Abstract

Fundo

O fator tecidual (TF) inibidor da via (TFPI) existe em duas isoformas; TFPIα e TFPIβ. Ambas as isoformas são superfície celular ligado principalmente através de glicosilfosfatidilinositol âncoras (GPI). TFPIα também tem sido proposta para ligar outras moléculas de superfície, como glicosaminoglicanos (GAGs). TFPIβ superfície celular foi mostrado exercer actividade anticoagulante maior do que TFPIα, sugerindo funções alternativas para TFPIα. Além disso caracterização e procurar novos parceiros de ligação de TFPI é crucial para entender completamente as funções biológicas de TFPI associada à célula.

métodos e resultados

proteoglicanos

potencial associação de TFPI ao sulfato de heparan (HS) na família sindecam foram avaliados por derrubar estudos e citometria de fluxo. co-localização da superfície da célula foi avaliada por microscopia confocal, e PAGE nativa ou imunoprecipitação seguido por transferência de Western foi utilizada para testar a interacção da proteína. Heparanase foi usada para degradar enzimaticamente SH GAGs na superfície celular. potencial anticoagulante foi avaliada utilizando um ensaio da actividade do factor Xa (FXa). Bater para baixo de sindecano-3 nas células endoteliais, – lisas células de cancro da mama e músculo-reduziu os níveis de superfície de TFPI em 20-50%, e uma associação de TFPIα ao sindecano-3 na superfície da célula foi demonstrada. Western blotting indicaram que TFPIα foi encontrada em complexo com sindecano-3. O TFPI ligado ao sindecano-3 não inibiu a geração de FXa. A remoção do SH GAGs não divulgou antígeno TFPI a partir das células.

Conclusões

Nós demonstramos uma associação entre TFPIα e sindecam-3 nas células vasculares e em células cancerosas, que não parecem depender em SH GAGs. Nenhuma actividade anticoagulante foi detectado para o TFPI associada com sindecano-3, o que pode indicar funções independentes de coagulação para esta célula associada piscina TFPI. Isto, no entanto, exigem uma investigação mais aprofundada

Citation:. Tinholt M, Stavik B, Louch W, Carlson CR, Sletten M, Ruf W, et al. (2015) Sindecana-3 e TFPI Colocalize na superfície do Endothelial-, Liso músculo-e câncer de células. PLoS ONE 10 (1): e0117404. doi: 10.1371 /journal.pone.0117404

Editor do Academic: Aamir Ahmed, University College London, Reino Unido

Recebido: 13 Janeiro, 2014; Aceito: 23 de dezembro de 2014; Publicação: 24 de janeiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Tinholt et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento: Este trabalho foi financiado por bolsas de investigação da Autoridade do Sudeste Noruega Regional de Saúde, Hamar, Noruega e A. Jahre e HG Andrine Berg fundações filho. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

factor tissular (TF) inibidor da via (TFPI) é o inibidor endógeno da coagulação do sangue induzida pelo TF e que existe em duas isoformas; TFPIα e TFPIβ. Ambas as isoformas de exercer actividade anticoagulante através da ligação aos locais activos do complexo TF-factor Vila (FVIIa) e ao factor Xa (FXa) [1, 2]. As células endoteliais são responsáveis ​​pela maior parte da produção de TFPI, mas a expressão de TFPI também foi demonstrado em outros tipos de células, tais como monócitos, células musculares lisas, as plaquetas [3-5], e em várias linhas celulares de cancro da mama [6, 7].

TFPIα consiste de três domínios inibitórios em tandem de Kunitz e uma altamente carregada positivamente [8], ao passo que TFPIβ contém os primeiros dois domínios de Kunitz seguido por uma extremidade C-terminal diferente que codifica um sinal de glicosilfosfatidilinositol de fixação na extremidade C-terminal (GPI) péptido, dirigi-la para a superfície da célula [1, 9]. Devido a essas diferenças, TFPIβ é exclusivamente ligado à membrana celular, enquanto TFPIα pode ser secretada para o meio extracelular, ou ser ligada à superfície da célula através de uma molécula ligada a GPI ainda não identificado, e em certa medida para o sulfato de heparano (HS ) proteoglicanos (HSPGs) [9-12]. A função da superfície celular associado TFPI não é bem reconhecido, no entanto, TFPIβ tem sido sugerido para ser responsável pela maior parte da actividade anticoagulante na superfície das células, indicando um papel alternativa da célula ligada de comprimento completo variante de splicing TFPIα [2]. Outras investigações da superfície celular TFPI associado e parceiro de ligação putativo (s) é, portanto, de importância fundamental para a compreensão funcional desta molécula.

