Abstract

Fundo

DNA circulante livre de células (cfDNA) no plasma tem mostrado potencial como biomarcador em vários tipos de câncer e pode se tornar uma fonte de importância para a detecção de mutações tumor. Os objetivos do nosso estudo foram estabelecer uma faixa normal de cfDNA em uma coorte de indivíduos saudáveis ​​e comparar isso com quatro coortes de pacientes câncer colorretal metastático (CCRm). Nós também investigou o valor prognóstico da cfDNA e analisou o tumor específico

KRAS

mutações no plasma.

Métodos

O estudo foi uma avaliação biomarcador prospectivo em quatro Fase consecutivo II de ensaios, incluindo 229 pacientes com quimioterapia refratária mCRC e 100 indivíduos saudáveis. O plasma foi obtido a partir de um EDTA-sangue amostra, eo número total de alelos de DNA e

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alelos mutados foram avaliados através de um in-house ARMS-qPCR como descrito anteriormente.

Resultados

níveis Median cfDNA foram maiores no mCRC em relação aos controles (p 0,0001). análise ROC revelou uma AUC de 0,9486 (p 0,00001). Os dados mostraram OS prejudicada com níveis crescentes de cfDNA base tanto ao categorizar pacientes por quartis de cfDNA e em grupos de baixa ou alta cfDNA com base na escala normal superior do grupo de controle (mediana OS 10.2 (8,3-11,7) e 5,2 (4,6-5,9 ) meses, respectivamente, HR 1,78, p = 0,0006). A análise multivariada confirmou um valor prognóstico independente de cfDNA (HR 1,5 (IC 95% 1,3-1,7) para cada aumento no quartil cfDNA). A concordância geral de

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mutações no plasma e tecido foi alta (85%).

Conclusões

Estes dados confirmam o valor prognóstico da medição cfDNA no plasma e utilidade para detecção da mutação com o método apresentado

Citation:. Spindler KLG, Pallisgaard N, Andersen RF, Brandslund I, Jakobsen a (2015) circulação DNA livre como biomarcadores e Fonte de detecção de mutações no câncer colorretal metastático. PLoS ONE 10 (4): e0108247. doi: 10.1371 /journal.pone.0108247

Editor do Academic: Libing Song, Sun Yat-sen University Cancer Center, CHINA

Recebido: 20 de julho de 2013; Aceito: 27 de agosto de 2014; Publicação: 13 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 Spindler et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento: Este estudo foi financiado pela Counsil Vejle Hospital Investigação e Tryg Fonden. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, desicion de publicar ou preparação do manuscrito

Competir interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer colorretal

metastático (mCRC) tem um prognóstico pobre e apesar das melhorias recentes resistência à terapia ainda é um grande desafio. A busca por melhores critérios de selecção para a terapia, juntamente com novos regimes de tratamento potencialmente eficazes para a doença de quimioterapia resistente chamou muita atenção durante a última década. Estes incluem o desenvolvimento de novos agentes, a identificação de alterações genéticas responsáveis ​​pela resistência e busca de biomarcadores para orientação durante a terapia.

A presença de DNA circulante livre de células (cfDNA) no sangue foi relatado mais de 60 anos atrás [1]. É activamente libertado a partir de células normais e falecidos, e apoptosing necrotizante processos, assim como de interacções complexas entre as células não tumorais adjacentes [2-5] e do tumor. ADN isento de células pode ser detectado no soro, plasma e outros fluidos corporais, [6], mas os mecanismos de libertação para a corrente sanguínea e a origem do DNA estão longe de ser completamente compreendida. Esclarecimentos adicionais é necessário para fazer uma distinção fiável entre os aumentos malignas e variações não-cancerosas no cfDNA.

Estudos têm sugerido que o nível de cfDNA é aumentada em ambos os pacientes com câncer [7-8] e em vários não- condições patológicas malignos em comparação com indivíduos saudáveis. No entanto, uma recente meta-análise demonstrou resultados inconsistentes [9]. O estabelecimento de um intervalo normal é, portanto, um pré-requisito para uma investigação mais aprofundada sobre o papel potencial dos cfDNA como marcador de diagnóstico, bem como da sua utilidade na detecção precoce de recidivas.

