Abstract
Objectivo
Uma revisão sistemática e uma meta -Análise foram realizados, a fim de resumir os estudos publicados atuais e avaliar lINE-1 hipometilação no sangue e outros tecidos como marcador epigenético para o risco de câncer.
Métodos
uma busca sistemática da literatura no banco de dados Medline, usando PubMed, foi conduzida para estudos epidemiológicos, publicadas antes de Março de 2014. o modelo de efeitos aleatórios foi utilizado para estimar diferença de média ponderada (MDS) com 95% de intervalos de confiança (IC). Além disso, as análises de subgrupo foram realizadas por tipo de amostra (amostras de tecido ou sangue), os tipos de câncer, e por ensaios utilizados para medir os níveis globais de metilação do DNA. Foi utilizado o pacote de software Cochrane Review Manager 5.2.
Resultados
Um total de 19 artigos exclusivos sobre 6107 amostras (2554 de pacientes com câncer e 3553 amostras de controlo) foram incluídos na meta-análise. níveis de metilação 1 LINE-foram significativamente menores nos pacientes com câncer do que nos controles (MD: CI -6,40, 95%: -7.71, -5.09; p 0,001). A diferença significativa nos níveis de metilação foi confirmada em amostras de tecido (MD -7,55; 95% CI: -9,14, -65,95; p 0,001), mas não em amostras de sangue (MD: CI -0,26, 95%: -0,69, 0,17 ; p = 0,23). níveis de LINE-1 metilação foram significativamente menores no colo e doentes com cancro gástrico do que nos controles (MD: -8,33; IC 95%: -10,56, -6,10; p 0,001 e MD: -5,75; IC 95%: -7,75, – 3,74; p . 0.001), enquanto, não foi observada diferença significativa para o câncer hepatocelular
Conclusões
a presente meta-análise adiciona novas evidências da crescente literatura sobre o papel de lINE-1 hipometilação no câncer humano e demonstra que os níveis de lINE-1 metilação foram significativamente menores nos pacientes com câncer do que em amostras de controlo, especialmente em certos tipos de câncer. Este resultado foi confirmado em amostras de tecido, ambas as amostras frescas ou congeladas /FFPE, mas não no sangue. Mais estudos são necessários para esclarecer o papel de LINE-1 metilação em subgrupos específicos, considerando ambos os tipos de câncer e de amostra e os métodos de medição
Citation:. Barchitta M, Quattrocchi A, Maugeri A, Vinciguerra M , Agodi a (2014) lINE-1 hipometilação em amostras de sangue e de tecidos como um marcador epigenética de Risco de Câncer: uma revisão sistemática e meta-análise. PLoS ONE 9 (10): e109478. doi: 10.1371 /journal.pone.0109478
editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão
Recebido: 23 de junho de 2014; Aceito: 31 de agosto de 2014; Publicação: 02 de outubro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Barchitta et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:. Os autores não têm financiamento ou apoio ao relatório
Conflito de interesses:. Manlio Vinciguerra tem servido como um PLOS ONE Conselho Editorial membro durante três anos. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas e critérios editoriais.
Introdução
alterações epigenéticas, modificações de DNA hereditárias que não envolvem mudanças na sequência de DNA, estão associados a mudanças na a expressão do gene e são importantes na manutenção da estabilidade genómica [1]. Entre os mecanismos epigenética, metilação do ADN é o mais vulgarmente estudada e envolvidos em vários processos biológicos, incluindo o cancro [2] – [5]. hipometilação global, uma redução global de todo o genoma do teor de metilação do DNA, está associada com instabilidade genómica e um aumento do número de eventos mutacionais [6]. hipometilação do DNA genômico é provável que resulte de desmetilação em elementos repetitivos, que respondem por cerca de 55% do genoma humano e determinar a regulação do gene e estabilidade genômica [7], [8]. Longo Intercaladas Nucleotide Elemento 1 (LINE-1) e Alu elementos repetitivos são os principais constituintes de repetições de DNA intercaladas. Devido à sua elevada ocorrência ao longo do genoma, a metilação em elementos repetitivos foram mostrados para correlacionar com teor de metilação do DNA genómico global e desmetilação tem sido associada com a instabilidade do genoma e aberrações cromossómicas. Assim, a linha-1 e Alu têm sido usados como marcadores substitutos globais para a estimativa do nível de metilação do DNA genómico em tecidos de cancro [6], [9] – [10] e em leucócitos do sangue periférico [11]. LINHA-1 hipometilação foi observado em vários tipos de cancro [12] – [14] e foi associada com um prognóstico pobre [15]. Em uma meta-análise [11], hipometilação do DNA global em leucócitos do sangue periférico foi associado com aumento do risco de câncer. Outra meta-análise, investigando a metilação do DNA do genoma em DNA de sangue periférico e risco de câncer, relata uma associação inversa significativa entre os níveis de 5-metilcitosina genômicas e risco de câncer, mas nenhuma associação risco global utilizando substitutos para a metilação genômica, incluindo metilação na linha elementos repetitivos -1 e Alu foi encontrado [16]. O objetivo do presente estudo foi realizar uma revisão sistemática mais abrangente e uma meta-análise, a fim de resumir os estudos publicados atuais e avaliar LINE-1 hipometilação no sangue e outros tecidos como um marcador epigenético para o risco de câncer.