HSPGs são moléculas que se projetam a partir de membranas celulares ou matriz extracelular. Há duas famílias principais; as famílias sindecam e glipicano que consistem em quatro e seis variantes genéticas, respectivamente. O padrão da HSPGs expressão é altamente regulado de forma específica developmental-, e tipo de célula espaço-[13]. Syndecans são proteínas transmembranares, enquanto glypicans são proteínas ancoradas a GPI falta de conexão citoplasmática direta. Ambos os glypicans e syndecans segurar glicosaminoglicanos (GAGs), principalmente cadeias SH, que são covalentemente ligados à proteína do núcleo [13, 14]. As cadeias SH são da maior importância funcional, uma vez que eles interagem com e se ligam a um largo espectro de proteínas efectoras biológicos, como quimiocinas, factores de crescimento e componentes da matriz extracelular. Através destas interacções, HSPGs participar em muitas acções celulares essenciais, tais como a adesão celular, proliferação, diferenciação e migração. HSPGs pode modular ligando-a ligação ao receptor através da concentração de citocinas em estreita proximidade com os seus receptores de elevada afinidade, ou funcionar como co-receptores, promovendo assim a transdução de sinal eficiente [14, 15]. HSPGs também pode estar envolvido na fisiopatologia, incluindo malignidade. Modulações do padrão de sulfatação da cadeia SH têm sido mostrados para melhorar a ligação do factor de crescimento e acelerar a proliferação de células cancerosas [16].

Tem sido sugerido que HSPGs pode actuar como receptores para a interiorização dos complexos de TFPI-FXa em células endoteliais, contribuindo para o efeito anticoagulante de TFPI [17]. Além disso, o TFPI tem sido demonstrado que se ligam ao glipicano 3 em células do fígado [18], e sindecam 4 purificadas a partir de células endoteliais [19]. O domínio de Kunitz 3 e a extremidade C-terminal de TFPIα são necessários para a ligação a superfícies endoteliais celular [20, 21] e células de hepatoma [22] óptima, o que sugere que apenas a isoforma TFPIα associados com HSPGs.

Desde foi proposto que o TFPI pode ser associada com HSPGs [17-19], se caracterizar ainda mais a natureza da célula ligada TFPI. Isto foi realizado através da avaliação da expressão de syndecans 1-4 e o potencial de ligação a TFPI expresso endogenamente syndecans na superfície da célula de endothelial- primário humano e células de músculo liso e células de cancro da mama basais.

Materiais e métodos

Declaração

Ética

N /A

Reagentes

Silencer controle negativ siRNA # 5 (AM4642) foi adquirido a Ambion (Foster City, CA, EUA). siRNAs Custom Designed contra syndecans foram produzidos por Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Alemanha) (Tabela S1). Inibidor de IgG de coelho anti-humano via do factor tecidular 4901 /ADG72 recombinante de comprimento completo e TFPI (ADG49) foram obtidos de American Diagnostica (Stamford, CT, EUA). De cabra anti-TFPIα ab9881 e de coelho anti-sindecano-3 ab63932 eram de Abcam (Cambridge, MA, EUA). Coelho-IgG-UNLB e IgG de cabra anti-coelho (H + L) -RPE eram ambos de Southern Biotechnology Associates (Birmingham, AL, EUA). Anti-sindecano-3 (SC-30883), anti-sindecano-3 (sc-9495), o sindecano-3 293T controlo lisado (SC-176304), IgG de cabra normal (sc-2028), anti-actina (SC- grânulos /G agarose 1616), e A (sc-2003) foram obtidos da Santa Cruz Biotechnology, EUA. Recombinante sindecano-3 (3539-SD), o anticorpo secundário anti-IgG de cabra HRP (HAF109) e recombinante humano ativo heparanase (7570-GH) eram de R D Systems (Minneapolis, MN, USA). Anti-sindecam-3 1C7 foi uma simpática oferta do Dr. Guido David (University of Leuven, Leuven, Bélgica). Anti Human D-sulfato de heparano (F69-3G10 clone, o código do produto 370260-1) foi da AMS Biothechnology (Abingdon, UK). A γ-globulina humana e de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) e heparinase I + III a partir de

Flavobacterium heparinum

(H3917) eram de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). anticorpos Alexa Fluor (A11071 e A11055) e o reagente de transfeco Lipofectamina 2000 eram da Life Technologies. Os ensaios ligados a enzimas comerciais (ELISA) Asserachrom total de TFPI e TFPI Livre (Diagnostica Stago, Asnière, França) foram usadas para medir os níveis de antigénio de TFPI, de acordo com as instruções do fabricante.

