Abstract

Fundo

genes

Relógio conduzir cerca de 5-15% da expressão de mRNA de todo o genoma, e interrupção do relógio circadiano podem desregular funções biológicas normais da célula. Criptocromo 1 é um regulador chave do ciclo de feedback circadiano e desempenha um papel importante nos organismos. O presente estudo foi realizado para investigar a expressão de Cry1 e seu significado prognóstico no câncer colorretal (CRC). Além disso, a função de Cry1 CRC no humano foi investigado em modelos de cultura celular.

Métodos

-PCR em tempo real quantitativo, análise de transferência de Western e imuno-histoquímica foram usadas para explorar expressão na célula Cry1 CRC linhas e amostras clínicas primárias CRC. Os ensaios de MTT e a formação de colónias foram usadas para determinar os efeitos sobre a capacidade de proliferação celular. O modelo animal foi utilizado para explorar o impacto Cry1 sobre a capacidade do tumor celular proliferação

in vivo

. Transwell ensaios foram realizados para detectar a capacidade de migração das linhas celulares. As análises estatísticas foram aplicados para avaliar o valor diagnóstico e as associações de expressão Cry1 com parâmetros clínicos.

Resultados

expressão Cry1 foi-se regulada na maioria das linhas celulares de CRC e 168 primária CRC clínica amostras ao nível da proteína. análise patológica clínica mostraram que a expressão Cry1 foi significativamente correlacionada com metástase ganglionar (

p

= 0,004) e do estágio TNM (

p

= 0,003). expressão alta Cry1 foi associado à sobrevida global pobre em pacientes com CCR (

p

= 0,010). Experimentalmente, verificou-se que a regulação positiva de Cry1 promoveu a proliferação e migração de células HCT116, enquanto que a regulação negativa da Cry1 inibiu a formação de colónias e migração de células SW480.

Conclusões

Esses resultados sugerem que Cry1 provavelmente desempenha um papel importante no desenvolvimento e progressão CRC andCry1 pode ser um biomarcador prognóstico e um alvo terapêutico promissor para CRC

Citation:. Yu H, Meng X, Wu J, Pan C, Ying X, Zhou Y, et al. (2013) cryptochrome 1 superexpressão se correlaciona com a progressão do tumor e mau prognóstico em pacientes com câncer colorretal. PLoS ONE 8 (4): e61679. doi: 10.1371 /journal.pone.0061679

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 10 Janeiro, 2013; Aceito: 13 de março de 2013; Publicação: 23 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Programa de Pesquisa básica Nacional da China (973 Programa, No. 2011CB504805, No. 2010CB52994), do National Science Foundation Natural da China (30.973.448) e Guangdong Recrutamento Programa do Grupo de Pesquisa Criativa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os ritmos circadianos são oscilações diárias em vários processos biológicos. Nos últimos anos, a regulação do ritmo circadiano tornou-se melhor compreendida. O mecanismo molecular de oscilações circadiano no núcleo supraquiasmático (SCN) e células periféricas é baseado nos loops de feedback de oito genes circadianos do núcleo [1], [2]:

PERIOD1 (Per1)

,

período2 (Per2)

,

Period3 (Per3)

,

Relógio

,

Bmal1

,

A caseína quinase I ε (CKIε)

,

Cryptochrome1 (Cry1) e Cryptochrome2 (cry2)

. Entre os oito genes, os Crys acumulam no citoplasma e, em seguida, entrar no núcleo, promovendo a formação de complexos Per /Cry /CK1ε estáveis. Uma vez no núcleo, os Crys separar o /complexo transcricional associada-Relógio Bmal1, resultando na inibição da Cry e por transcrição e a desrepressão de Bmal1 transcrição. O relógio molecular dos tecidos periféricos coordena a transcrição dos genes circadianos. Os genes circadianos são em grande parte determinado tecido e ligar as principais funções dos tecidos para o meio ambiente circadiano, permitindo que estas funções importantes para estar disponível em horários específicos quando eles são mais necessários [3], [4], [5].

