os achados de Diez et al. [17], [18] que descrevem uma associação entre a expressão elevada AZGP1 e altos níveis de diferenciação no cancro da mama. Achados semelhantes também foram relatados para câncer de próstata [19], câncer de mama e câncer pancreático [26]. Além disso, verificou-se que a baixa expressão da AZGP1 foi associada com o estádio T avançado. Estes resultados implicaram que a baixa expressão da AZGP1 pode promover o crescimento tumoral. De acordo com o nosso estudo, Irmak S et al. sugerido que AZGP1 está relacionada com o desenvolvimento de cancro superficial da bexiga e a sua transformação para um fenótipo invasivo [29]. Estes resultados indicam coletivamente um papel importante para AZGP1 na diferenciação e crescimento do câncer gástrico.

Usando a análise de sobrevivência de Kaplan-Meier, pacientes em nosso estudo com baixa expressão AZGP1 apresentaram uma sobrevida global significativamente menor do que aqueles com alta os níveis de expressão. Análises univariada mostrou que a diminuição da expressão de AZGP1 em tecidos com câncer gástrico foi significativamente associada com a taxa de sobrevida global ea taxa de sobrevida em 5 anos. A análise multivariada mostrou que a expressão AZGP1, juntamente com alguns fatores prognósticos tradicionais, como a localização do tumor, estágio T e estágio N, foram fatores de risco independentes no prognóstico dos pacientes com câncer gástrico. Estes resultados sugerem que AZGP1 pode servir como um novo indicador de prognóstico em pacientes com câncer gástrico após a ressecção cirúrgica.

Os mecanismos moleculares de propriedades supressoras tumorais do AZGP1 ainda não estão claros. AZGP1 pertence à família macroglobulina, uma ligação antiga e evolutivamente conservador do sistema imunitário. Zorin NA et ai. sugerido que a capacidade de macroglobulinas para hidrolases de ligação faz com que a inibição da invasão tumoral mediada por enzima possível [30]. Ao mesmo tempo, um excesso de complexos macroglobulina /hidrolase pode activar a apoptose [31]. Ele N et al. relataram que AZGP1 também sub-regula-quinase dependente de ciclina, que é responsável pela regulação da transição G2-M, um passo limitante da velocidade no ciclo celular. Isto sugere que AZGP1 indirectamente desempenha um papel na progressão tumoral impedindo [32]. AZGP1 foi proposto como um supressor tumoral no câncer de pâncreas por Kong B. et al. O estudo sugere que o gene AZGP1 induz transdiferenciação mesenquimais-a-epitelial, pela inibição da sinalização de ERK TGF-b-mediada [20]. O papel funcional e mecanismos de AZGP1 no câncer gástrico precisam de uma investigação mais aprofundada.

Em conclusão, nós investigamos primeiro os níveis de expressão e valor prognóstico da AZGP1 em cancros gástricos primários deste estudo. Os resultados do estudo sugerem que AZGP1 pode servir como um supressor tumoral e candidato biomarcador prognóstico em cancros gástricos primários e ser um alvo potencial para a intervenção terapêutica; No entanto, os mecanismos moleculares envolvidos na regulação da AZGP1 em warrants câncer gástrico uma investigação mais aprofundada.

Declaração de Materiais e Métodos

Ética

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética Sun Yat-sen University Cancer Center, e consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente envolvido no estudo.

Human Tissue Sample

s

Um total de 35 emparelhado cancerosa e combinados não cancerosos tecidos da mucosa gástrica adjacentes foram coletadas de pacientes com câncer gástrico submetidos a gastrectomia a Sun Yat-sen University Cancer Center, de 2010 a 2011. Após a ressecção cirúrgica, os tecidos frescos foram imediatamente imersos em RNAlater (Ambion, Inc., EUA) para evitar degradação de ARN, armazenado a 4 ° C durante a noite para permitir a penetração completa de RNAlater para o tecido e, em seguida, congeladas a -80 ° C até a extracção de ARN e proteína foi realizada. Mais de 248 amostras de carcinoma embebidos em parafina primários gástricos que tinham sido recolhidas entre 2005 e 2007 foram obtidos a partir da Sun Yat-sen University Cancer Center. Nenhum destes pacientes tinha recebido radioterapia ou quimioterapia antes da cirurgia. O tipo histológico e estágio do câncer gástrico foram determinados de acordo com os critérios da classificação da Organização Mundial da Saúde e do estágio TNM estabelecidos pela União de Controle do Câncer International.