As culturas celulares

as células de carcinoma da mama intraductal Sum102 (a partir da Universidade de Michigan; www.cancer.med.umich.edu/breast_cell/Production/index.html) [6, 7] foram cultivadas em meio pronto HuMEC (Invitrogen), e o células humanas da artéria coronária endoteliais (CEACH; # CC-2585, Lot não 6F4194, Lonza.) [7] foram cultered na EBM-2 (Lonza). Todos os meios de células supramencionado com suplementos foram descritos, anteriormente [7]. A artéria coronária células humanas de músculo liso (HCASMC.; # CC-2583, Lot não 3F0172, Lonza) [23] foram cultivadas em SmBM meio basal com SmGM-2 fatores de crescimento Individual Quots e 10% FCS. As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO e humidificada

2.

qRT-PCR

Os ensaios para as quatro syndecans foram concebidos utilizando a sonda biblioteca universal, Sonda localizador software (Roche Applied Sciences). Probe ID e sequências de iniciadores são fornecidos em S2 Table. ADNc (19 ng) foi amplificado em triplicado por PCR em tempo real quantitativo (qRT-PCR) com 100 nM de sonda e iniciadores 200 nm (Eurogentec). Um controle artificial negativo sem expressão sindecam (Ct = 40), e um controle endógeno valor (18S) Ct definido na média de todos os tipos de células serviu para calcular a quantidade de mRNA relativo (RQ) de syndecans pelo método ΔΔCt. Para uma descrição mais detalhada, consulte a nossa publicação anterior [7].

Small interferência (si) transfecção RNA

Com base em experiências anteriores de otimização, as células foram transfectadas com siRNA dirigido contra sindecam 1 -4, utilizando Lipofectamine 2000 de acordo com as recomendações do fabricante. Em resumo, as células foram semeadas em placas de 6 poços, ou placas de 12 poços para atingir 30-50% de confluência no dia seguinte e transfectadas com 5 ug ou 2,5 Lipofectamina e 1 ou 0,5 nmol de siRNA, num volume total de 2 mL ou 1 mL fresco médio, respectivamente. Lipofectamina contendo o meio foi substituído com meio fresco 5 horas pós transfecção. As células foram deixadas crescer durante 2-3 dias antes da análise.

A citometria de fluxo

Células com transiente derrubar de syndecans foram analisados ​​para a superfície celular de ligação de um anticorpo específico de TFPI, essencialmente como anteriormente descrito [7]. As diferenças nos níveis de superfície celular de TFPI foram calculados e apresentados como redução percentual em comparação com as células (valores médios ± DP) de controlo com base em valores de intensidade de fluorescência média. Os valores de fluorescência média de células marcadas com o anticorpo de coelho irrelevante foram considerados como ligação inespecífica, e foram corrigidas por em cada amostra individual. As células transfectadas com ARNsi de controlo negativo e marcadas com anticorpo anti-coelho irrelevante serviu para determinar o nível de fundo quando histograma foram criados (referido como “irrelevante”). Sindecam-3 níveis de superfície celular foram determinados de forma semelhante utilizando um anticorpo específico sindecam-3.

heparanase e tratamento heparinase

Para degradar GAGs SH da superfície da célula, células confluentes em bandejas de 12 poços foram lavados duas vezes com PBS antes tratados com heparanase (1 ug /ml) ou a heparinase I + III (2U /mL) em meio isento de soro (SFM) durante 4-16 horas. SFM contendo o tampão veículo adequado serviu como um controlo. Após o tratamento, os sobrenadantes foram recolhidos, e as células foram lavadas duas vezes antes da lise. O efeito do tratamento com heparinase foi confirmada por transferência Western usando o anticorpo D-sulfato de heparano que reconhece SH neo-epitopos gerados por digestão do HS por heparinase I + III.