Nos mamíferos, cerca de 5-15% da expressão de ARNm de todo o genoma é impulsionado por genes circadianos, incluindo reguladores do ciclo celular chave (como

ciclina D1

), oncogenes, e supressores tumorais, tais como

C -myc

e

WEE-1 | (uma espécie quinase que bloqueia a divisão celular) [6]. Interrupção do relógio circadiano pode desregular funções biológicas celulares normais e têm efeitos significativos na saúde humana, provocando doenças tais como distúrbios do sono, gastrointestinal e doenças cardiovasculares e depressão. O relógio circadiano também está associada com um aumento da incidência de vários cancros epiteliais [7], [8], [9], [10], [11], [12]. Em modelos de ratinhos, tumores transplantados crescer duas vezes mais rapidamente em ratinhos SCN-lesionados como em animais lesionados de forma simulada [13]. Estes resultados sugerem que existe uma estreita ligação entre a organização circadiano eo desenvolvimento de vários cancros. As relações entre genes e circadianos do cancro tem sido demonstrada nos últimos anos. O relógio circadiano hospedeiro tem sido relatada a desempenhar um papel importante no controlo da progressão do tumor endógeno [14] .Cry1, um membro da família do criptocromo, tem sido demonstrado ser essencial para o braço negativo do circuito fechado de realimentação circadiano [15] , [16].

o câncer colorretal (CRC) é uma das três principais causas de mortalidade relacionada ao câncer em todo o mundo [17]. pacientes com CCR freqüentemente desenvolvem metástases linfáticas durante as fases iniciais da doença. Durante os estádios avançados, a maioria dos pacientes também desenvolvem fígado, pulmão e metástases peritoneu. Os fatores envolvidos na CRC metástases são desconhecidos; No entanto, a desregulação dos processos moleculares é considerado para resultar no crescimento e metástase de CRC. Por conseguinte, a importância de marcadores que promovem o desenvolvimento de CRC tem sido enfatizada, pois eles podem fornecer alvos terapêuticos [18], [19].

No entanto, os estudos que avaliam as relações de expressão Cry1 às características e resultados clinicopatológicos no cancro colorectal não têm sido relatados. Nós, portanto, avaliou os níveis de expressão Cry1 em tecidos de cancro colo-rectais humanos e combinados mucosa não-tumoral e analisado o significado clínico dos pacientes inCRC expressão Cry1. Nossos dados demonstram que a expressão Cry1 é significativamente correlacionada com a fase TNM e status do nó de linfa. Assim, Cry1 pode servir como um novo marcador de diagnóstico e alvo terapêutico para a terapia CRC.

Materiais e Métodos

Pacientes e acompanhamento

Cento e sessenta e oito colorectal pacientes com câncer de todas as fases TNM no Centro de Câncer de Sun Yat-sol University entre setembro de 1999 e dezembro de 2005 foram incluídos no estudo. Dez tecidos emparelhados das 168 amostras foram utilizados para um ensaio q-PCR.

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Cancer Center Comitê de Ética Sun Yat-sen University Ética e consentimento informado por escrito foi obtido de todos dos pacientes.

os dados clínicos, incluindo idade, sexo, tamanho do tumor, localização do tumor, os níveis de antígeno carcinoembrionário pré-operatório (CEA) e antígeno de carboidrato 19-9 níveis (CA 19-9), foram coletadas de caso não transformados relatórios.

parâmetros patológicos, tais como tumor profundidade invasiva, grau de diferenciação e padrão histológico foram coletados a partir de relatórios patológicos e verificado por patologistas. Os pacientes foram acompanhados a cada três meses para os primeiros dois anos, uma vez a cada seis meses durante os terceiro e quarto anos, e uma vez por ano após o quinto ano pós-operatório.