DNA livre de celular também tem sido considerado um potencial marcador de prognóstico para o resultado em vários tipos de câncer [10]. Recentemente, relatou que cfDNA realizada valor prognóstico em pacientes com mCRC [11-13]. Um elevado número de alelos cfDNA no plasma consistentemente correlacionado com uma sobrevida global pobres (OS) em nossos pacientes tratados com quimioterapia para thirdline mCRC, enquanto os pacientes com uma baixa concentração plasmática de cfDNA tinha um sistema operacional mais mediano. Verificação desses resultados em coortes maiores é altamente relevante para estabelecer o potencial clínico de cfDNA.

Além de seu potencial como uma ferramenta de diagnóstico e marcador de prognóstico, cfDNA é também uma fonte valiosa para a detecção de mutações específicas do tumor em a circulação periférica de pacientes com câncer [14-16]. Em CCRm, existe uma elevada frequência de

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mutações, que são responsáveis ​​pela resistência aos anticorpos monoclonais amplamente usados ​​segmentação do EGFR [17]. A análise molecular de alterações genômicas são normalmente realizados em tecido tumoral de arquivo, mas tem havido a preocupação de que esta abordagem não reflecte suficientemente a biologia da doença no momento do início da terapia EGFR-alvo, que é muitas vezes vários anos a partir do diagnóstico primário e /ou cirurgia. Além disso, as biópsias repetidas não são viáveis, por razões práticas e éticas. Assim, o uso de cfDNA para detectar essas mutações específicas do tumor pode ser uma adição atrativa para uma melhor seleção de pacientes para terapias específicas no futuro.

Os métodos utilizados para quantificação do DNA têm variado ao longo do tempo, que vão desde simples qPCR métodos para tecnologias radiante complexos e próxima geração seqüenciamento profunda [18,5]. A sensibilidade e especificidade da análise melhoraram muitas dobras uma vez que os estudos iniciais, mas a utilização de diferentes materiais de amostragem e métodos para a quantificação cfDNA, em adição aos relatos incompatíveis, complicaram uma comparação válida entre os resultados de diferentes estudos. Recentes avanços em métodos tecnológicos permitiram-nos desenvolver um método qPCR altamente sensível para quantificar cfDNA em amostras de plasma, que também é viável em laboratório. Isto permitiu-nos para investigar o potencial biomarcador de cfDNA em uma grande coorte de pacientes com câncer e controles saudáveis.

Os objectivos do presente estudo foram estabelecer uma faixa normal de cfDNA em uma coorte de indivíduos saudáveis ​​e comparar esta gama cfDNA com os de quatro coortes diferentes de pacientes tratados de mCRC. Além disso, teve por objetivo validar o valor prognóstico dos níveis de pré-tratamento de cfDNA e analisar o tumor específico

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mutações no plasma.

Materiais e Métodos

desenho do estudo

Um total de 100 indivíduos saudáveis ​​e 229 pacientes com CCRm foram investigados. O estudo foi realizado como uma investigação biomarcador prospectivo em quatro estudos de Fase II e biomarcadores consecutivos: o estudo Cetuximab [11,20], o TIRASMUS (identificador ClinicalTrials.gov; NCT00827684, [12], PG (identificador ClinicalTrials.gov; NCT01109615 [ ,,,0],13] e GemCap (identificador ClinicalTrials.gov; NCT01472770, [32] ensaios realizados no Departamento de Oncologia, Vejle Hospital, na Dinamarca, a partir de abril de 2005 a novembro de 2012. Todos os quatro estudos de fase II incluiu pacientes com doença refratária quimioterapia e coleta de biomarcador foi prospectivamente conduzida.

o endpoint primário foi de correlação de cfDNA para o oS, a sobrevivência livre de progressão secundária (PFS) e avaliação da diferença entre controles saudáveis ​​e pacientes com CCRm, além da correlação entre tumor KRAS (tKRAS) e . plasma KRAS detecção (pKRAS) os dados são apresentados de acordo com as orientações OBSERVA

os pacientes

os critérios de inclusão nos ensaios foram semelhantes:. histopatologia verificou estágio IV mCRC, falha de tratamento após a exposição ao flouropyrimidine, oxaliplatina e irinotecano, indicação de tratamento terceira ou quarta linha, o estado de desempenho ECOG (PS) 0 a 2, e a função de órgão adequada.