A microscopia confocal

Células eram semeadas em lâminas de vidro revestidas de laminina estéreis e incubadas durante a noite a 37 ° C. No dia seguinte, as células foram lavadas três vezes em PBS e fixadas durante 10 minutos em paraformaldeído a 4%, extinguiu-se durante 15 min em 100 mM de glicina (pH 7,4), e lavou-se três vezes antes do bloqueio, durante 2 horas em solução de alta bloqueio (0,9% NaCl, 0,5% de Na

3Citrate, BSA a 3% e 40 ng /mL γ-globulina humana) com inclinação constante. Subsequentemente, as células foram incubadas com 5 ug /mL de anticorpo de cabra anti-TFPI anticorpo (ab9881), específico para TFPIα, em uma solução de bloqueamento de baixo (0,9% de NaCl, 0,5% de Na

3Citrate, 1% de BSA e 40 ng /uL humano y-globulina) durante 4-5 horas. As células foram lavadas cinco vezes em PBS antes de serem incubadas durante 1,5 horas com 1: anticorpo anti-cabra 1500 Alexa Fluor 488 burro, lavadas novamente cinco vezes e incubadas com 5 ug /ml de anticorpo de coelho anti-sindecano 3-anticorpo (ab63932) durante a noite a 4 ° C e sob uma inclinação constante. No dia seguinte, as células foram lavadas cinco vezes, e finalmente incubado com 1: anticorpo anti-coelho Alexa Fluor 633 1500 cabra durante 1,5 horas. Todas as incubações do anticorpo foram realizados a 4 ° C. As células foram digitalizados usando um LSM 710 microscópio confocal (Zeiss, GmbH, Jena, Alemanha) com uma objectiva de imersão 40x de água. O sinal de TFPI foi excitado a 488 nm, com emissão medido entre 500-600 nm. O sinal sindecam-3 foi excitado a 633 nm, com emissão medido acima de 640 nm. width Pinhole foi fixado em 1 unidade Airy, e as imagens foram coletadas com uma espessura de corte óptico de 1 mm. imagens confocais foram de-convolved para compensar a distorção óptica, empregando software Essencial de Huygen (Volume de Imagem Científica B.V .; Laapersveld, Holanda). As imagens foram analisadas e apresentadas utilizando o programa J Imagem (versão 1.4.3.67).

tampões de lise e experiências de imunoprecipitação

Sum102 células, HCAECs e HCASMCs foram colhidas em tampão de lise Triton (HEPES 20 mM , pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, a análise de Triton X-100, 0,2% de aprotinina, 0,6% 100 de fenilmetilsulfonilo mM de PMSF, e 1,0% de mistura de inibidores de fosfatase) para nativa (não redutora) PAGE a 0,5% e para as experiências de imunoprecipitação (condições redutoras).

2 ug de IgG de cabra anti-sindecano-3 ou normal (controlo negativo) foi adicionado a cada lisado celular e incubou-se durante a imunoprecipitação durante a noite a 4 ° C. Os imunocomplexos foram recolhidos por proteína A /G agarose e lavou-se três vezes em tampão de lise Triton antes da ebulição em tampão de carga de SDS, seguido por análise de SDS-PAGE.

PAGE e análises de imunotransferência

célula Proteína Os lisados ​​imunoprecipitados, e proteína TFPI recombinante (100 ng) foram analisadas em 4-15% pré-moldado Critério de géis de Tris-HCl (# 345-0028, BioRad Laboratories) com (redutores) ou sem 0,1% de SDS (condições não redutoras) em Tris /glicina /SDS (Tris 25 mM, glicina 192 mM, SDS a 0,1%, pH 8,3, # 161-0772), ou Tris /Glicina tampão de corrida (Tris 25 mM, glicina 192 mM, pH 8,3, # 161-0771, BioRad Laboratories), respectivamente. Um tampão de amostra nativa (# 161-0738, BioRad Laboratories) foi utilizado para as condições não redutoras. As proteínas foram transferidas para membranas de PVDF (RPN 303F, GE Healthcare), os quais foram bloqueados em caseína a 1% em TBST durante 60 minutos à temperatura ambiente, incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos primários, lavou-se três vezes 10 minutos em TBST e incubadas com um anticorpo secundário-peroxidase de rábano conjugado. As manchas foram desenvolvidos utilizando ECL Prime (RPN 2232, a GE Healthcare). Os sinais quimioluminescentes foram detectados por Las 1000 (Fujifilm, Tóquio, Japão). Imunotransfer�cias de imunoprecipitados foram despojados por 30 min entre anticorpos. Para PAGE nativa, dois imunotransfer�cias idênticos foram executados em paralelo para garantir sinais específicos de anti-TFPIα e anti-sindecam-3. Posteriormente, as imunotransferências foram retirados durante 45 min (Pierce) e sondado para confirmar que os anticorpos reconheceram um complexo proteína de tamanho idêntico. ImageJ foi usada para a quantificação densitométrica das bandas de proteína em imunoblots.