Todos os pacientes foram contatados por telefone para verificar o seu estado de saúde; a última data de acompanhamento foi de 01 de março de 2012. A sobrevida livre de doença (DFS) e sobrevida global vezes (OS) foram calculados a partir da data de operação para a metástase ou recorrência data ou a data da morte, ou a última vez censor.

cultura celular

as linhas celulares de CRC humanos SW480, SW620, HCT116, HT29, a linha celular de rim embrionário humano GP293 e a linha de células do epitélio do cólon normal, FHC foram obtidas a partir da American Type Culture Collection . As células THC8307 foram obtidos a partir de nossa própria coleção de laboratório. As linhas celulares de CRC foram cultivadas em DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS; Invitrogen, Carlsbad, CA). As células FHC foram cultivadas em meio DMEM: F12 contendo 0,005 mg /ml de insulina, 10 ng /ml de toxina da cólera, 100 ng /ml de hidrocortisona e de 0,005 mg /ml de transferrina e suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 ng de estreptomicina /ml e 100 U /ml de penicilina. Todas as linhas celulares foram cultivadas numa câmara humidificada com 5% de CO

2 e a 37 ° C.

quantitativa de transcrição reversa-PCR

O ARN total foi extraído utilizando o Reagente TRIzol ® (DSBIO, Cantão, China) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado a partir de 2 ug de ARN total, utilizando M-MLV de transcriptase reversa (Promega, Madison, WI). O ADNc foi amplificado por polimerase AmpliTaq® DNA Gold (Applied Biosystems, Foster, CA) e iniciadores específicos de gene. Os seguintes iniciadores foram utilizados para Cry1, 5′-GAGTATGATTCTGAGCCCTTTG-3 ‘(para a frente), 5′-GGTTGTCCACCATTGAGT-3’ (inverso). GAPDH foi usada como um controlo interno.

análise de Western Blot

proteínas celulares totais foram extraídas e separadas em géis de SDS-PAGE e análise Western Blot foi realizada de acordo com procedimentos padrão. GAPDH foi usada como um controlo de carga sobre a mesma membrana. Os anticorpos primários que foram usados ​​incluíram monoclonal anti-Cry1 (1:1000, Abcam, EUA) e anti-GAPDH (1:2000, Santa Cruz Biotechnology, EUA). As proteínas foram visualizadas usando o procedimento ECL (Amersham Biosciences, EUA).

celular transfecção

A sequência de codificação de Cry1 foi amplificado e clonado no

NotI

e

BamHI

local de pcDNA3.1

+ para gerar um pcDNA3.1

+ – Cry1 expressar vector; A construção resultante foi confirmada por sequenciação. Cry1 siRNA (GCAAGAGAAUUUGCUUAAUTT) e controle de siRNA (UUCUCCGAACGUGUCACGUTT) foram adquiridos a partir de Xangai Genepharma Co. Ltd. (Xangai, China).

Para a transfecção transitória, SW480 células (6 × 10

5 células por poço) e células HCT116 (5 × 10

5 culas por po) foram semeadas em placas de 6 poços a 60% de confluência e transfectadas com 100 nM de oligonucleótidos ou 4 ug de plasmídeo, utilizando Lipofectamine 2000 ((Invitrogen) de acordo com o fabricante do instruções. Após 6 h de incubação a 37 ° C, o meio de transfecção foi substituído com 3 ml de meio completo contendo 10% de FBS. as células foram recolhidas para ensaios blot, proliferação e invasão ocidentais em momentos diferentes.

Retrovirus embalagem e transdução

Cry1 e controlsequences foram clonados no

Xho

I e

Cla

Eu local do vector. embalagem Virus pLNCX2 Retrovirus foi realizada em células GP293. células GP293 foram cultivadas em DMEM com FBS a 10% num banho a 37 ° C incubadora com 5% de CO

2. Quarenta e oito horas após a transfecção, o sobrenadante foi recolhido por centrifugação a 1000 g durante 10 min. As células HCT116 foram transduzidas com o retrovírus contendo as sequências de controlo Cry1 ou plasmídeos. Quarenta e oito horas após a infecção, a G418 (600 ug /ml) foi adicionado ao meio durante 2 semanas para seleccionar as células estáveis ​​infectados com retrovírus. Os ensaios de transferência de Western foram usadas para detectar a expressão de Cry1 em duas linhas celulares estáveis, como descrito acima

A viabilidade celular ensaio

O 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il). – 2, ensaio de 5-bifenil brometo de tetrazólio (MTT) foi utilizado para detectar a proliferação de células. As células HCT116 foram plaqueadas em 96 poços a 1 × 10

3 células /poço. A absorvância espectrofotométrica de cada amostra foi medida a 490 nm. Todos os experimentos foram repetidos três vezes, e os resultados médios foram calculados.