Métodos
estratégia de procura e selecção
Uma busca sistemática da literatura na base de dados Medline, usando PubMed, foi realizada para estudos epidemiológicos, publicados antes de março de 2014, investigaram a associação entre lINE-1 hipometilação eo risco de câncer. As buscas foram limitadas a estudos escritos em Inglês; resumos e trabalhos não publicados não foram incluídos. pesquisa bibliográfica foi realizada de forma independente por dois autores. Os seguintes critérios de selecção foram usadas para procurar artigos e resumos: ( “câncer” ou “tumor” ou “carcinoma”) e ( “LINE-1” ou “Long Intercaladas Elemento-1” ou “global”) e ( “hipometilação” ou “metilação”). Além disso, as listas de referências de artigos selecionados foram marcados para pesquisar outros estudos relevantes. Não há estudos foram excluídos a priori para a fraqueza do design ou qualidade dos dados. Os artigos foram incluídos na análise quantitativa somente se satisfeitas as seguintes critérios: (1) caso-controle ou estudo de coorte projetos; e (2) estudos que apresentaram valores médios e desvios-padrão (DP) de nível de metilação do DNA em pacientes com câncer e no grupo controle. Além disso critérios de exclusão foram os seguintes: (1) o estudo relatando apenas os resultados como mediana dos níveis de metilação ou por meio de display gráfico, ou 95% intervalos de confiança (IC) de índices ajustados chances (RC) ou riscos relativos para o risco de câncer em indivíduos com o menor nível de metilação do DNA global (tertile, quartil ou decil) em relação ao grupo com o nível mais alto, (2) o estudo de relatórios de análise de metilação do DNA única específica do gene, e (3) artigos de revisão.
Onde faltavam dados ou informações adicionais foram necessárias, autores do estudo foram contactados por e-mail.
os itens de informação preferidos para revisões sistemáticas e meta-análise (PRISMA) orientações para a realização de meta-análise foram seguidos [17] .
a coleta de dados e extração
dois dos autores revisados de forma independente todos os estudos elegíveis e abstraídas as seguintes informações em um formato padrão: sobrenome do primeiro autor, ano de publicação, país onde o estudo foi realizada, desenho do estudo, locais de câncer e os tipos, tipo de amostra, os métodos experimentais para medir os níveis de metilação do DNA globais, o número de casos e controles, valores médios e desvio padrão de níveis de metilação do DNA globais para cada grupo e os resultados principais.
Análise estatística
Todos os dados foram analisados utilizando o Review Manager 5.2 software fornecido pela Colaboração Cochrane (https://ims.cochrane.org/revman).