Extração de RNA total e quantitativa em tempo real RT-PCR

o ARN total foi extraído utilizando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. A concentração de ARN total foi determinada medindo a absorvância a 260 nm utilizando um espectrofotómetro NANO gota (ND-1000, Thermo Scientific, EUA). A transcrição reversa (RT), para sintetizar a primeira cadeia de cDNA foi realizada utilizando 2 ug de ARN total tratado com M-MLV de transcriptase reversa (Promega, EUA) de acordo com as recomendações do fabricante. O ADNc resultante foi depois submetido a em tempo real quantitativa de RT-PCR para a avaliação dos níveis de ARNm relativos de AZGP1 e GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato, como um controlo interno) com os seguintes iniciadores: para a frente AZGP1: 5′-GGAAGCAGGACAGCCAACTT -3 ‘, e reverso: 5′-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3′; GAPDH para a frente: 5’-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ‘, e reverso: 5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3’. a amplificação específica do gene foi realizada utilizando um sistema em tempo real de PCR ABI 7900HT (Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA) com uma mistura de PCR de 15 uL contendo 0,5 uL de ADNc, 7,5 ul de 2 × SYBR Green Master Mix (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA), e 200 nM de iniciadores oligonucleotídicos apropriados. A mistura foi pré-aquecido a 95 ° C (10 min) e, em seguida, amplificado a 95 ° C (30 s) e 60 ° C (1 min) durante 45 ciclos. A curva de resolução foi medida a 95 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 15 seg e 95 ° C durante 15 seg. O valor de Ct (limiar de ciclo) de cada amostra foi calculada a partir dos ciclos de limiar com o software do instrumento (SDS a 2,3), e a expressão relativa de ARNm AZGP1 foi normalizada para o valor de GAPDH. Os dados foram analisados ​​utilizando o ciclo limiar comparativa (2

-ΔCt) como o seguinte fórmula: nível de expressão relativa = 2

-ΔCt = 2

-Ct (GAPDH) – 2

-Ct (AZGP1), em que Ct (GAPDH) significa que o valor Ct de GAPDH e Ct (AZGP1) significa que o valor Ct de AZGP1.

Análise técnica Western Blot

as amostras com câncer gástrico homogeneizadas, incluindo tecidos tumorais e não tumorais, foram lisadas em tampão de lise RIPA, e os lisados ​​foram colhidos por centrifugação (12.000 rpm) a 4 ° C durante 30 min. Aproximadamente 20 ug amostras de proteína foram então separadas por electroforese num gel de poliacrilamida de sulfato de dodecilo de sódio a 12% e transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno. Depois de bloquear os sítios de ligação não específicos durante 60 minutos com 5% de leite não gordo, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com um anticorpo monoclonal de coelho contra AZGP1 (PTG Company, EUA, a uma diluição 1:200). As membranas foram então lavadas três vezes com TBST (soro fisiológico tamponado com Tris com Tween-20) durante 10 min e sondaram-se com a peroxidase de rábano (HRP) de anticorpo IgG de coelho anti-caprino conjugado (Imunologia Consultants Laboratory, EUA, a uma 1: diluição de 2000) a 37 ° C durante 1 hora. Após três lavagens, as membranas foram desenvolvidas por um sistema de quimioluminescência aumentada (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, EUA). A intensidade da banda foi medido por densitometria utilizando o software Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA). Os níveis de proteína foram normalizados para que de GAPDH detectado utilizando um anticorpo de rato GAPDH monoclonal anti-humano (Xangai Kangchen, China, a uma diluição 1:10000).