Para o ensaio de formação de colónias, as células HCT116 (4 × 10

3 células por 10 cm

2 placa) superexpressão Cry1or GFP controle e células SW480 (5 × 10

3 células por 10 cm

2 placa) regulada negativamente para a expressão de Cry1 por siARN ou um controlo negativo foram cultivadas em meio completo. As células foram cultivadas durante 14 dias a 37 ° C em 5% de CO

2 ar humidificado. A formação de colónias e crescimento foram visualizados por coloração violeta cristal. O número de colónias contendo foram determinadas 50 células, e 12 campos foram contadas

In vitro

migração ensaio

A capacidade de migração das células foi medida em transpo� câmaras. (8 de poro; BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). A câmara inferior foi preenchida com 700 ul de DMEM contendo 10% de FBS. Para o ensaio de migração, as células de tumor (1 × 10

5 células em um volume total de 200 ul) foram colocadas na câmara superior e incubadas a 37 ° C em 5% de CO

2 ar humidificado. Após 24 h em cultura, as células sobre a superfície superior da membrana não-migração foram removidos, e as células que migraram para o lado de baixo da membrana de policarbonato foram fixadas com etanol e coradas com violeta de cristal durante 10 minutos. O número de células que migram foi então determinada a partir de 5 campos microscópicos independentes. A média de ensaios em triplicado para cada condição experimental foi utilizada para análise.

imuno-ensaio

A expressão de Cry1 em tumores primários e adjacente mucosa colorrectal benigno e foram examinadas utilizando um ensaio de imuno-histoquímica. O ensaio imuno-histoquímica foi realizada no prazo de cinco dias de preparação seção. As secções de parafina foram cortadas para uma espessura de 4 hum e montadas em lâminas silanizadas. As secções foram então desparafinados, re-hidratados e bloquearam-se com peróxido de hidrogénio a 0,3%. antigénios de tecido foram recuperadas com um forno de microondas de 95 ° C durante 25 minutos e arrefecida até à temperatura ambiente em tampão 10 mmol /citrato de sódio (pH 6,0). Cada fatia foi, em seguida, lavou-se com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e incubadas durante a noite a 4 ° C com Cry1 (1:400, ab54649 clone, Abcam, Cambridge, Reino Unido). Os anticorpos primários foram diluídos através da redução de fundo componentes (S2022, Dako, Glostrup, Dinamarca). O anticorpo secundário foi utilizado com o Kit de Detecção de Envision (Dako). As lâminas foram coradas em 2 min com diaminobenzidina tetrahidrocloreto (DAB) e, em seguida, contrastadas com hematoxilina. Tecido tratado com a solução de diluição de anticorpo foi utilizada como um controlo negativo. Todos os controles produziu resultados satisfatórios.

Avaliação da coloração

Os espécimes foram avaliados por dois pesquisadores, que desconheciam o resultado clínico e que, independentemente avaliaram as lâminas coradas. Cada lâmina foi avaliada em microscopia de × 200 ampliação. A expressão de Cry1 foi avaliada utilizando H-scores. Os H-score consistiu de uma avaliação da intensidade de coloração e a percentagem de área de coloração tendo uma dada intensidade. Apenas as células malignas coradas foram avaliadas. As amostras foram agrupados em quatro categorias com base na intensidade da coloração nuclear: nenhum (0), fraca (1), média (2) e forte (3). A soma indexado foi obtido pela multiplicação do grau de intensidade pela percentagem de área de coloração.

O nível de expressão Cry1 foi dicotomizado de acordo com a DFS e OS por uma curva ROC. O valor de corte da taxa positiva foi a soma maximizado dos pontos de sensibilidade e especificidade.