TF-FVIIa actividade

e células CEACH Sum102 foram transfectadas com ARNsi contra sindecano-3 (48 h) em placas de 12 poços quanto descrito acima. As células foram lavadas duas vezes em solução de lavagem (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, KCl a 4 mM, e 11 mM de glucose, pH 7,5) e incubou-se durante 1 hora a 37 ° C em solução de reacção (tampão de lavagem com 5 mg /mL de BSA e CaCl 5 mM de

2, pH 7,5) contendo 10 nM de FVIIa e FX 175 nM. A seguir à incubação, 50 uL foram transferidos para 100 de solução uL de paragem (Tris HCl 50 mM, NaCl 150 mM, EDTA 25 mM, e 1 mg /mL de BSA, pH 7,5) em gelo antes incubadas com 50 uL de FXa substrato (CS-11 ( 22)). A absorvância a 405 nm foi registada a 37 ° C durante 45 minutos a intervalos de 15 seg usando um Spectra Max Plus 384 leitor de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA). As velocidades máximas (V

max) em mU /min foram utilizadas para calcular a quantidade de FXa gerado, utilizando uma curva padrão obtida com concentrações conhecidas de FXa. CEACH células foram tratadas com PMA (10 nM, 6 horas) antes do ensaio para induzir a expressão de TF. A regulação positiva ~ 600 vezes dos níveis de mRNA TF foi confirmada utilizando qRT-PCR.

Métodos estatísticos

A análise estatística foi realizada utilizando o software GraphPad Prism versão 5.0 (PRISM5) (GraphPad Software Inc, LaJolla , CA). teste t de Student foram realizadas para testar as diferenças significativas quando os dados eram normalmente distribuídos. Caso contrário, foi utilizado o teste não paramétrico de Mann Whitney. * P 0,05, ** p 0,01 e *** p . 0.001

Resultados

Os níveis de expressão de syndecans em células TFPI-expressando

HSPGs tenham sido previamente relatado para se ligar de TFPI. Na procura de potenciais candidatos de ligação de TFPI, os níveis de expressão de mRNA syndecans 1-4 foram determinados numa selecção de células que expressam o TFPI. Os níveis de expressão das syndecans variaram consideravelmente entre os três tipos de células testadas; CEACH, HCASMC, e Sum102 (Fig. 1). Os syndecans foram expressos em todas as linhas celulares, e os níveis de sindecano-3 e 4 de expressão mostraram a menor variação entre as células.

Sum102, CEACH, e células HCASMC foram analisadas quanto à expressão de ARNm de sindecano 4/1 por qRT-PCR. O método ΔΔCt foi usada para calcular a express relativa (RQ) contra a expressão endógena de controlo média entre todas as células, e o limite foi fixado em Ct = 40 (sem amplificação). Os valores médios + SD (n = 3 paralelos biológicos) são apresentados.

Efeito da sindecam derrubar sobre os níveis de superfície celular de TFPI

Para explorar se os syndecans pode ser potencial TFPI superfície celular candidatos vinculativo, foi aplicada tecnologia siRNA. Após transiente derrubar de syndecans 1-4, as células foram deixadas a ligar-se um anticorpo específico de TFPI seguido por coloração com um anticorpo secundário ligado a EPR e análise de citometria de fluxo.

n diminuição significativa nos níveis de superfície celular de TFPI foi observado para qualquer um dos tipos de células após derrube de sindecano 1, 2 ou 4 (dados não apresentados). Em contraste, sindecano-3 derrubar nas HCAECs, HCASMCs, e células Sum102 diminuiu os níveis de superfície celular de TFPI de 52 ± 9%, 23 ± 6%, e 39 ± 12% (média ± SD), respectivamente (Fig. 2). Derrubar a eficiência dos syndecans em células siRNA transfectadas foram confirmados por qRT-PCR e calculadas como uma percentagem derrubar comparação com células de controlo transfectadas com siRNA controle negativo. Os derrubar a eficiência variaram entre 69-97% para sindecam 1, 45-85% para sindecam 2, 83-95% para sindecam-3, e 44-72% para sindecam 4 (S1 Fig.). Além disso, o sindecano-3 derrubar foi confirmada por transferência de Western em todos os tipos de células (Fig. 3A), e uma de 32 ± 13% (média ± DP) redução em-3 sindecam níveis de antigénio na superfície da célula depois de sindecano 3-batida baixo foi demonstrada por citometria de fluxo em CEACH (Fig. 3B).