KRAS Comprar e

BRAF

estatuto determinou a inclusão nos ensaios TIRASMUS e PG, mas não nos estudos do cetuximab ou GemCap.

RECIST versão 1.1 e NCI-CTCAE versão 4.0 foram usado para examinar os pontos finais nos estudos GemCap e PG, enquanto que nos ensaios anteriores, RECIST versão 1.0 e NCI-CTCAE versão 3.0 foram utilizados.

Todos os pacientes forneceram consentimento informado assinado antes da entrada no estudo e na regulamentação relevante e ética comités (Agência de Medicamentos dinamarquesa e ao Comité de Ética Regional Científico da Southern Denmark) aprovou os estudos antes do início. Os ensaios clínicos foram conduzidos de acordo com as directrizes de boas práticas clínicas como de emissão da Conferência Internacional sobre Harmonização e da Declaração de Helsínquia.

Tratamento

O Estudo Cetuximab.

tratamento composto irinotecano (350 mg /m

2) de três em três semanas, com semanal de 250 mg /m

2 de cetuximab (dose inicial foi de 400 mg /m

2), até à progressão ou toxicidade inaceitável. avaliação da resposta foi realizada a cada três ciclos de tratamento.

TIRASMUS.

Os pacientes receberam tratamento com o temsirolimus inibidor de mTOR 25 mg a cada semana até progressão. Posteriormente, os doentes foram tratados com a terapia de combinação compreendendo quinzenal irinotecano (180 mg /m

2) e temsirolimus semanalmente até progressão ou toxicidade inaceitável. avaliação da resposta foi realizada a cada 6 semanas.

PG.

Os pacientes receberam pemetrexed (inicialmente 500 mg /m

2 q3w) + gemcitabina (1250 mg /m

2, dias 1 e 8), até à progressão ou toxicidade inaceitável. avaliação da resposta foi realizada a cada três ciclos de tratamento.

GemCap.

Os pacientes receberam capecitabina (2000 mg /m

2, dia 07/01, q2w) combinado com gemcitabina (1000 mg /m

2, dia 1) até progressão ou toxicidade inaceitável, ea resposta foi avaliada a cada 12 semanas.

grupo de controle saudável

a coorte indivíduo saudável foi selecionado a partir do Diabetes Biobank Vejle (aprovado pela Agência de Protecção de dados Dinamarquês (revista não. 2006-53-1385) e do Comité Científico da Dinamarca (ID de projeto S-20080097)).

os indivíduos foram selecionados com base em faixas etárias, e The Danish National paciente Register foi acessado por códigos CID-10 para garantir uma falta de co-morbidade significativa (CID-10 C, D, M códigos I e). O consentimento informado foi obtido de cada indivíduo para o uso de amostras de sangue, bem como o estudo aprovado pelo Comitê de Ética Regional Científico da Southern Denmark para esta análise marcador adicional.

Amostra de estudos de investigação de translação

recolha de amostras de tecidos e sangue do tumor primário para investigação translacional é um procedimento padrão em ensaios realizados no nosso departamento. Após consentimento informado, amostras de sangue de pré-tratamento foram tiradas antes do primeiro ciclo de tratamento. Os métodos para a quantificação de cfDNA e mutado

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alelos no plasma foram previamente descritos [11], e informações de primers e sondas estão disponíveis online. O plasma foi obtido a partir de amostras de sangue recolhidos em EDTA-tubos e centrifugada a 2000

g

durante 10 min a 2 horas após a recolha, antes de ser armazenado a -80 ° C até à sua utilização. Todas as amostras foram analisadas, cego para os pontos finais do estudo.