In vivo

ensaios de proliferação

Babl /c ratos atímicos fêmea ( 4-5 semanas de idade) foram adquiridas da Província do animal Medical Centro de Guangdong (Guangdong, China). Todos os estudos com animais foram conduzidos inaccordance com useguidelines animais NIH e os regulamentos chineses atuais e standardson o uso de animais de laboratório. Para determinar a capacidade de proliferação da célula linesstably alta expressando Cry1

In vivo

, um total de 1 x 10

6 células foram injectadas subcutaneamente no lado esquerdo de ratinhos nus e o grupo de controlo negativo foram injectados no direita (n = 9). O volume do tumor foi avaliada utilizando a seguinte fórmula:. Tumorvolume = 4π /3 × (largura /2)

2 × (/2 comprimento) .Four semanas após a injecção, os animais foram sacrificados

A análise estatística

Todos os dados são apresentados como média ± SEM, a menos que indicado de outra forma. A emparelhado

t

teste foi usado para testar as diferenças na expressão Cry1 entre tumor combinados e mucosa benigna. A significância estatística dos

in vitro

estudos foram analisados ​​utilizando Estudante de

t

-teste. Log-Rank testes da igualdade entre os sobreviventes de Kaplan-Meier e foram utilizados para desenhar as curvas de sobrevivência de alta contra pontuações baixas Cry1 IHC (conforme definido pela curva ROC). Todos

p valores

foram em frente e verso, e

P Art 0,05 foi o nível de significância estatística. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando software SPSS, versão 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).

Resultados

Características dos pacientes e tumores

Um total de 168 pacientes que receberam ressecção radical entre janeiro de 1999 e dezembro de 2005 foram estudados. As características de todos os pacientes estão resumidas na Tabela 1. A idade média dos pacientes era de 54,6 anos (DP, 14,3). A mediana de duração de seguimento foi de 84 meses (variação, 4-146). Oitenta e cinco tumores (50,6%) estavam localizadas no cólon. Dez dos 168 tumores (6,0%) foram T1 ou T2. Noventa e quatro tumores eram TNM fase I-II (56.0.0%). O número mediano de nódulos linfáticos colhidos era 19 (intervalo de 0 a 48). Cry1 níveis de expressão de proteína foram utilizados para análise imuno-histoquímica. Cry1 foi corado principalmente no citoplasma e regiões nucleares das células. a expressão da proteína alta Cry1 foi detectado em amostras de 101 (60,1%) e coloração fraca ou negativa foi observada em 67 amostras de tumores (39,9%, Figura 1).

imagens imunohistoquímicos representativos de amostras de tecido de cancro colorrectal indicando negativos ou fracamente Cry1 coloração detectável (A e B); Cry1 coloração moderada (C); e coloração Cry1 forte (D) são mostrados. Ampliação é × 200 (A, B, C e D).

Cry1 é overexpressed em tecidos de câncer colorretal

expressão de mRNA Cry1 no cancro colorectal foi investigado utilizando RT- PCR; análises de mRNA Cry1 foram executados em dez pares de amostras de cancro colo-rectal e amostras de tecidos não cancerosos adjacentes. Cry1 ARNm foi expresso em níveis mais elevados em oito das amostras de tecido de cancro colorrectal do que em tecidos cancerosos adjacentes. A elevada expressão diferencial variou de 1,1 vezes para 13,1 vezes (Figura 2D). De acordo com estes dados, a proteína Cry1 foi também até regulamentada em câncer colorretal em comparação com as amostras de tecido de controle pareados (Figura 2A-C).

(A) Uma imagem representativa de coloração Cry1 em tecidos de cancro colorrectal é mostrado. (B) uma imagem representativa de coloração Cry1 em tecidos cancerosos adjacentes é mostrado. (C) Cry1 nível de expressão da proteína foi maior em tecidos de tumor em comparação com o tecido adjacente de controlo como detectado por imunotransferência (média ± SEM; n = 109; * **,

P

0,001). rácios (D) média T /N de expressão de ARNm de Cry1 no cancro colo-rectal emparelhado (T) e tecidos normalmucosa (N) foram quantificados por qPCR e normalizadas para GAPDH. As barras de erro representam o desvio padrão da média (DP) calculado a partir de três experiências em paralelo. Ampliação é × 200.