células derrubado por sindecano-3 por tecnologia de siRNA foram analisadas para os níveis de TFPI da superfície celular por citometria de fluxo. O histograma apresenta a intensidade média de fluorescência obtida após TFPI rotulagem de anticorpos específicos em A) células Sum102, B) e as células CEACH células HCASMC C). Sindecam-3 derrubado células (siSDC3); linha a tracejado, ARNsi de controlo negativo; linha sólida preta e controle irrelevante; linha sólida cinza. Uma experiência representativa de três experiências individuais (n≥6 paralelos biológicos) é mostrado para cada tipo de célula.

A)-3 sindecam níveis de antígeno (a forma monomérica de 55 kDa) em lisados ​​celulares de HCAECs Sum102 células, e HCASMCs por transferência de Western utilizando anti-sindecano-3 e carregamento de controlo (actina). Uma membrana representativo de dois é mostrado. Sindecano-3 intensidades das bandas de proteína (após normalização contra controlo de carga) em relação às células de controlo são indicadas para cada tipo de célula. Recombinante sindecano-3 (rSDC3) serviu como um controlo positivo (~ 110 kDa). B) da superfície celular associado níveis sindecano-3 analisadas por citometria de fluxo em células CEACH. O histograma apresenta a intensidade de fluorescência média obtida após marcação com anticorpos específicos sindecano-3. Sindecam-3 derrubado células (siSDC3); sombreada cinza escuro, siRNA controle negativo; cinza médio sombreada e controle irrelevante; cinza claro com sombra. Uma experiência representativa de duas experiências individuais (n = 4) paralelos biológicos é mostrado.

Nem heparanase (S2 Fig.) Nem heparinase I + III (dados não mostrados) tratamento de Sum102, CEACH e HCASMC células mudou os níveis de antígeno TFPI em sobrenadantes de células em comparação com células de controlo.

Efeito da TFPI derrubar na expressão de mRNA-3 sindecam

Derrube de sindecam-3 não afetou o mRNA TFPI expressão (Fig. 4A) ou os níveis de proteína de TFPI (Fig. 4B). No entanto, experimentos foram conduzidos para avaliar se um mecanismo regulador unidirecional existiu. A expressão de ARNm de sindecano-3 foi reduzido de uma média de 30% em três grupos separados de células Sum102, em que ambas as isoformas de TFPI foram eliminados de forma estável para baixo (a TFPI derrubar eficiências eram de 40-60%, tal como descrito em Stavik

et al

. 2011 [6]). Não houve diferenças nos níveis de expressão de mRNA sindecam-3 foram detectadas quando somente a isoforma TFPIβ foi derrubado (Fig. 5) (a TFPIβ derrubar as eficiências foram de 53% e 64% para shRNA7b e shRNA 9b, respectivamente). Em células CEACH e HCASMC, foi detectada uma redução de 48% e 43% da expressão de mRNA-3 sindecam em células com 88-94% transitória TFPI (α + β) knock down (48 horas). Além disso, derrubar da isoforma TFPIα sozinho (TFPIβ expressão permaneceram inalterados) em células Sum102 (72 horas) e HCAECs (48 horas) resultou numa respectiva redução de 34% e 53% de sindecano 3-expressão do mRNA. O TFPI derrubar a eficiência de todos os tipos de células utilizadas são mostradas na S3 Fig.

A) CEACH, Sum102 e células HCASMC com sindecam-3 derrubado foram analisadas para a expressão do mRNA TFPI por qRT-PCR. O método ΔΔCt foi usada para calcular a expressão de TFPI relativa (RQ) em comparação com células de controlo (neg. ARNsi de controlo). Os valores médios ± DP (paralelos n≥6 biológicos) de três experiências individuais são apresentados. B) os níveis de antigénio de TFPI foram medidos por ELISA em lisados ​​celulares de CEACH, Sum102 HCASMC e depois sindecano-3 knock down. TFPI níveis de antigénio, relativamente às células de controlo são mostrados. Os valores médios + SD (paralelos n≥6 biológicos) de dois experimentos individuais são apresentados.