o modelo de efeitos aleatórios foi usado para estimar diferença de média ponderada (MDS), com IC 95% [18] e, portanto, nenhum ajuste dos efeitos ambientais foi tida em conta. Além disso, as análises de subgrupo foram realizadas por tipo de amostra (amostras de tecido ou sangue), por fonte de amostra (tecido fresco ou fixado em formol e incluído em parafina, tecido FFPE), por tipos de câncer (colo-rectal, estômago, hepatocelular), e por ensaios utilizados para medir os níveis globais de metilação do DNA. parcelas florestais foram geradas para ilustrar os tamanhos de efeito específico do estudo, juntamente com um CI de 95%. Heterogeneidade entre os estudos, foi medida usando o Q-teste baseado na estatística χ2, considerando heterogeneidade estatística significativa, p 0,1. Como teste de Cochran indica apenas a presença de heterogeneidade e não a sua magnitude, também relataram a estatística I
2, que calcula a percentagem de variabilidade resultado que pode ser atribuído à heterogeneidade entre os estudos. Um I
2 valor de 0% significa sem heterogeneidade observada, enquanto que, 25% é “baixa”, 50% é “moderado” e 75% é a heterogeneidade “alto” [19]. Nós também estimou a variação entre-estudo utilizando tau-quadrado (τ
2) estatística [20].
Para determinar a presença de viés de publicação, a simetria das parcelas funil em que significam diferenças foram plotados contra os seus correspondentes erros padrão foram avaliados.
Resultados
os dados de extração
as etapas de execução da revisão sistemática e meta-análise de processo são dadas como um fluxograma PRISMA na Figura 1. um total de 324 artigos foram recuperados do banco de dados, um artigo foi adicionado através de pesquisa manual com lista de referência e, portanto, 46 artigos, publicados entre 2004 e 2014, foram incluídos na revisão sistemática e resumidas no Quadro 1 por local do cancro ou tipo .
características de dados e avaliação da qualidade
Um total de 18 estudos eram de países asiáticos (40%), 13 de países europeus (28%), 13 dos EUA (28%) e 1 da Argentina e do Egito (2%, cada).
Trinta e oito estudos longitudinais retrospectivos em comparação lINE-1 níveis de metilação entre pacientes com câncer e indivíduos saudáveis ou tecidos normais adjacentes em pacientes com câncer. Oito estudos longitudinais em perspectiva analisaram os níveis de metilação LINE-1 em coortes de doentes com cancro, em relação à expectativa de vida, o resultado da doença ou da malignidade do tumor, a identificação do papel da Linha-1 hipometilação como um biomarcador de mau prognóstico no pacientes com câncer [15], [21] – [27].
em 41 estudos lINE-1 níveis de metilação foram avaliados tanto em tumores e em tecidos controles saudáveis, e nos restantes 5 estudos apenas em pacientes com câncer.
no geral, os estudos detectaram níveis de metilação LINE-1 em 15332 amostras: 8103 de pacientes com câncer (amostras de tecido 4679, 3276 amostras de sangue, 72 enxaguatórios bucais e 76 células plasmáticas da medula óssea) e 7136 amostras de controlo (6277 de indivíduos saudáveis e 859 a partir de tecidos normais adjacentes em pacientes com câncer).
em relação aos métodos experimentais para medir lINE-1 níveis de metilação, o método “padrão ouro”, usado em 63% dos estudos, foi o pyrosequencing de bissulfito ADN convertido. análise Além disso, 9 estudos utilizados combinados bissulfito de restrição de LINE-1 (COBRA LINE-1) e 8 estudos utilizados outros métodos, ou seja, sequenciamento, PCR em tempo real, AQAMA PCR, COMPARAR ensaio de metilação, MulticolorMethyLight Ensaio e MS-MLPA.
O tipo de tumor mais frequente no estudo foi o câncer colorretal analisadas em oito estudos [15], [21], [28] – [33], seguido de sete estudos que avaliaram o nível de metilação no câncer gástrico [23], [ ,,,0],27], [32], [34] – [37], cinco no carcinoma hepatocelular [25], [38] – [41], quatro no cancro da bexiga [1], [14], [42], [43] e cabeça e pescoço carcinoma [10], [44] – [46], dois no cancro do pulmão [47], [48] e cancro da mama [24], [49], e os estudos individuais avaliaram os níveis de metilação no câncer de células renais [ ,,,0],50], o câncer de próstata [51], neuroendócrino tumor [52], câncer de ovário [53], cancro da tiróide [54], câncer de esôfago [26], câncer do colo [55], o cancro endometrial [32], melanoma da pele [22] , cancro testicular [56], leucemia [57], mieloma múltiplo [58], paraganglioma [59], carcinoma fibrolamelar [60] e gastrointestinal [61]. Quatro estudos avaliaram o nível de metilação em vários locais de câncer [13], [28], [29], [32]. No que diz respeito ao método de ensaio, pyrosequencing foi usada em estudos de 29, seguido por COBRA em 9 estudos, PCR em tempo real e AQAMA-PCR em 2 estudos. MulticolorMethyLight Ensaio, MS-MLP, Compare e QUBRA foram adoptadas em único estudo cada.