Associação entre a expressão Cry1 e variáveis ​​clinicopatológicas

A associação de expressão e clinicopatológicas variáveis ​​Cry1 foi ainda analisada. expressão Cry1 e todos os outros parâmetros clínico-patológicos foram dicotomizadas em dois grupos. Os resultados estão resumidos na Tabela 1. Houve uma correlação significativa entre a expressão Cry1 e tanto o estágio TNM (

p

= 0,003) e linfonodo status (

p

= 0,004).

entre os 168 pacientes com câncer colorretal, nenhuma correlação significativa foi encontrada entre a expressão Cry1 e sexo, idade, localização da massa primária, o tamanho do tumor, grau de diferenciação do tumor, tipo histológico, no pré-operatório CA 19-9 ou nível de CEA (

p

. 0,05)

Associação entre a expressão Cry1 e sobrevivência

A aplicação de expressão Cry1 como um marcador de prognóstico para pacientes com CCR também foi investigado. No final do período de acompanhamento (1 de março de 2012), 32 pacientes morreram de doenças relacionadas com o cancro colorectal. A taxa de sobrevivência de cinco anos de DFS foi de 74,7% para o grupo de alta expressão Cry1. Esta taxa foi significativamente menor do que a taxa de sobrevivência (89,1%) para o grupo de baixa expressão (

p

= 0,011). Da mesma forma, a taxa de sobrevivência de cinco anos de OS foi de 77,6% no grupo de alta expressão Cry1 e 92,3% no grupo de baixa expressão (

p

= 0,010) (Tabela 2 e Figura 3).

curvas de Kaplan-Meier, com análise univariada (log-rank) para pacientes com câncer colorretal com alta expressão Cry1 (n = 101) em comparação com baixa ou nenhuma expressão Cry1 para a sobrevida global (n = 67) (a) e livre de doença sobrevida (n = 67) (B) são mostrados. maior expressão de Cry1 positivamente correlacionada com os patientoutcomes pobres.

Cry1 é altamente expresso na maioria das linhas celulares de CRC

Para investigar o papel potencial da Cry1 na tumorigênese do cancro colo-rectal, da expressão de ARNm e proteína Cry1 foi determinada durante cinco linhas celulares de CRC (SW480, HT29, SW620, THC8307 e HCT116) e uma linha de células de cólon epitélio normal, FHC. a expressão de ARNm Cry1 foi no máximo de 10 vezes mais elevada nas linhas celulares de cancro colorrectal do que no FHC células (Figura 4A). proteínas Cry1 foi altamente expressa em linhas celulares de cancro colo-rectais e apenas fracamente expressos nas células FHC (Figura 4B).

A expressão de ARNm e proteína Cry1 em linhas celulares de cancro colorrectal (SW480, SW620, HT29, THC8307, e HCT116) e FHC foram examinados por qPCR (A) e Western blot (B). Os níveis de expressão foram normalizadas para GAPDH. As barras de erro representam o desvio padrão da média (DP) calculado a partir de três experiências em paralelo, *,

P

0,05

Cry1 promove o crescimento do tumor e proliferação

em seguida, foram investigados os efeitos de manipulação Cry1 (através de ganho-de-função e perda de função) sobre a proliferação de células cancerosas.

exogenamente super-expresso Cry1 nas células HCT116, que tem um menor expressão endógena. O impacto de Cry1 sobre a proliferação celular foi então avaliada utilizando MTT e ensaios clonogénicos. Os resultados mostraram que a superexpressão de Cry1 pode promover a proliferação celular em células HCT116 transfecção instantânea (

P

0,001, Figura 5B.). Em contraste, o grupo de controlo não mostrou qualquer efeito significativo na proliferação celular. Os ensaios de formação de colónias também mostrou que a sobre-expressão de Cry1 aumentou significativamente o número de colónias formadas após 14 dias de cultura em comparação com as células de controlo (

P

= 0,033, Fig. 5C, D). A ligação entre Cry1 e crescimento de células de câncer colorretal foi ainda estabelecida utilizando ensaios de formação de colónia após Cry1 knockdown. Como mostrado na Figura 5E e 5F, knockdown da expressão endógena Cry1 por siRNA resultou em uma inibição dramática da formação de clones de células SW480 (

p = 0,007)

os níveis de proteínas Cry1 (A) foram regulada positivamente em células HCT116 e regulados negativamente em células SW480. (B) Os ensaios de MTT sobre células HCT116 24, 48, e 72 h após a transfecção com Cry1 ou controlo de GFP (***, p 0,001). (C-D) ensaio de formação de colónias de células HCT116 transfectadas com Cry1 ou controlo GFP (*,

p

= 0,033). (E-F) A inibição da capacidade de formação de colónias de células SW480 por Cry1 siARN em relação ao controlo (**,