purificação de DNA

O DNA foi purificado a partir de 1 ml de plasma, utilizando um vírus QIAsymphony /bactérias midi-kit em um robô QIAsymphony (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. O ADN foi eluído em 110 ul. tampão AVE que foi fornecido com o kit.

livre de DNA Cell quantificação

Para determinar o nível de cfDNA, o montante do gene peptidilprolil isomerase A (ciclofilina A) (gene gCYC, HUGO abreviatura PPIA) foi medida por um ensaio de qPCR em casa, tal como descrito em [11]. Os ensaios foram executados em triplicado ou dublicates e 5 ul de ADN foi utilizado em cada reacção de 25 ul de PCR. Para cada PCR, um pool de ADN genómico foi incluída como controlo positivo e água como controlo negativo. O CV de ensaio gCYC com base na associação de controlo positivo foi determinado como sendo 19%. controles de água foram sempre negativos.

Primers e sondas para a in-house gCYC foram projetados usando o software OLIGO 7 (Biologia Molecular Insights Inc, Cascade, CO) (disponível on-line, a adesão sequência numérica NG_029697.1). O iniciador directo está localizado no intron 1-2, a sonda no exão 2 e o iniciador inverso no intron 2-3 (Forward ACATGGGTACTAAGCAACAAAATAAG, CACAATTGGAACATCTTTGTTAAAC reversa, Probe Fam-TTGCAGACAAGGTCCCAAAGACAGCA-Tamra). pesquisa BLAST foi realizado e não há alvos inespecíficos foram previstos. Análise de dados qPCR foi realizado utilizando SDS Ver software. 2.2.2 e Cq valores foram determinados utilizando a definição da linha de base automático e limiar fixado em 0,2. Quantificação de cfDNA foi feito através do cálculo do número de cópias de

gCYC

alelos como 10

intercepção y (gCYC) -mean Cq (gCYC) /inclinação (gCYC) e normalizando isso para o volume plasmático.

detecção da mutação KRAS e quantificação

KRAS

análise do tecido tumoral de arquivo de FFPE foi realizada no estudo Cetuximab com o aprovado pela FDA

KRAS

kit DxS (Qiagen), como descrito anteriormente. As amostras de tumor dos ensaios TIRASMUS, PG e GemCap foram analisados ​​com um ensaio in-house validado. Os ensaios in-house são baseados na PCR Amplification Refractory Mutation System-quantitativa metodologia (ARMS-qPCR) e detecta 6 mutações no

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códon 12 (Gly12Ala, Gly12Arg, Gly12Asp, Gly12Cys, Gly12Ser e Gly12Val) e uma mutação no codão 13 (Gly13Asp). Primers e sondas para a in-house

KRAS

ensaios, bem como

KRAS

fragmentos de PCR controle mutação, foram projetados usando o software OLIGO 7 (Biologia Molecular Insights Inc, Cascade, CO) ( disponível on-line, a sequência de número de acesso NW_001838052.1). O ensaio está localizada no exão 2 do gene KRAS. A análise foi realizada como descrito acima. Uma comparação dos dois métodos para a detecção de mutações em tecido de tumor foi publicada anteriormente e mostrou concordância completa [19] e as curvas padrão estão disponíveis como material de linha [11]. A sensibilidade de detecção variou entre 0,03% -0,001%, dependendo do tipo de mutação detectada, 12asp (1/200000, 0,0005%), 12Cys (1/200000, 0,0005%), 12ser 1/7000, 0,0143%), 13asp 1 /3000, 0,0333%), 12ala (1/100000, 0,0010%), 12val (1/200000, 0,0005%), 12arg (1/200000, 0,0005%), respectivamente). Uma mistura de fragmentos de controle de mutação positiva e doador de genômica de DNA foi incluídos em cada PCR e água como controle negativo. Uma amostra de ADN genómico doador puro foi incluído para determinar a especificidade dos ensaios (dados apresentados em [11]). CV para cada ensaio de mutação KRAS e para o ensaio gCYC foi determinada com base em dados a partir de análises de PCR ao longo de um período de tempo de 20 meses e tinham entre 18% e 32%. controles de água foram sempre negativos. Quantificação de