-análise Meta
Dos 46 artigos selecionados, 14 relataram meios e SD de níveis de metilação do DNA. Além disso, os meios e SDs foram independentemente calculada usando dados a partir de 2 artigos e, entre os autores contatados para dados em falta, 3 responderam aos pedidos do email e os dados foram adicionados na análise [30], [50], [56]. Assim, 19 artigos originais foram incluídos na análise quantitativa. Além disso, dois trabalhos de Antelo et al. [28] e por Pavicic et ai. [32], relataram dados de diferentes tipos de cancro e, portanto, eles foram separados em 4 e 8 sub-estudos, respectivamente (Tabela 1)
Um total de 6107 amostras foram incluídos na análise:. 2554 de cancro pacientes (1127 amostras de tecido e de 1427 amostras de sangue) e 3553 amostras de controlo (2811 de indivíduos saudáveis e 742 a partir de tecidos normais adjacentes em pacientes com câncer).
níveis de lINE-1 metilação foram significativamente menores nos pacientes com câncer do que no controle amostras (MD: CI -6,40, 95%: -7,71, -5,09; p 0,001). No entanto, a heterogeneidade entre os estudos foi significativamente alta (I
2 = 99%) (Figura 2), assim, foi realizada análise de subgrupos com base no tipo de amostra (tecidos ou amostras de sangue). A diferença significativa nos níveis de metilação foi confirmada em amostras de tecido (MD -7,55; 95% CI: -9,14, -65,95; p 0,001), mas não em amostras de sangue (MD: CI -0,26, 95%: -0,69, 0,17 ; p = 0,23)
A análise de subgrupo com base no tipo de amostra
A análise de subgrupo por fonte de amostra foi realizado… LINE-1 níveis de metilação foram significativamente menores nos pacientes com câncer do que em amostras de controlo em tecido fresco e /ou congelados (MD -8,19; IC 95%: -10,54, -5,84; p 0,001) e na FFPE tecido (MD: -6,96 IC 95%: -9,73, -4,20; p 0,001). Heterogeneidade entre os estudos, nos dois subgrupos foi significativamente elevada (I
2 = 98% e 96%, respectivamente) (Figura 3).
análise de subgrupos com base na fonte de amostra.
Além disso, uma análise de subgrupo por tipos específicos de câncer, por colorectal, hepatocelular e câncer gástrico, foi conduzida. níveis de metilação LINE-1 foram significativamente menores no colo e pacientes com câncer gástrico do que em amostras de controlo (MD: -8,33; 95% CI: -10,56, -6,10; p 0,001 e MD: -5,75; IC 95%: -7,75, -3,74; p 0,001). Não foi observada diferença de LINE-1 níveis de metilação em leucócitos do sangue para o câncer hepatocelular (MD: -5,76; IC 95%: -12,03, 0,51; p = 0,23). A heterogeneidade entre os estudos, em colorrectais e hepatocelulares subgrupos foi significativamente alta (I
2 = 96%), e moderadamente elevada nos subgrupos gástricas (I
2 = 66%) (Figura 4).
análise de subgrupos com base no tipo de câncer.
Uma análise de subgrupo por meio de ensaios utilizados para medir os níveis de metilação e, em particular, entre as duas técnicas comumente usadas, pyrosequencing e COBRA lINE-1, foi realizada. O MDS para
pyrosequencing
e
COBRA LINE-1 | subgrupos foram -7,33 (IC 95%: -9,06, -5,59; p 0,001) e -5,75 (IC 95%: -7,13 , -4,37; p = 0,03), respectivamente. Heterogeneidade entre os estudos e, no
pyrosequencing
subgrupo foi significativamente elevada (I
2 = 100%), e moderadamente alto no COBRA
subgrupo (I
2 = 63% ) (Figura 5). análise
Os subgrupos com base no método.