P

= 0,007). As experiências foram repetidas pelo menos três vezes, e os dados representativos são apresentados;

bares

, SD *,

P

. 0,05; **,

P Art 0,01, ***,

p

. 0,001

Cry1 promove themigration de células de câncer colorretal

Como para a expressão Cry1 foi associado com o estado de nó de linfa, o efeito de Cry1 sobre a migração de células de cancro colorrectal foi explorada usando o ensaio Transwell para examinar os efeitos da sobre-expressão ou supressão Cry1. Nos ensaios de Transwell, células HCT-116 transfectadas com plasmídeos de controlo Cry1 ou GFP foram semeadas para dentro das câmaras, e o seu potencial de migração foi determinada 24 h após a transfecção. Os ensaios mostraram que a capacidade de migração de células que sobre-expressam Cry1 HCT116 foi aumentada em 112%, em comparação com as células de controlo (

P

= 0,019, Fig. 6A).

(A) Os ensaios de migração de As células HCT-116 transfectadas com GFP de controlo ou Cry1. (N = 3, *,

P

= 0,019) (B) Os ensaios de migração de células SW480 transfectadas com ARNsi Cry1 ou um controlo negativo. (N = 3, ***,

P

0,001). Imagens representativas são mostrados acima, e o número médio de células por campo nos pontos de tempo indicados, são mostrados abaixo. Os dados são a média de três experiências independentes.

Confirmação de que Cry1 promoveu a migração de células de cancro colorrectal foi avaliada pela transfecção de células SW480 com Cry1 siRNA ou siRNA negativo. Após 24 h de cultura, a capacidade de migração dos knock-as células Cry1 SW480 foi reduzida em 52,4% em comparação com as células de controlo (

p

. 0,001, Fig 6B).

cry1 promoveu o crescimento CRC

in vivo

Para investigar ainda mais as propriedades oncogênicas do cry1

in vivo

, construímos um overexpressingCry1 retrovírus vector e estabeleceu duas linhas de células estáveis, que foram chamado ctrl-HCT116 e Cry1-HCT116 (Fig. 7A). Estas duas linhas de células foram injectedsubcutaneously nos flancos de ratinhos nus. a progressão do tumor foi estudado ao longo do tempo. Em 4 semanas pós-implantação, os ratos foram sacrificados e os tumores foram removidos. Como shownin fig. 7B-C, o volume e peso dos tumores resultantes da injecção de células Cry1-HCT116 foram significativamente maiores e mais pesadas do que as originadas a partir das células-ctrl HCT116. Takentogether, estas observações são consistentes com os

in vitro

resultados e indicam que Cry1 tem a capacidade de promover o crescimento celular CRC

in vivo

.

(A) A expressão de cry1 foi significativamente aumentada na linha celular estável cry1-HCT116 comparado com o controle estável linha de células ctrl-HCT116. GAPDH foi usada como um controlo interno. (B) Imagens representativas de tumores derivados de Cry1-HCT116 ou ctrl-HCT116, após transplantes de xenoenxertos subcutâneos em ratinhos nus (C) A superexpressão de Cry1 promoveu o crescimento do cancro colorectal. As células tumorais foram injectadas subcutaneamente em ratinhos nus. Os ratinhos foram sacrificados após 4 semanas, e o volume de cada tumor foi medido a cada 4 dias. Bares, ± SEM; *

P Art 0,05, **

p = 0,01

Discussão

Para o nosso conhecimento, este é o primeiro estudo a. avaliar os níveis de expressão de proteína de Cry1 em câncer colorretal humano. Claramente, Cry1 expressão foi maior em tecidos cancerosos e células do que nos tecidos e células normais. Também estudou a relação dos níveis de expressão de Cry1 para os resultados dos pacientes e características clínico-patológicas. Nossos resultados sugerem que a superexpressão do gene Cry1 poderia ser um preditor útil de metástases em linfonodos, estadiamento TNM e maus resultados em pacientes com câncer colorretal.