KRAS

foi feito através do cálculo do número de cópias do mutante

KRAS

alelos como 10

intercepção y (KRAS) -mean Cq (KRAS) /inclinação (KRAS) e normalizando isso para o volume plasmático.

a análise estatística

a comparação descritiva dos níveis cfDNA foi realizada com t-teste bilateral e Wilcoxon rank sum. O limite superior do normal, tal como definido pela média + 2DP no grupo de controlo, foi utilizada para o valor de cut-off exploratória para análise de sobrevivência. O método de Kaplan-Meier foi aplicado para estimar PFS e OS. A análise de regressão multivariada de Cox foi realizada para examinar se as diferentes variáveis ​​foram associados com a sobrevivência reduzida, incluindo níveis cfDNA e testes para características de base (idade, sexo e PS), com potencialmente influentes (conhecidos fatores prognósticos ou parâmetros significativos ou limítrofe por exemplo, P 0,02 ) sobre a sobrevivência. A análise da curva de operação do receptor (ROC) foi empregado para descrever o desempenho de cfDNA e pKRAS. P-valores referidos testes bicaudais e foram considerados significativos quando p ≤ 0,05. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software estatístico NCSS 2007 v.07.1.5 (NCSS Statistical Software, Utah 84037, EUA, www.ncss.com).

Resultados

As características dos pacientes

doença e tratamento prévio as características dos pacientes são apresentados na Tabela 1. a idade média no grupo total de pacientes foi de 63 anos (variação 35-82) ea maioria era do sexo masculino, principalmente na boa performance status. Não houve diferenças significativas na idade, sexo ou condição de desempenho entre os 5 grupos.

A coorte indivíduo saudável incluiu 10 homens e 10 mulheres com idade entre 25-44 anos, 20 homens e 20 mulheres com idades entre 45- 59 e 60-75.

A maioria dos pacientes incluídos nos ensaios tiveram amostras de sangue disponíveis. Assim, um total de 229 pacientes foram incluídos a partir dos quatro ensaios, e 223 tinham tecido de tumor disponível e 211 uma linha de base de amostra de plasma correspondentes. Os resultados ausentes foram devido a DNA tumor de má qualidade ou devido a quantidade insuficiente de plasma nas amostras.

DNA e de pré-tratamento características livres de células

Os níveis medianos cfDNA nas coortes individuais são apresentados na Tabela 1. Os níveis de ADN isentos de células foram analisados ​​por correlação com a doença e características de pré-tratamento. Não houve diferenças significativas nos níveis de cfDNA mediana de acordo com a idade ou sexo, mas as concentrações cfDNA significativamente maiores com o aumento do PS (Tabela 1).

DNA livre de celular em pacientes com câncer em comparação com indivíduos saudáveis ​​

a média e a concentração mediana de cfDNA no grupo de controlo foram 2800 e 2400 alelos por ml de plasma, respectivamente, dentro de uma gama de 800 a 14000 alelos por ml de plasma. O nível médio de cfDNA em toda a coorte de pacientes com câncer foi 17900 alelos por ml de plasma (intervalo 800-4618400). Figura 1A ilustra as diferenças em concentrações cfDNA no plasma de controlos saudáveis ​​e as amostras de linha de base a partir de diferentes coortes de doentes com cancro. Os dados são apresentados como um gráfico de caixa de valores numa escala logarítmica, e os níveis em doentes com cancro foram marcadamente maiores do que no grupo de controlo saudável. Os níveis de cfDNA foram semelhantes entre os grupos de pacientes com câncer. As diferenças de cfDNA foram altamente significativas entre o grupo controle e todos os grupos individuais de pacientes com câncer (todos os valores p foram 0,0001). O poder de discriminar entre indivíduos saudáveis ​​e em doentes com cancro foi testada através da estimativa do ROC e área sob a curva (AUC), como demonstrado na Figura 1B. A AUC foi 0,9486 (IC95% 0,9182-0,9679, p 0,00001).