A análise de subgrupo por tipo de amostra, particularmente amostras de tecido eo método de ensaio foi conduzido. Os MDs nos subgrupos de estudos que detectaram LINE-1 níveis de metilação em amostras de tecido por meio pyrosequencing e COBRA LINE-1, foram -10,42 (95% CI: -12,93, -7,91; p 0,001) e -5,12 (IC 95% : -6,33, -3,91; p = 0,10), respectivamente. Heterogeneidade entre os estudos e, no
pyrosequencing
subgrupo foi significativamente elevada (I
2 = 97%), moderadamente elevado em
COBRA LINE-1 | subgrupo (I
2 = 56 %) (Figura 6). Estratificação entre os estudos que detectaram LINE-1 metilação em amostras de sangue não foi realizada devido à escassez de estudos.
análise de subgrupos com base no método.
O funil parcelas indicam pequena a moderada assimetria, o que sugere que o viés de publicação não pode ser completamente excluída como fator de influência sobre o presente meta-análise (Figuras 7-12).
a análise de subgrupo com base no tipo de amostra.
análise de subgrupo com base em tipos de amostras de tecido. SE, erro padrão, MD, diferença média.
A análise de subgrupo baseadas no tipo de câncer em amostras de sangue.
A análise de subgrupo com base no tipo de câncer em amostras de tecido.
a análise de subgrupo com base no método de detecção em amostras de sangue.
a análise de subgrupo com base no método de detecção em amostras de tecido.
Discussão
O baixo nível de metilação do DNA em tumores, em comparação com o nível de metilação do DNA em suas contrapartes dos tecidos normais foi uma das primeiras alterações epigenética para ser encontrado no cancro humano [62]. A perda de metilação é devido principalmente a hipometilação das sequências de ADN repetitivas e line-1 elementos são tipicamente pesadamente metilado em tecidos normais, enquanto que a linha 1-hipometilação foi reportado em tecidos de cancro. Além disso, Liao et al. [50] relatou que os níveis de LINE-1 metilação, medidos em DNA de leucócitos, foram significativamente maiores em pacientes com câncer renal do que em indivíduos saudáveis.
Duas recentes meta-análises foram realizadas a fim de estimar o risco de câncer em geral de acordo com a hipometilação do DNA global em leucócitos do sangue. A meta-análise de Woo e Kim [11] relata que hipometilação global do DNA de leucócitos no sangue foi associado com aumento do risco de câncer, embora a associação variou pelos métodos experimentais usados (% 5- método metilcitosina, LINE-1 com pyrosequencing e metil aceitação ensaio), a região de ADN alvo e o tipo de cancro. Uma meta-análise atualizada realizado por Brennan e Flanagan [16] indica uma associação inversa significativa entre os níveis genômicas 5-metilcitosina e risco de câncer (OR = 3,65; 1.20-6.09), mas nenhuma associação risco global de estudos com substitutos para metilação genômica, incluindo a metilação no elemento repetitivo LINHA-1 (OU = 1,24; 0,76-1,72). Notavelmente, as duas meta-análises anteriores incluíram estudos que relatavam análise de associação entre os níveis de metilação do sangue eo risco de câncer, mas não avaliaram estudos que relatam diferenças nos níveis de metilação média no sangue e em outros tecidos. A presente meta-análise de relatórios recentes foi conduzido incluindo estudos que relatam níveis de metilação no sangue e em outros tecidos. Esta meta-análise em causa 19 artigos originais, mas desde que dois artigos compreendido mais do que um estudo realizado em diferentes populações de pacientes, no total havia 29 estudos não-exclusivos incluídos. Em um total de 2554 amostras de pacientes com câncer e 3553 amostras de controlo, esta relatórios meta-análise que significam níveis de metilação em pacientes com câncer foram significativamente 6,4% menor do que em amostras de controlo.