Vários estudos anteriores compararam os níveis de expressão de Cry1 entre tecido canceroso e adjacente mucosa normal. Um estudo descobriu que Cry1 e outras gene circadiano (cry2, Per2 e BamlI) níveis de expressão de mRNA foram semelhantes em câncer de cólon e mucosa normal adjacente [20]. Outro estudo descobriu que os níveis de cry2 e Per2 expressão de mRNA foram regulados em cancro colo-rectal. Este estudo também constatou maior expressão Cry1 na mucosa tumor de cânceres localizados em segmentos colorretais distais. níveis Cry1mRNA em tecidos CRC também foram significativamente associados com a idade e sexo do paciente [21]. No cancro epitelial de ovário humano, Cry1 nível de expressão de ARNm era claramente superior em tecidos cancerosos do que em tecidos normais [22]. Nossos resultados estão em desacordo parcial com esses estudos. No nosso estudo, Cry1 níveis de expressão do gene de proteína foram mais elevados em tecidos cancerosos do que em tecido não canceroso adjacente. Os mesmos resultados foram encontrados em células de tumor colorectal e células normais, e a sobre-expressão de Cry1 foi encontrada para promover o crescimento e a migração em células de tumor colorectal. No entanto, nenhuma correlação significativa foi encontrada entre a expressão Cry1 e sexo, idade, localização da massa primária, o tamanho do tumor, grau de diferenciação do tumor, tipo histológico, CA 19-9 no pré-operatório ou nível de CEA (

p Art 0,05). Estes resultados parecem ser razoável para o seguinte motivo. Os níveis de expressão de proteínas Cry1 pode ser inconsistente associado com os níveis de expressão de mRNA para esses factores ambientais. No entanto, as proteínas desempenham o papel mais importante nos efeitos biológicos, e nós detectar a expressão da proteína de Cry1 em tecidos CRC.

Também examinamos as relações de expressão Cry1 com características clínicas e os resultados dos pacientes. Os níveis de proteína Cry1 foram significativamente associados com a fase AJCC /TNM (com os mais altos níveis detectados em estágios TNM III-IV) e comprometimento de linfonodos (com os mais altos níveis detectados no caso de linfonodos positivos). circadianos genes têm sido implicados na regulação do ciclo celular [23]. ratinhos mutantes Cry1 têm um nível elevado de Wee1 em muitos tecidos, incluindo o fígado. bloqueia a divisão celular cinase Wee1 inibindo a transição G2-M. expressão alta Cry1 podem inibir a capacidade de Wee1 para promover a proliferação de células, proporcionando assim uma vantagem de sobrevivência para CRC [24] .Além disso, a proteína Cry1 é conhecido por complexo com adenilil-ciclase, e a sobre-expressão de Cry1 reduz a produção de cAMP em resposta a PGE2, isoproterenol, e até mesmo o ativador guanilato ciclase direta, forskolin [25]. Estudos relataram que concentrações elevadas de AMPc podem inibir a migração e a metástase de células de cancro da próstata humanos. PKA é uma proteína-quinase que está relacionada com a via de sinalização do AMPc. Estudos sugeriram que a PKA inibe a actividade e a função de RhoA [26], [27]. RhoA é um membro chave da família Rho de pequenas proteínas de ligação ao GTP e medeia a sinalização relacionada com arranjo do citoesqueleto, migração, proliferação e expressão gênica [28], [29], [30]. Estudos anteriores mostraram que o crescimento invasivo e metástases foram reprimidos em uma variedade de células cancerosas (células incluindo CRC), quando a actividade foi inibida RhoA [26], [31]. Os resultados atuais sugerem que uma via mediada Cry1-cAMP /PKA-RhoA está envolvida na migração e metástase do CRC.

Nossos dados imunocoloração de acordo com estes estudos. Superior fase TNM e a presença de linfonodo metástases foram significativamente correlacionada com os níveis mais elevados de expressão Cry1, sugerindo que Cry1 pode ser usado como um marcador para determinar a progressão da CRC.