Análise Imunohistoquímica

As secções de tecido foram desparafinadas e reidratadas com dimetilbenzeno através de 100%, 95%, 90%, 80% e 70% de etanol. Após três lavagens em PBS (solução salina tamponada com fosfato), os slides foram fervidas em tampão de recuperação de antigénio contendo 0,01 M de citrato de sódio de ácido clorídrico (pH = 6,0) durante 15 min num forno de microondas. Após lavagem com PBS, as secções de tecido foram incubadas com o anticorpo primário e, em seguida, as lâminas foram lavadas em solução de peroxidase de têmpera 3% (Invitrogen) para bloquear a peroxidase endógena. As secções foram então incubadas com um anticorpo monoclonal de coelho contra AZGP1 (PTG Company, EUA, a uma diluição 1:200) a 4 ° C durante a noite e, em seguida, incubadas com peroxidase de rábano (HRP) (DAKO ChemMateTM EnVisionTM Detecção Kit) à temperatura ambiente durante 30 minutos. Após lavagem em PBS, o sinal de visualização foi desenvolvido com 3, solução de 3′-diaminobenzidina (DAB), e todas as lâminas foram contrastadas com hematoxilina. Como controlos negativos, seces adjacentes foram processados ​​tal como descrito acima, excepto que eles foram incubadas durante a noite a 4 ° C em solução de bloqueio, sem o anticorpo primário.

As amostras foram analisadas por três observadores (Chunyu Huang, Lin LV, e Jingjing Zhao) que estavam cegos para os resultados clínicos dos pacientes. Discrepâncias entre os observadores foram encontrados em menos de 10% das lâminas examinadas, e um consenso foi alcançado após uma análise mais aprofundada. A pontuação total AZGP1 imunocoloração foi calculada como a soma da percentagem de positividade (a percentagem de células de tumor coradas positivamente) e a intensidade da coloração. A percentagem de positividade foi marcado como “0” ( 5%, negativo), “1” (5-25%, esporádica), “2” (25-50%, focal), ou “3” ( 50 %, difusa). A intensidade da coloração foi marcado como “0” (sem coloração), “1” (fracamente coradas), “2” (moderadamente coradas), ou “3” (fortemente manchado). A pontuação total de imunocoloração AZGP1 variou de 0 a 9. Nós definidos os níveis de expressão AZGP1 da seguinte forma: “-” para uma pontuação de 0-1, “+” para uma pontuação de 2-3, que foram definidos como baixa expressão; “++” Para uma pontuação de 4-6, e “+++” para uma pontuação . 6, que foram definidos como alta expressão

Follow-Up

O acompanhamento pós-operatório -up foi realizado em nosso ambulatório e incluiu exames clínicos e laboratoriais a cada 3 meses para os primeiros 2 anos, a cada 6 meses durante o terceiro ao quinto ano, e anualmente por mais 5 anos ou até a morte do paciente, o que ocorrer primeiro. A sobrevivência global, o qual foi definido como o tempo de operação para a morte do paciente ou o último seguimento, foi usado como uma medida de prognóstico. Havia cerca de 4% dos pacientes perderam o seguimento.

Análise Estatística

A-amostras teste t pareado foi utilizado para comparar os níveis de mRNA AZGP1 nas amostras de tecido do tumor e da não-adjacentes amostras de tecido de tumor. O

χ

2 teste para proporção e coeficientes de correlação de Pearson foram utilizados para analisar a relação entre a expressão AZGP1 e várias características clínico-patológicas. As curvas de sobrevida global foram calculados com o método de Kaplan-Meier e foram analisados ​​com o teste de log-rank. Cox análise de risco proporcional foi utilizado para análise uni e multivariada para explorar o efeito das variáveis ​​clínico-patológicas e expressão AZGP1 na sobrevivência. A dois lados

P

-valor 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o software SPSS (versão 17.0; SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).

Informações de Apoio

Figura S1.

detecção da imuno-expressão da proteína no tecido AZGP1 câncer gástrico. A expressão positiva da AZGP1 foi localizada para o citoplasma

doi:. 10.1371 /journal.pone.0069155.s001

(TIF)