A associação entre o risco de câncer e DNA mundial metilação tem sido principalmente investigado em amostras de sangue, porque o tecido do tumor a colheita é invasiva e não pode ser realizada rotineiramente. No entanto, vários estudos têm relatado que a metilação de elementos repetitivos é específico de tecido, a maioria variável no tecido tumoral, e não está correlacionada entre o tumor e sangue [63] – [65]. Consistentemente, provas revela que a hipometilação genómico no tumor e tecido normal adjacente da bexiga e cancro do cólon não era detectável no sangue [43], [66], sugerindo que a hipometilação é restrita ao tecido afectado doença. Interessantemente, no presente meta-análise da diferença significativa nos níveis médios de metilação foi confirmada apenas em amostras de tecido, ambas as amostras frescas /ou congelada FFPE, mas não em amostras de sangue. Além disso, a meta-análise de elementos de prova suficientes de que LINE-1 hipometilação, aumenta significativamente na colorectal e cancro gástrico. Pelo contrário, não houve associação global foi encontrada para o carcinoma hepatocelular. Notavelmente, todos os estudos sobre colorectal e tumores gástricos avaliada LINE-1 metilação em amostras de tecido, enquanto todos os estudos incluídos no carcinoma hepatocelular investigou a associação somente em amostras de leucócitos no sangue. metilação global do DNA pode ser medida por ensaios de quantificação directos e indirectos. Embora a medição de percentagens de 5- metilcitosina para estimar conteúdos globais de metilação do DNA são altamente quantitativo e reprodutível, que requerem grande quantidade de ADN e não são adequados para grandes estudos epidemiológicos. Pyrosequencing com DNA tratado pelo bissulfito, o “padrão ouro” para a análise de metilação do DNA [67], [68], é uma alta taxa de transferência e método preciso disponível atualmente para medir LINE-1 metilação como marcador substituto para a hipometilação do DNA global. No entanto, LINE-1 níveis de metilação podem variar de acordo com a sequência de CpG alvo detectado [69], o que representa um factor importante para o estudo de associação com o risco de câncer. No presente meta-análise, considerando os dois métodos de detecção utilizados com maior frequência (pyrosequencing e COBRA LINE-1) ambos os subgrupos relatam significativamente menor LINE-1 níveis de metilação em pacientes com câncer do que em amostras de controlo, apesar da heterogeneidade entre os estudos foi significativamente elevado no
pyrosequencing
subgrupo e moderadamente alto no COBRA
subgrupo.
as principais limitações desta meta-análise são o pequeno número de estudos incluídos (n = 19) eo grande heterogeneidade entre os estudos. Embora um modelo de efeitos aleatórios foi executada, a fim de ter em conta a elevada heterogeneidade, as estimativas combinadas devem ser interpretados com cautela. Para superar este problema, estimativas combinadas foram calculados em subgrupos mais homogêneos de estudos (análise de subgrupos). Além disso, a possível existência de um viés de publicação foi considerada. Exame de parcelas funil mostrou pequena assimetria a moderada, sugerindo que um viés de publicação não pode ser completamente excluída e pode ter tido pelo menos um impacto moderado sobre as verdadeiras estimativas de tamanho de efeito. Na verdade, foram excluídos alguns dados, tais como resumos de conferências, literatura não-Inglês, dados não publicados e outros relatórios inconsistentes de acordo com nossos critérios de seleção. Além disso, a associação de metilação de risco tendem a notificar apenas se revela resultados estatisticamente significativos, e se os autores considerem análise adequada [16].
Além disso, uma vez que a maioria dos estudos (83%) tinha um caso-controle de design grandes estudos de coorte são necessários, a fim de esclarecer se hipometilação global é uma aberração causadores de câncer precoce ou um efeito da carcinogênese [11].
em conclusão, a presente meta-análise adiciona novas evidências para a crescente literatura sobre o papel de lINE-1 hipometilação no câncer humano e mostra que os níveis de lINE-1 metilação foram significativamente menores nos pacientes com câncer do que nos controles, especialmente para certos tipos de câncer. Este resultado foi confirmado em amostras de tecido, mas não no sangue. Mais estudos são necessários para esclarecer o papel de LINE-1 metilação em subgrupos específicos, considerando tanto o tipo de câncer e de amostra e os métodos de medição.
Informações de Apoio
Checklist S1.
PRISMA Checklist
doi:. 10.1371 /journal.pone.0109478.s001
(DOC)
Checklist S2.
Meta-análise sobre Genetic Association Studies Checklist
doi:. 10.1371 /journal.pone.0109478.s002
(DOC)
Reconhecimentos
Os autores gostariam de agradecer aos autores A. Goel e K. Hur e colegas, LM Liao e LE Moore e colegas e MH Greene e L. Mirabello e colegas para suportar mais dados não relatados em seus artigos.