A mostra Box-Whisker com 25%, 50%, 75% percentis, valores e valores extremos adjacentes superior e inferior (pontos) . Horizontalmente o grupo quatro coortes de ensaios clínicos e de controlo, na vertical a concentração cfDNA em uma escala logarítmica. estudo cetuximab C, GemCap GemCap coorte, estudo de coorte PG PG, T coorte do estudo TIRASMUS, Controles grupo de controle saudável. B mostra uma curva de operação do receptor (ROC) estimar o desempenho de cfDNA para discriminar entre pacientes com câncer colorretal e controles. A AUC foi 0,9486, (IC95% 0,9182-0,9679, p 0,00001).

O valor prognóstico da cfDNA em pacientes com câncer

A análise de sobrevida de acordo com os níveis cfDNA ter são apresentados separadamente para os grupos de câncer individuais com os resultados do estudo primários [11-13]. A análise conjunta de todos os pacientes confirmaram a sobrevida global mais curto com o aumento dos níveis de linha de base cfDNA. Fig 2A ilustra as curvas de Kaplan-Meier da OS em pacientes divididos em quatro grupos de acordo com quartis de níveis cfDNA. O sistema operativo dos pacientes classificados em grupos de baixas ou altas concentrações cfDNA com base na gama normal superior do grupo de controlo (definido como média + 2DP = cfDNA 7100 alelos por ml) é mostrado na Figura 2B. regressão de Cox análise multivariada incluindo idade ( / 63 anos), sexo, PS e cfDNA quartis (tratado como uma variável contínua) confirmou um valor prognóstico independente de cfDNA em toda a coorte. Tal como uma variável continua, houve um Rácio OS perigo de 1,5 (IC 95% 1,3-1,7) para cada aumento do nível cfDNA quartil (Tabela 2).

. Os pacientes são agrupados por quartis de cfDNA (da direita) menor segundo mais baixo segundo mais alto e mais alto quartil de cfDNA,,. O OS mediana de acordo com quartis cfDNA foram; 10,2 meses (95% CI 8.9-12.8), 7,8 meses (5.7-9.3), 5,0 meses (4.3-6.0) 3,5 meses (3.0-3.9), respectivamente. B. Os pacientes são agrupados por faixa normal superior, tal como definido pela média cfDNA + 2 DP no grupo controle (7100 alelos por ml.) Grupo de Risco baixo (linha completa), OS mediana, 10,2 meses (8.3-11.7). grupo de alto risco (linha pontilhada) Median OS, 5,2 meses (4,6-5,9). HR 1,78, p = 0,0006.

A detecção de mutações KRAS em amostras de tumores e de plasma

Um total de 211 pacientes tiveram ambas as amostras tumorais e plasma disponíveis para a detecção confiável de

KRAS

mutações. As amostras de plasma com um baixo número de alelos cfDNA não foram excluídos da análise. específicos do tumor

KRAS

mutações foram detectadas em um total de 119 amostras de plasma. A concordância geral entre o estado de mutação no tumor e no plasma foi alta: (180/211 = 85%) e 112 das amostras tumorais 140 com mutações demonstraram

KRAS

mutações em amostras de plasma também, enquanto apenas três casos foram observadas, onde os doentes tinham uma mutação detectável no plasma, mas não no tumor primário.

ADN isento de células e correlação com mutações específicas do tumor KRAS

a correlação entre o número de total de células alelos de DNA livres e o número de alelos KRAS mutado em pacientes KRAS mutante foi analisada por classificação correlação de Spearman. Devido à vasta gama de níveis quantitativos foi usada uma escala logarítmica. Tal como mostrado na Fig 3, que apresenta o ADN isento de células na vertical e o número de alelos mutados KRAS horizontalmente estes foram fortemente correlacionada Figura 3 (R

2 = 0,97, de Spearman = 0,86, p 0,000). Isto confirma os dados preliminares do estudo cetuximab [11), e indica que uma fracção significativa da origem cfDNA a partir de ADN de tumor (tal como representada pelo ADN com as mutações específicas de tumor KRAS)

Este lote ilustra a correlação forte entre o número total de alelos de ADN e o número de alelos mutados nos pacientes com mutações KRAS detectados. O ranking de correlação de Spearman foi calculado para 0,86 e r

2 = 0,97 (

p Art 0,0000). Os diferentes símbolos representam os grupos individuais de pacientes com câncer. (Praça PG correlação = 0,9, correlação círculo cetuximab = 0,88, triângulo GemCap correlação = 86, pentágono TIRASMUS correlação = 0,67).