Sindecana-3 mRNA expressão foi medida por qRT-PCR em três clones estáveis ​​independentes com ambas as isoformas de TFPI (a + p) derrubado (shRNA 4, 6 e 7) e dois clones estáveis ​​independentes com somente a isoforma TFPIβ derrubado (shRNA7β e 9β). Os resultados foram normalizados contra o controle endógeno e expressões relativas (RQ) foram calculados em referência para as células de controle de vetores vazios (pSiRPG). Os valores médios + SD (n = 3 paralelos biológicos) são apresentados.

TFPI e sindecam 3-co-localização

Para investigar mais se a reduzida ligação do TFPI superfície celular foi devido a uma efeito direto da sindecam-3 derrubar, examinamos se TFPIα e sindecam-3 colocalized na superfície da célula. Co-localização foi confirmada utilizando a coloração dupla e microscopia confocal em Sum102, CEACH, e as células HCASMC. A co-localização não foi uniformemente distribuída, em vez concentrada para locais confinados da membrana celular (Fig. 6, S4 Fig., E S5 Fig.).

As células fixadas foram duplamente coradas com TFPI (verde) e syndecan- 3 (vermelho) anticorpos primários e anticorpos secundários Alexa Fluor com 488 e 633 comprimentos de onda de excitação nm, respectivamente, antes de as imagens foram capturadas usando microscopia confocal. cor amarela nas imagens de sobreposição demonstrar sobreposição espacial entre TFPI e sindecam-3. Sum102 células (em cima), células CEACH (meio) e células HCASMC (fundo). Barra de escala 50 uM (30 uM para imagens ampliadas). Uma experiência representativa de três experiências individuais é mostrado para cada tipo de célula.

Identificação de um TFPI-sindecam-3 proteína complexa

Embora a imagem confocal sugeriu que TFPIα e sindecam-3 residiam no mesmo local físico (Fig. 6, S4 Fig., e S5 Fig.), seguido de PAGE nativa subsequente Western blotting foi realizado para testar a interacção entre as duas moléculas (Fig. 7a). Em lisados ​​de proteína de Sum102, CEACH, e células HCASMC, dois complexos de proteína migrando a aparentes massas de ~ 150 kDa e ~ 180 kDa foram reconhecidos por ambos os anti-TFPIα e anti-sindecano-3 (Fig. 7A). Os dois complexos mais provável resultar em diferentes modificações pós-traducionais tais como a glicosilação. bandas mais fracas foram observadas para as células CEACH, refletindo as concentrações de proteína inferiores aplicadas. Os relativamente grandes tamanhos dos complexos observados indicaram que TFPIα (Fig. 7B, 45 kDa) estava presente com a forma dimerizada de sindecano-3, que tem um tamanho aproximado de 110 kDa (Fig. 7C). As estimativas do tamanho deve, no entanto, ser interpretado com alguma precaução, uma vez não redutores foram usadas condições (nativa) e também porque a separação exacta dos complexos de elevado peso molecular por electroforese em geral, é um desafio.

lisados ​​de proteína foram isolados a partir de células, submetidos a análise de PAGE nativa ou experiências de imunoprecipitação e analisada por Western blotting. A) PAGE nativa de lisados ​​de células Sum102 (20 ug), HCAECs (12 ug) e HCASMCs (18 ug) imunomarcados com anti-TFPIα (em cima) e anti-syndecan-3 (em baixo) (uma membrana representativa de entre três é mostrado), B) SDS-PAGE da proteína de comprimento total recombinante TFPIα imunotransferidas com anticorpo anti-TFPIα, e C) de SDS-PAGE do lisado 3 sindecano-293T de controlo coradas imunologicamente com anti-sindecano-3. D) CEACH (40 ug), E) SUM102 (160 ug) e F) HCASMC (40 ug) lisados ​​foram sujeitos a imunoprecipitação utilizando dois anticorpos diferentes sindecano-3 (n = 2 por SC-30883, n = 1 para SC- 9495) ou controlo de IgG de cabra (n = 2). Os lisados ​​foram imunoprecipitados e analisados ​​quanto à presença de sindecano-3 endógena e TFPI por imunotransferência. A proteína recombinante TFPIα (painel superior esquerdo) e lisado de célula (painel inferior esquerdo) foi utilizado como controlo positivo para a imunotransferência em D-F.