Discussão

Aumento do foco na investigação de translação e recente tecnológico avanços deram uma nova visão sobre a importância clínica da cfDNA no câncer e seu potencial para a detecção de mutações específicas do tumor na circulação periférica.

Como uma medida da quantidade total de cfDNA, este estudo investigou o número de alelos o gene da ciclofilina, e confirmou um nível mais elevado em pacientes com CCRm que nos controles saudáveis. A busca por estudos semelhantes revela resultados inconsistentes; No entanto, as diferenças de metodologias experimentais dificulta comparações directas. Em geral, existem variações no método aplicado para a purificação de DNA, o gene de referência de medição e as coortes de indivíduos investigados. No entanto, alguns estudos em pacientes com CCR têm suporte para os nossos dados [21-24]. Um estudo muito recente explorou o utilitário multiuso de circulação de DNA no plasma em pacientes com cancros avançados usando uma abordagem metodológica diferente, mostrando níveis geralmente mais altos de cfDNA em CRC, mama, próstata e outros tipos de câncer do que nos controles saudáveis ​​[8]. No entanto, o tamanho da amostra do estudo não permitir o estabelecimento de uma gama normal (n = 20), mas seus resultados suportam os dados atuais. Uma observação recente no cancro rectal localmente avançado, apesar do uso de um método diferente para medir cfDNA, também revelou uma diferença significativa nos níveis cfDNA entre controles e câncer retal fase inicial [25]. A capacidade de discriminar níveis cfDNA entre os nossos pacientes com câncer colorretal e controles saudáveis ​​foi excelente, apoiando a necessidade de mais estudos de cfDNA em estágios tumorais anteriores e lesões pré-cancerosas. Além disso, a variação de indivíduos cfDNAin com co-morbidade não-cancerosas precisa ser mais bem investigado, para ter em conta o potencial viés. O presente estudo também sublinha o papel biológico importante de cfDNA nesta doença. A concentração elevada de cfDNA em doentes com cancro e correlação com um número de alelos mutantes também indicam que a cfDNA é em grande parte derivado do tumor, embora a origem ainda permanece indefinida.

Há uma necessidade de ferramentas adicionais para uma melhor selecção de pacientes para terapia em CCRm fortemente pré-tratada. Em quatro consecutivamente conduzidos estudos clínicos de fase II que confirmaram um nível uniforme de cfDNA e valor prognóstico clara.

Um recém-publicado estudo do nosso grupo ilustrou que o cfDNA não é meramente uma medida da carga tumoral [ ,,,0],26]. Em vez disso, sugerimos que total de cfDNA é mais provável para refletir mecanismos tanto a carga tumoral e biológicos e é, portanto, um quadro mais complexo da doença em um determinado estágio. A semelhança entre os níveis basais entre os quatro estudos de fase II que observamos ilustra a homogeneidade das coortes dos pacientes. Os pacientes foram todos selecionados com base no estado refratário verdadeira quimioterapia, em vez de linhas de terapia, que pode variar de acordo com as definições e estratégias de tratamento anteriores, e é, portanto, uma definição menos precisa do estágio avançado da doença. A comparação entre nossos grupos e subsequente partilha dos dados é, portanto, justificada como também apoiada pela análise multivariada. Pesquisas em pacientes virgens de quimioterapia deve ser o foco de estudos futuros.

níveis basais mais elevadas mostraram uma forte correlação com prognóstico reservado, pela primeira vez quando analisada na fase indivíduo II estudos, segundo quando avaliadas de acordo com quartis de níveis cfDNA em a coorte total de CRC, e, finalmente, quando divididos em grupos de altas e baixas de concentração com base no nível máximo cfDNA em indivíduos saudáveis. Além disso, a análise combinada permitiu uma análise multivariada de confiança, o que confirmou um forte impacto no prognóstico de cfDNA como um parâmetro contínua. O valor prognóstico da cfDNA foi descrito em vários cancros, mas apenas um pouco em relação à quimioterapia [15-16, 27]. O relatório recentemente publicado pela Perkins et al está de acordo com nossos dados e é um dos poucos estudos que investigam cfDNA em pacientes tratados por câncer avançado [8].

A terapia para CRC, sem dúvida, continuar a desenvolver no sentido de segmentação individual características moleculares da doença. No entanto, a heterogeneidade do tumor, instabilidade genômica e evolução molecular são muito exigentes clonais em uma caracterização precisa e oportuna. Executando biópsias de tumores repetidas foi feito, mas é inconveniente e comporta um risco para o paciente. Usando plasma como uma biópsia líquida para a detecção de mutações tem muitas vantagens e poderia superar os problemas associados com biópsias de tumores repetidos. testes repetidos, durante a terapia é facilmente realizado e o presente método desenvolvido para detectar

KRAS

mutações é viável, relativamente barato, rápido e pode ser realizada numa base de larga escala. No entanto, a tecnologia actual qPCR só irá permitir que um número limitado de reacções de PCR são executados por amostra. Desde

KRAS

tem um impacto clínico predominante e uma elevada frequência em mCRC esta abordagem ainda é viável, ao passo que métodos como a próxima geração de sequenciamento pode tornar-se relevante se múltiplas mutações com potencial importância clínica e destinos disponíveis são revelados. No entanto, neste momento, um método simples e viável para estas investigações parece a abordagem mais racional, especialmente considerando o fato de que amostras de tamanho adequado para investigações clínicas confiáveis ​​são de extrema importância.

A taxa de detecção de tumor-specific mutações no plasma depende da especificidade e sensibilidade do ensaio, que pode ser aumentada por passos de amplificação pré-análise, bem como sobre o montante da cfDNA na amostra. Este último pode ser superada pelo aumento do volume inicial de plasma analisadas. Estes aspectos devem ser considerados ao abordar a concordância entre tumor primário e estado de mutação plasma, que foi alta com o nosso método em comparação com os poucos estudos relevantes na literatura [28-30]. As razões para a discordância incluem a possível má qualidade do DNA extraído de tecido embebido em parafina de arquivo tumor, ou verdadeiro heterogeneidade da doença e evolução molecular clonal durante várias linhas de terapia.

É clinicamente relevante investigar se p

KRAS

pode ser usado como um critério de seleção para o tratamento inibidor EGFR, em vez de t

detecção de KRAS

. Os presentes dados e um relatório anterior semelhante [31] sugerem que p

KRAS

estatuto mantém um forte valor preditivo neste cenário. Isto também se aplica às coortes de nossos pacientes que não foram tratados com inibidores do EGFR. No entanto, os resultados de nossos estudos pequenos não randomizados devem ser interpretados com cautela e novas investigações em amostras maiores, de preferência em estudos randomizados, são garantidos. Coortes de teste e validação

Temos fornecidos com amostras de tamanho adequado para multivariada análise do valor prognóstico e para a definição de um intervalo normal de cfDNA. O presente estudo confirma a utilidade prognóstico da cfDNA no plasma e de viabilidade para o teste de mutação com o método apresentado. Fazemos um apelo para esforços combinados para comparar, validar e prospectivamente investigar o papel da cfDNA quantificação em câncer, com a perspectiva global de traduzir resultados em atendimento clínico de pacientes com doenças de câncer avançado.

Reconhecimentos

Agradecemos sinceramente o Conselho de Pesquisa, Hospital Lillebaelt, Asta og Peter Götz-Petersens Fundation, e da Fundação Novo Nordisk para o financiamento do estudo.