A interacção de TFPI-sindecano-3 foi também analisada por imunoprecipitação. A imunoprecipitação de sindecano-3 a partir de CEACH lisado usando dois diferentes anticorpos sindecano-3 reveladas co-precipitação de TFPI (Fig. 7D), que sugerem que TFPI associada com sindecano-3. Consistente com a análise de PAGE nativa (Fig. 7A), o complexo TFPI-sindecano-3 estava também presente em SUM102 (Fig. 7E) e HCASMC lisado (Fig. 7F), embora a precipitação de TFPI apareceu ligeiramente mais fraca.

distribuição TFPI seguinte sindecam-3 derrubar

a fim de estabelecer o destino de TFPI em células deficientes sindecam-3, o antígeno TFPI foi medido por ELISA no sobrenadante de Sum102 e células CEACH após derrubar de sindecam -3. Isto resultou em um aumento de 20-30% dos níveis de antigénio de TFPI no sobrenadante em comparação com células de controlo (Fig. 8).

os níveis de antigénio de TFPI (totais) foram medidas por ELISA em sobrenadantes de Sum102 (esquerda) e CEACH (à direita) após sindecam-3 derrubar. Relativos níveis de antigénio de TFPI em comparação com células de controlo são mostrados. Os valores médios + SD (paralelos biológicos n≥9) de dois (CEACH) e três (Sum102) experiências individuais são apresentados.

actividade TF-FVIIa na superfície da sindecam-3 derrubar células

para explorar se o TFPI ligado ao sindecano-3 pode prender actividade coagulante de TF, medimos a actividade de TF-FVIIa na superfície de células e Sum102 CEACH antes e depois de transitórios derrubar de sindecano-3. a actividade de TF-FVIIa foi determinada indirectamente por quantificação do FXa gerado num ensaio colorimétrico, onde o FVIIa e FX foram adicionados exogenamente às células aderentes. Nenhuma alteração na geração de FXa após sindecano-3 derrubar foram observados em qualquer um dos dois tipos de células (Fig. 9). Como esperado, observou-se um aumento de ~ 2 vezes na actividade de TF-FVIIa por adição de anti-TFPI para o ensaio (controlo positivo).

e Sum102 CEACH células derrubados de sindecano-3 (siSDC3) eram analisada para a actividade de superfície de células TF-FVIIa, indirectamente, como a geração de FXa. CEACH células foram estimuladas com 10 nM de PMA durante 6 horas antes da análise. Anti-TFPI foi adicionado a um experimento com células CEACH. Os valores médios + SD (paralelos n≥8 biológicas) de três experimentos individuais são apresentados.

Discussão

No presente estudo, nós demonstramos uma associação de endogenamente expressa TFPI ao transmembranar sindecano-3 molécula HSPG. A nossa abordagem foi a de derrubar a expressão de HSPGs pertencentes à família sindecano, e para analisar os níveis de TFPI antigénio de superfície, por citometria de fluxo. Foram selecionados endothelial-, músculo-liso, e as células de câncer de mama com elevada expressão TFPI endógena para a investigação. Os níveis de expressão de sindecano variou entre estes tipos de células de acordo com o facto de a expressão HSPG difere em uma célula de tipo e modo específico do desenvolvimento [13, 24]. Reduzidos níveis de superfície celular de TFPI foi detectada por citometria de fluxo após sindecano-3 derrubar em todos os três tipos de células, indicando o envolvimento de sindecano-3 na superfície celular associação de TFPI. Além disso, a diminuição da expressão sindecam-3 mRNA em HCAECs e células Sum102 com TFPIα derrubado, e no Soma 102 células com ambas as isoformas de TFPI (α + β) derrubado, mas não TFPIβ sozinho, suporta ainda uma relação entre sindecam-3 e TFPI, especificamente a isoforma TFPIα. Se esta é uma regulação directa ou indirecta continua por ser elucidado.

Anteriormente, sindecano 4 purificadas a partir de células EA.hy926 foi mostrada para ligar de TFPI num ensaio de fase sólida [19]. Para o melhor de nosso conhecimento, vimos fornecer o primeiro relatório relativo à associação TFPI a uma molécula sindecam na superfície da célula.